專利名稱：使用溶酶體酸性脂肪酶來(lái)治療患者的溶酶體酸性脂肪酶缺乏的制作方法
使用溶酶體酸性脂肪酶來(lái)治療患者的溶酶體酸性脂肪酶缺
乏
背景技術(shù)：
溶酶體酸性脂肪酶(LAL)缺乏是罕見(jiàn)的溶酶體貯積病(LSD)，其特征為由于酶的缺乏而無(wú)法降解溶酶體中的膽固醇酯(CE)和甘油三酯(TAG)。LAL缺乏與其它溶酶體貯積病的類(lèi)似之處在于底物在許多組織和細(xì)胞類(lèi)型中積聚。在LAL缺乏中，底物積聚在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞中是最明顯的，包括肝臟中的Kupffer細(xì)胞、脾臟中的組織細(xì)胞、以及小腸中的固有層。網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)巨噬細(xì)胞甘露糖/N-乙?；咸前肥荏w(也稱為巨噬細(xì)胞甘露糖受體、MMR或CD206)，所述受體介導(dǎo)結(jié)合、細(xì)胞攝取以及具有GIcNAc或甘露糖封端的N-聚糖的蛋白質(zhì)的溶酶體內(nèi)化，并且提供用于在這些關(guān)鍵細(xì)胞類(lèi)型中潛在校正酶缺乏的途徑。LAL缺乏是多系統(tǒng)疾病，其最常見(jiàn)表現(xiàn)為胃腸、肝臟以及心血管并發(fā)癥，并且造成明顯的發(fā)病率和死亡率。LAL缺乏的臨床作用是由于脂質(zhì)材料在多種組織的溶酶體中大量積聚和對(duì)膽固醇和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)機(jī)制的強(qiáng)烈干擾，包括肝臟膽固醇合成的實(shí)質(zhì)性增力卩。LAL缺乏呈現(xiàn)為至少兩種表型:沃爾曼氏病(Wolman Disease, WD)和膽固醇酯忙積病(CESD)。沃爾曼氏病，以首先描述它的醫(yī)生來(lái)命名，是LAL缺乏的最具有侵襲性的呈現(xiàn)。這個(gè)表型的特征為胃腸和肝臟表現(xiàn)，包括生長(zhǎng)不足、吸收不良、皮脂溢、體重劇烈減輕、淋巴結(jié)病、脾腫大以及肝腫大。沃爾曼氏病通常在生命期的第I年內(nèi)快速進(jìn)行并且常常是致命的。病例報(bào)告評(píng)論表明由于在生命期的第I年內(nèi)的嚴(yán)重LAL缺乏，存活超過(guò)12個(gè)月齡對(duì)于呈現(xiàn)出生長(zhǎng)不足的患者是極 其罕見(jiàn)的。在所述最具侵襲性的形式中，生長(zhǎng)不足是主要臨床特征，并且是早期死亡率的主要原因。由肝臟增大和轉(zhuǎn)氨酶升高所證明的肝損害的情況在嬰兒中也是常見(jiàn)的。沃爾曼氏病的診斷通過(guò)身體發(fā)現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室分析來(lái)確定。嬰兒通常由于腹瀉、持續(xù)性嘔吐、喂養(yǎng)困難、發(fā)育遲緩以及發(fā)育停滯而在生命期的前兩二個(gè)月內(nèi)住院。身體發(fā)現(xiàn)包括因肝腫大和脾腫大而腹脹，并且放射檢查經(jīng)常揭示腎上腺的鈣化。實(shí)驗(yàn)室評(píng)估通常揭示血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高，和內(nèi)源性LAL酶活性不存在或者顯著降低。在一些患者中觀察到膽固醇和甘油三酯的血液水平升高?；加蠰AL缺乏的患者還可以在生命后期呈現(xiàn)出主要的肝臟和心血管損害，并且這經(jīng)常稱為膽固醇酯貯積病(CESD)。在CESD中，肝臟受到明顯的肝腫大、肝細(xì)胞壞死、轉(zhuǎn)氨酶升高、肝硬化以及肝纖維化的嚴(yán)重影響。由于CE和TAG的水平提高，因此心血管損害可以高脂血癥為特征。在一些患有CESD的受試者中已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了脂肪沉積物積聚在動(dòng)脈壁上(動(dòng)脈粥樣硬化)。這些沉積物使動(dòng)脈管腔變窄，并且可以導(dǎo)致血管堵塞，從而增加包括心肌梗塞和中風(fēng)在內(nèi)的明顯的心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。然而，并非所有患有LAL缺乏的受試者都發(fā)展出動(dòng)脈粥樣硬化。例如，沃爾曼氏病患者承受著與下列疾病有關(guān)的其它癥狀，包括:肝臟和脾臟增大、淋巴結(jié)病、以及小腸吸收障礙，但是WD通常不以動(dòng)脈粥樣硬化為特征(TheMetabolic and Molecular Bases of Inherited Disease(Scriver, C.R.,Beaudet, A.L.,Sly,ff.S.與Valle D.編著)第7版，第2卷，第2570頁(yè)McGraw-Hill，1995)。同樣，并非所有CESD患者都展現(xiàn)出動(dòng)脈粥樣硬化。參見(jiàn)Di Bisceglie等，Ifepatology 11:764-772(1990)；Ameis等，J.Lipid Res.36 =241-250(1995)。CESD的呈現(xiàn)對(duì)于一些未診斷出的患者高度可變，直到成年后期表現(xiàn)出并發(fā)癥，而其它人可以在兒童早期呈現(xiàn)出肝功能障礙。CESD與壽命縮短和明顯的不健康相關(guān)?；加蠧ESD的那些人的預(yù)期壽命取決于相關(guān)并發(fā)癥的嚴(yán)重性。沃爾曼氏病的現(xiàn)有治療選擇非常有限。將抗體施用至發(fā)熱和/或有感染跡象的嬰兒?？梢蚤_(kāi)出類(lèi)固醇替代療法用于腎上腺機(jī)能不全和專門(mén)的營(yíng)養(yǎng)支持，并且在沒(méi)有這些介入會(huì)預(yù)防死亡的證據(jù)的同時(shí)，目前也不清楚它們是否對(duì)短期存活具有影響。在用骨髓移植治療的四名患有LAL缺乏的一系列患者中，由于移植數(shù)月內(nèi)所述程序的并發(fā)癥，所有四名患者都死亡。盡管在后續(xù)病例報(bào)導(dǎo)中描述了一些成功的情況，但是死亡率保持較高，并且多名患者由于他們病情太重而無(wú)法從移植前調(diào)節(jié)性方案中存活，因此沒(méi)有被移植。極少數(shù)的報(bào)導(dǎo)的長(zhǎng)期存活者確實(shí)表明造血細(xì)胞中的酶缺乏的校正單獨(dú)就足以實(shí)質(zhì)性改善這種疾病的臨床狀況。通常通過(guò)飲食限制來(lái)提供臨床支持以嘗試限制與導(dǎo)致死亡的疾病的急性表現(xiàn)相關(guān)的不可轉(zhuǎn)運(yùn)的和不可分解代謝的脂質(zhì)的積累。CESD表型的現(xiàn)有治療選擇集中于經(jīng)由控制脂質(zhì)積聚(通過(guò)排除富含膽固醇和甘油三酯的食物的飲食)并且通過(guò)施用降膽固醇藥物(例如，斯達(dá)汀(statin)和消膽胺(cholestyramine))抑制膽固醇合成和載脂蛋白B的產(chǎn)生來(lái)對(duì)癥治療。盡管可以看到一些臨床改善，但是潛在的疾病表現(xiàn)持續(xù)存在并且仍存在疾病進(jìn)展。已經(jīng)表明，用重組LAL的酶替代療法可以是溶酶體酸性脂肪酶缺乏和相關(guān)病癥的可行治療選擇(參見(jiàn) Meyers 等.(1985) Nutrition Res.5(4):423-442 ;TO9811206 ;以及 Besley (1984)Clinical Genetics 26:195-203)。使用 LAL 缺乏的小鼠模型的一些研究已經(jīng)證實(shí)通過(guò)每3天一次輸注高劑量的(超過(guò)I毫克/公斤體重)重組人LAL，LAL缺乏(LAL+)小鼠的一些異常得以校正(例如參見(jiàn)Grabowski US 2007/0264249)。這些校正LAL缺乏小鼠內(nèi)的缺陷的早期研究表明為了校正潛在的表型，需要相對(duì)大量和高頻率劑量的重組LAL蛋白。還重要的是應(yīng)注意，不同于最初描述的LAL+大鼠模型(Yoshida和Kuriyama (1990) Laboratory Animal Science,第 40 卷，第 486-489 頁(yè)),上述研究中使用的LAL+小鼠模型并不酷似人W·D，因?yàn)長(zhǎng)AL缺乏小鼠并未展現(xiàn)出人患者中觀察到的生長(zhǎng)缺陷。迄今為止，沒(méi)有外源性LAL施用至人，并且沒(méi)有有效的療法可用于治療LAL缺乏，包括WD、CESD以及其它疾病。因此，為了改善患者的生活品質(zhì)，極端需要具有最低施用頻率的療法。另外，需要在人患者中恢復(fù)生長(zhǎng)、使肝功能正?；⒃黾覮AL組織濃度并且增加LAL活性的治療有效劑量。發(fā)明概述本發(fā)明是基于首次人臨床病例，其中患者被成功地給予外源性LAL。患有LAL缺乏的其它致命形式(沃爾曼氏病或早發(fā)性LAL缺乏)的嬰兒通過(guò)施用外源性LAL得到有效治療，并且對(duì)患有遲發(fā)性LAL缺乏的一組人患者評(píng)估了 LAL酶替代療法的安全性評(píng)價(jià)?；加性绨l(fā)性LAL缺乏的嬰兒每周以低劑量施用，而沒(méi)有引發(fā)任何不良事件或反應(yīng)。早在初始施用后I至2周就觀察到生命體征和臨床/實(shí)驗(yàn)室測(cè)量的功效的顯著改善。在每周給藥4個(gè)月之后，治療的嬰兒已經(jīng)恢復(fù)正常生長(zhǎng)并且展現(xiàn)出與LAL缺乏有關(guān)的所有癥狀(包括吸收障礙、肝腫大以及肝功能)的明顯改善。遲發(fā)性成年患者也每周給予低量的外源性LAL^S有不良事件的跡象。因此，迄今為止收集的臨床數(shù)據(jù)顯示使用本發(fā)明的外源性LAL的酶替代療法提供用于LAL缺乏的安全且有效的治療。因此，本發(fā)明提供通過(guò)施用有效量的外源性溶酶體酸性脂肪酶(LAL)來(lái)治療人患者中與LAL缺乏相關(guān)的疾病或病癥的方法。外源性LAL可以為具有N-連接型聚糖結(jié)構(gòu)的重組人LAL，所述聚糖結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)甘露糖和/或甘露糖-6-磷酸。外源性LAL被有效地內(nèi)化到例如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的溶酶體中。在一些實(shí)施方案中，患有LAL缺乏的人患者被診斷為患有沃爾曼氏病(WD)。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用足以提高WD患者的生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用足以恢復(fù)WD患者的正常生長(zhǎng)。在其它實(shí)施方案中，患有LAL缺乏的人患者被診斷為患有膽固醇酯貯積病(CESD)。根據(jù)本發(fā)明的治療方法可以提供給任何年齡的人患者。本文還提供通過(guò)將有效改善肝功能的量的重組人LAL施用至患者來(lái)治療患有LAL缺乏的人患者的方法。在一些實(shí)施方案中，施用足以使肝臟檢驗(yàn)正?；?。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用足以降低肝臟轉(zhuǎn)氨酶的血清水平。例如，肝臟轉(zhuǎn)氨酶可以包括血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和/或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用足以使肝腫大減至最小。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用足以降低患者的肝臟大小。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用足以降低血清鐵蛋白水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用足以降低血清脂質(zhì)水平，包括例如膽固醇酯(CE)和/或甘油三酯(TG)水平。還提供增加患有LAL缺乏的人患者的LAL活性的方法。所述方法包括將重組人LAL施用至患者，以便所述施用使得LAL活性增加，如可在例如淋巴細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞中所測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，描述通過(guò)每5天I次至每30天I次將有效量的外源性LAL蛋白施用至患者而治療人患者的與LAL缺乏相關(guān)的病狀的方法。在一些實(shí)施方案中，患有LAL缺乏的人患者被給予約0.1mg至約50mg外源性LAL/公斤體重。在一個(gè)實(shí)施方案中，人患者被給予約0.1mg至約IOmg的外源性LAL/公斤體重。在一個(gè)實(shí)施方案中，人患者被給予約0.1mg至約5mg的外源性LAL/公斤體重。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸注速率在約0.lmg/kg/h至約4mg/kg/h之間。在一些實(shí)施方案中，人患者用第二治療劑治療。第二治療劑可以包括例如降膽固醇藥物(例如，斯達(dá)汀或依澤替米貝(ezetimibe))、抗組胺劑(例如，苯海拉明(diphenhydramine))或免疫抑制劑。附圖簡(jiǎn)述

圖1A描繪每周接受外源性LAL(SBC-102)給藥(劑量:0.2mg/kg (初始輸注，第O周)；0.3mg/kg (第I周)；0.5mg/kg (第2周)；以及1.0mg/kg (第3-8周))的嬰兒男性沃爾曼氏病(即，早發(fā)性LAL缺乏)患者的血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平。圖1B描繪同一患者的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平?；颊咴诔跏驾斪r(shí)的年齡為4個(gè)月零I周。圖2描繪每周接受外源性LAL(SBC-102)給藥(劑量:0.2mg/kg (初始輸注，第O周)；0.3mg/kg (第I周)；0.5mg/kg (第2周);以及1.0mg/kg (第3-8周))的沃爾曼氏病患者的血清鐵蛋白水平。患者在初始輸注時(shí)的年齡為4個(gè)月零I周。示出第O周初始給藥后I周以后的血清鐵蛋白水平。 圖3描繪每周接受外源性LAL(SBC-102)給藥(劑量:0.2mg/kg (初始輸注；第O周)；0.3mg/kg (第I周)；0.5mg/kg (第2周)；以及1.0mg/kg (第3-8周))的沃爾曼氏病患者的生長(zhǎng)速度。圖4描繪沃爾曼氏病患者的生長(zhǎng)曲線(男孩的年齡標(biāo)準(zhǔn)體重(kg)百分位數(shù))。圖5描繪每周接受0.35mg/kg的劑量的外源性LAL的41歲白人男性CESD患者的血清AST水平。圖6描繪每周接受0.35mg/kg的劑量的外源性LAL的41歲白人男性CESD患者的血清ALT水平。圖7描繪每周接受0.35mg/kg的劑量的外源性LAL的41歲白人男性CESD患者的血清白蛋白水平。圖8描繪每周接受0.35mg/kg的劑量的外源性LAL的41歲白人男性CESD患者的血清鐵蛋白水平。圖9圖解了四只年齡匹配的雄性大鼠的增重速率，這四只大鼠各自被分配給下列四種外源性LAL給藥方案中的一種:每周一次Img/公斤、每周一次5mg/公斤、每2周一次5mg/公斤或安慰劑。柱 內(nèi)的數(shù)字表示出生后的天數(shù)。圖10描繪野生型對(duì)照、外源性LAL治療的LAL缺乏大鼠以及安慰劑治療的LAL缺乏大鼠的病理學(xué)和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果。宏觀病理學(xué)證實(shí)用外源性LAL治療的大鼠的肝臟的顏色和大小正?；?lái)自用外源性LAL治療的大鼠的肝臟組織的組織病理學(xué)顯示基本上正常的肝臟組織學(xué)，這與安慰劑治療的動(dòng)物中的泡沫狀巨噬細(xì)胞的大量積聚形成明顯對(duì)照。圖11描繪在使用順序掃描模式通過(guò)共聚焦熒光顯微術(shù)檢查的細(xì)胞的溶酶體中，重組人LAL(SBC-102)和溶酶體標(biāo)記物的共定位。圖12描繪使用巨噬細(xì)胞細(xì)胞系NR8383通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定評(píng)價(jià)的重組人LAL(SBC-102)與GlcNAc/甘露糖受體的結(jié)合特異性。圖13描繪重組人LAL在正常細(xì)胞和LAL-缺乏細(xì)胞中的活體外活性。圖14圖解了重組人LAL(SBC_102)治療對(duì)LAL缺乏大鼠的內(nèi)部器官質(zhì)量的作用。器官大小表示為在每周施用媒介物或5mg/kg的SBC-102持續(xù)4周之后，在LAL+大鼠和LAL+/+大鼠中在8周齡測(cè)定的體重百分率。圖15圖解了在每周給予媒介物或5mg.kg-1的SBC-102持續(xù)4周之后，野生型和LAL缺乏大鼠的體重。劑量施用在第4周開(kāi)始以菱形在X-軸上突出顯示。圖16描繪在每周給予媒介物或5mg.kg—1的SBC-102持續(xù)4周之后，在WT和LAL缺乏大鼠中在8周齡測(cè)定的肝臟膽固醇、膽固醇酯和甘油三酯的水平。圖17描繪LAL缺乏大鼠的體重增加百分率。圖18描繪在施用SBC-102持續(xù)4周之后，LAL缺乏大鼠的肝臟重量(作為體重的百分率)。圖19圖解了在施用SBC-102持續(xù)4周后，LAL缺乏大鼠中的組織膽固醇酯的水平。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于治療患有對(duì)施用外源性溶酶體酸性脂肪酶具有反應(yīng)性的疾病或病癥的人的方法。定義
為了方便起見(jiàn)，說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例以及所附權(quán)利要求書(shū)中使用的某些術(shù)語(yǔ)在本文中進(jìn)行闡述以說(shuō)明和定義用于描述本發(fā)明的各種術(shù)語(yǔ)的含義和范圍。如本文使用的“LAL”是指“溶酶體酸性脂肪酶”并且貫穿本說(shuō)明書(shū)這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可互換使用。LAL可以是人蛋白，即，人溶酶體酸性脂肪酶。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“SBC-102”是指重組人溶酶體酸性脂肪酶。LAL在文獻(xiàn)中還被稱為酸膽固醇酯水解酶、膽固醇酯酶、脂肪酶A、LIPA以及固醇酯酶。LAL催化膽固醇酯和甘油三酯水解為游離膽固醇、甘油和游離脂肪酸。因此，“LAL活性”可以例如通過(guò)熒光底物4-甲基傘形酮油酸酯(4MU0)的裂解來(lái)測(cè)量。4MU0的裂解可以例如通過(guò)所釋放的突光團(tuán)(fIurophore) 4-甲基傘形酮(4MU)在約360nm處的激發(fā)和在460nm處的發(fā)射來(lái)檢測(cè)。結(jié)果可以以相對(duì)熒光單位(RFU)來(lái)報(bào)告。例如，在30分鐘端點(diǎn)測(cè)定中裂解的底物的量可以相對(duì)于4MU標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)量化，并且一個(gè)活性單位(U)可以定義為在37°C下裂解I微摩爾的4MU0/分鐘所需要的酶的量。因此，LAL的功能性片段或變異體包括具有LAL活性(例如，水解膽固醇酯和/或甘油三酯的能力)的片段或變異體。如本文使用的“外源性LAL”是指非患者天然產(chǎn)生的LAL。例如，外源性LAL包括施用至患者的重組LAL蛋白、分離自人或動(dòng)物并且施用至患者的LAL蛋白以及由于施用編碼LAL的RNA和/或DNA或增加內(nèi)源性LAL蛋白表達(dá)的另一種治療而在患者中產(chǎn)生(即表達(dá))的LAL蛋白?！办o脈內(nèi)注射”在醫(yī)學(xué)上 經(jīng)常稱為IV推注或團(tuán)注，是指以下施用途徑:其中注射器被連接IV接入裝置，并且藥劑被直接注射，通常快速注射，并且如果它可能引起靜脈刺激或過(guò)于快速的作用，則有時(shí)持續(xù)至多15分鐘的時(shí)間。一旦藥物被注射到IV管的流體流中，則必須有一些手段來(lái)確保它從管中到達(dá)患者。通常，這通過(guò)以下來(lái)完成:允許流體流正常流動(dòng)，并且由此攜帶藥物至血流中。然而，在一些情況下，在第一注射之后使用第二流體注射(有時(shí)稱為“沖洗(flush) ” )，以促進(jìn)藥物進(jìn)入血流?！办o脈內(nèi)輸注”是指以下施用途徑:其中藥劑在延長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行遞送。例如，藥劑可以在I至8小時(shí)之間的一段時(shí)間內(nèi)遞送至患者。藥劑還可以在約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7或約8小時(shí)的時(shí)期內(nèi)遞送至患者。為了完成靜脈內(nèi)輸注，可以使用IV重力滴注或IV泵。當(dāng)患者僅僅在某些時(shí)刻需要藥劑并且不需要另外的靜脈內(nèi)流體(例如，水溶液，其可含有氯化鈉、葡萄糖或其任意組合)時(shí)，通常使用IV輸注，所述靜脈內(nèi)流體如恢復(fù)電解質(zhì)、血糖以及水損失的那些流體。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“禽類(lèi)”是指分類(lèi)學(xué)鳥(niǎo)綱的生物體的任何種、亞種或?qū)?，如但不限于雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、野雞、鸚鵡、雀、鷹、烏鴉以及平胸鳥(niǎo)，包括鴕鳥(niǎo)、鴯鹋以及食火雞。所述術(shù)語(yǔ)包括原雞(Gallus gallus)或雞的各種已知品種(例如，白色來(lái)亨雞(White Leghorn)、棕色來(lái)亨雞Orown Leghorn)、橫斑蘆花雞Oarred-Rock)、蘇塞克斯雞(Sussex)、新漢夏雞(New Hampshire)、羅德島雞(Rhode Island)、澳洲黑雞(Australorp)、米諾卡雞(Minorca)、蘆花雞(Amrox)、加州灰雞(California Gray)),以及火雞、野雞、鶴鶉、鴨、鴕鳥(niǎo)以及通常以商業(yè)數(shù)量飼養(yǎng)的其它家禽的品種。它還包括在發(fā)育的所有階段的單個(gè)禽類(lèi)生物體，包括胚胎和胎兒階段。術(shù)語(yǔ)“家禽得到的”或“禽類(lèi)得到的”是指由家禽產(chǎn)生或獲得的組合物或物質(zhì)。“家禽”是指可以作為禽畜飼養(yǎng)的禽類(lèi)，包括但不限于:雞、鴨、火雞、鵪鶉以及平胸鳥(niǎo)。例如，“家禽得到的”可以指雞得到的、火雞得到的和/或鵪鶉得到的。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“患者”是指正在接受或已經(jīng)接受或準(zhǔn)備接受例如由醫(yī)學(xué)護(hù)理提供者所指導(dǎo)的醫(yī)學(xué)護(hù)理或治療的任何人。如本文使用的“治療有效劑量”是指產(chǎn)生希望的治療反應(yīng)所需的藥物的劑量(例如量和/或間隔)。治療有效劑量是指一種劑量，相比于未接受這種劑量的對(duì)應(yīng)受試者，所述劑量使得疾病、病癥或副作用得到改善的治療、治愈、預(yù)防或改善，或者疾病或病癥的發(fā)生率或惡化率降低。所述術(shù)語(yǔ)在它的范圍內(nèi)還包括有效增強(qiáng)生理功能的劑量。術(shù)語(yǔ)治療(“treat'“treating”以及“treatment”)是指減輕、減緩或改善疾病或癥狀、預(yù)防附加癥狀、改善或預(yù)防癥狀的潛在病因、抑制疾病或病癥、阻止疾病或病狀的發(fā)展、緩解疾病或病狀、引起疾病或病狀好轉(zhuǎn)、緩解由疾病或病狀引起的病狀、或預(yù)防性和/或在癥狀已發(fā)生之后停止疾病或病狀的癥狀。如本文關(guān)于特定劑量使用的“kg—1”、“每kg”、“/kg”和“每公斤”表示哺乳動(dòng)物的“每公斤體重”，因此這些術(shù)語(yǔ)可互換使用。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”意欲 涵蓋單個(gè)“多肽”以及多個(gè)“多肽”，并且是指由通過(guò)酰胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)構(gòu)成的分子。術(shù)語(yǔ)“多肽”是指兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的任何一個(gè)或多個(gè)鏈，并且不是指特定長(zhǎng)度的產(chǎn)物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或用于表示具有兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)鏈的任何其它術(shù)語(yǔ)都被包括在“多肽”的定義內(nèi)，并且術(shù)語(yǔ)“多肽”可以代替或與任何這些術(shù)語(yǔ)互換使用。術(shù)語(yǔ)“多肽”還意欲表示多肽的表達(dá)后修飾產(chǎn)物，包括但不限于糖基化、乙?；?、磷?；Ⅴ０坊?、通過(guò)已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)而衍生化、蛋白水解性裂解、或被非天然存在的氨基酸修飾。多肽可以衍生自天然生物來(lái)源或由重組技術(shù)產(chǎn)生，但不必從指定核酸序列翻譯。它可以以任何方式產(chǎn)生，包括通過(guò)化學(xué)合成。如本文所使用，兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核苷酸序列之間的同源性百分率等于這兩個(gè)序列之間的同一性百分率。兩個(gè)序列之間的同一性百分率是由序列共享的相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即，同源性％=相同的位置的數(shù)量/位置的總數(shù)X100)，其中考慮了為優(yōu)化兩個(gè)序列的比對(duì)而需要引入的間隙數(shù)和各間隙的長(zhǎng)度。兩個(gè)序列之間的序列比較和同一性百分率的確定可以使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成，如以下在非限制性實(shí)例中所述。兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性百分率可以使用已被并入ALIGN程序(版本2.0)中的 E.Meyers 和 ff.Miller (Comput.Appl.Biosc1.，4:11-17 (1988))的算法，使用 PAMl20權(quán)重殘基表，間隙長(zhǎng)度罰分12，和間隙罰分4來(lái)確定。另外，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性百分率可以使用已被并入到GCG軟件包(在http://www.gcg.com可得)中的GAP程序中的 Needleman 和 Wunsch (J.Mol, Biol.48:444-453 (1970))算法，使用 Blossom 62 矩陣或PAM250矩陣，間隙權(quán)重16、14、12、10、8、6或4，以及長(zhǎng)度權(quán)重1、2、3、4、5或6來(lái)確定?！胺蛛x的”多肽或其片段、變異體或衍生物意欲為不在它的天然周?chē)h(huán)境中的多肽。不要求特定的純化水平。例如，分離的多肽可以是從它的原生或天生環(huán)境中移出的。如本文所公開(kāi)，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是分離的，通過(guò)任何適合的技術(shù)分離、分開(kāi)、或者部分或?qū)嵸|(zhì)性純化的天然或重組多肽也被認(rèn)為是分離的。本文公開(kāi)的其它多肽是上述多肽的片段、衍生物、類(lèi)似物、或變異體以及其任意組合。當(dāng)談到本文公開(kāi)的任何多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”、“變異體”、“衍生物”以及“類(lèi)似物”包括保留對(duì)應(yīng)的天然多肽的至少一些活性的任何多肽(例如，保留水解膽固醇酯和/或甘油三酯的能力的LAL多肽片段、變異體、衍生物以及類(lèi)似物)。多肽片段包括例如蛋白水解片段、以及缺失片段。多肽變異體包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改變的氨基酸序列的多肽。變異體可以天然或非天然存在。非天然存在的變異體可以使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。變異型多肽可以包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是已經(jīng)被改變以展現(xiàn)出在原生多肽上未發(fā)現(xiàn)的另外的特征的多肽。實(shí)例包括融合蛋白。變異型多肽在本文中還可以稱為“多肽類(lèi)似物”。如本文所使用，主題多肽的“衍生物”可以含有通過(guò)官能側(cè)基的反應(yīng)而化學(xué)衍生化的一個(gè)或多個(gè)殘基?！把苌铩边€包括含有20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羥基脯氨酸可以取代脯氨酸；5_羥基賴氨酸可以取代賴氨酸；3_甲基組氨酸可以取代組氨酸；高絲氨酸可以取代絲氨酸；和/或鳥(niǎo)氨酸可以取代賴氨酸。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”意欲涵蓋單個(gè)核酸以及多個(gè)核酸，并且是指分離的核酸分子或構(gòu)建體，例如信使RNA (mRNA)或質(zhì)粒DNA (pDNA)。多核苷酸可以包含常規(guī)磷酸二酯鍵或非常規(guī)鍵(例如酰胺鍵，如在肽核酸(PM)中所發(fā)現(xiàn))。術(shù)語(yǔ)“核酸”是指多核苷酸中存在的任何一種或多種核酸區(qū)段，例如DNA或RNA片段?！胺蛛x的”核酸或多核苷酸意欲為從它的原生環(huán)境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，出于本發(fā)明的目的，載體中所含有的編碼LAL的重組多核苷酸被認(rèn)為是分離的。分離的多核苷酸的其它實(shí)例包括維持在異源宿主細(xì)胞中的重組多核苷酸或溶液中的純化(部分或?qū)嵸|(zhì)性)的多核苷酸。分離的RNA分子包括本發(fā)明的多核苷酸的活體內(nèi)或活體外RNA轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)本發(fā)明的分離的多核苷酸或核酸此外包括合成產(chǎn)生的所述分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括調(diào)控元件，如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄終止子。如本文所使用，“編碼區(qū)”是核酸中由翻譯成氨基酸的密碼子組成的一部分。盡管“終止密碼子”(TAG、TGA或TAA)不翻譯成氨基酸，但是它可以被認(rèn)為是編碼區(qū)的一部分，但任何側(cè)翼序列，例如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子等不是編碼區(qū)的一部分。本發(fā)明的兩個(gè)或更多個(gè)編碼區(qū)可以存在于單一多核苷酸構(gòu)建體中，例如在單一載體上，或者在獨(dú)立的多核苷酸構(gòu)建體中，例如在獨(dú)立(不同)的載體上。而且，任何載體可以含有單一編碼區(qū)，或可以包含兩個(gè)或 更多個(gè)編碼區(qū)。另外，本發(fā)明的載體、多核苷酸或核酸可以編碼異源編碼區(qū)，所述異源編碼區(qū)融合或未融合至編碼LAL多肽或其片段、變異體或衍生物的核酸。異源編碼區(qū)包括但不限于特化的元件或基元，如分泌信號(hào)肽或異源功能性結(jié)構(gòu)域。多種轉(zhuǎn)錄控制區(qū)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。它們包括但不限于:轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，其在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中起作用，如但不限于來(lái)自巨細(xì)胞病毒(立即早期啟動(dòng)子，與內(nèi)含子-A聯(lián)合)、猿猴病毒40(早期啟動(dòng)子)以及逆轉(zhuǎn)錄病毒(如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcomavirus))的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)段。其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括來(lái)源于脊椎動(dòng)物基因的那些，如肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白、牛生長(zhǎng)激素以及兔β_球蛋白，以及能夠在真核細(xì)胞中控制基因表達(dá)的其它序列。其它適合的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括組織特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以及淋巴因子可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(例如，可由干擾素或白介素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子)。類(lèi)似地，多種翻譯控制元件是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的。它們包括但不限于核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始和終止密碼子以及來(lái)源于小核糖核酸病毒的元件(特別是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或IRES，也稱為CITE序列)。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是RNA，例如，呈信使RNA (mRNA)的形式。本發(fā)明的多核苷酸和核酸編碼區(qū)可以締合有另外的編碼區(qū)，所述另外的編碼區(qū)編碼分泌或信號(hào)肽，所述分泌或信號(hào)肽指導(dǎo)由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的分泌。根據(jù)信號(hào)假說(shuō)，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽或分泌前導(dǎo)序列，一旦生長(zhǎng)中的蛋白質(zhì)鏈跨過(guò)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出被起始，那么所述序列就從成熟蛋白質(zhì)裂解。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)意識(shí)到由脊椎動(dòng)物細(xì)胞分泌的多肽通常具有融合至多肽的N-末端的信號(hào)肽，所述信號(hào)肽從完整或“全長(zhǎng)”多肽裂解，以產(chǎn)生分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些實(shí)施方案中，使用原生信號(hào)肽，例如人LAL的MKMRFLGLVVCLVLWTLHSEG(SEQ ID NO:2)信號(hào)肽，或所述序列的保留指導(dǎo)與其可操作地締合的多肽的分泌的能力的功能性衍生物?；蛘撸梢允褂卯愒葱盘?hào)肽(例如，異源哺乳動(dòng)物或禽類(lèi)信號(hào)肽)或其功能性衍生物。例如，野生型前導(dǎo)序列可以取代為人組織纖溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β_葡糖苷酸酶的前導(dǎo)序列?！拜d體”意謂由單鏈、雙鏈、環(huán)狀或超螺旋DNA或RNA構(gòu)成的多核苷酸。典型載體可以由在適當(dāng)?shù)木嚯x處可操作地連接以允許功能性基因表達(dá)的以下元件構(gòu)成:復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、5' mRNA前導(dǎo)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、核酸序列盒(Nucleic acid cassette)、終止和聚腺苷酸化位點(diǎn)以及可選擇標(biāo)記物序列。在具體應(yīng)用中可以省略這些元件中的一個(gè)或多個(gè)。核酸序列盒可以包含用于插入待表達(dá)的核酸序列的限制性位點(diǎn)。在功能性載體中，核酸序列盒包含含有翻譯起始和終止位點(diǎn)的待表達(dá)核酸序列。構(gòu)建體中可以任選地包含內(nèi)含子，例如在編碼序列的5"方向。載體被構(gòu)建成使得特定的編碼序列與適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列一起位于載體中，編碼序列相對(duì)于控制序列的位置和取向應(yīng)使得編碼序列在控制或調(diào)控序列的“控制”下轉(zhuǎn)錄。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，可能需要對(duì)編碼相關(guān)特定蛋白質(zhì)的序列進(jìn)行修飾。例如，在一些情況下，可能有必要修飾所述序列以便它可以以適當(dāng)取向連接至控制序列，或維持閱讀框?？梢詫⒖刂菩蛄?和其它調(diào)控序列連接至編碼序列，隨后插入載體中?；蛘撸梢詫⒕幋a序列直接克隆到表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體已經(jīng)含有控制序列和與控制序列一起處于閱讀框中并且受控制序列調(diào)控的適當(dāng)限制性位點(diǎn)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指基因產(chǎn)生生物化學(xué)品例如多肽的過(guò)程。所述過(guò)程包括基因在細(xì)胞內(nèi)的功能性存在的任何表現(xiàn)，包括但不限于基因敲除以及瞬間表達(dá)與穩(wěn)定表達(dá)。它包括但不限于基因轉(zhuǎn)錄成信使RNA (mRNA)，和所述mRNA翻譯為多肽。基因表達(dá)產(chǎn)生“基因產(chǎn)物”。如本文所使用，基因產(chǎn)物可以是核酸，例如由基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的信使RNA、或從轉(zhuǎn)錄物翻譯的多肽。本文所述的基因產(chǎn)物更包括具有轉(zhuǎn)錄后修飾的核酸，所述修飾例如為聚腺苷酸化；或具有轉(zhuǎn)錄后修飾的多肽，所述修飾例如為甲基化、糖基化、添加脂質(zhì)、與其它蛋白質(zhì)亞基締合、蛋白水解裂解等。如本文使用的“宿主細(xì)胞”是指含有使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建并編碼至少一種異源基因的載體的細(xì)胞。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“N-聚糖”、“寡糖”、“寡糖結(jié)構(gòu)”、“糖基化型態(tài)”、“糖基化特征”
以及“糖基化結(jié)構(gòu)”具有基本上相同的含義，并且均表示由糖殘基形成并且連接于糖基化蛋白質(zhì)的一種或多種結(jié)構(gòu)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”是指本文所述化合物與其它化學(xué)組分的混合物，所述其它化學(xué)組分如載劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑和/或賦形劑。具有不足LAL活性的患者
不希望將本發(fā)明限于任何特定病狀或病狀組別的治療，本發(fā)明包括治療患者的溶酶體酸性脂肪酶(LAL)缺乏。如本文所使用，患有LAL缺乏的患者是具有不足LAL活性的任何患者?；颊叩牟蛔鉒AL活性可以例如歸因于低RNA水平、低蛋白質(zhì)水平或低蛋白質(zhì)活性。不足LAL活性可以歸因于LAL編碼序列、LAL調(diào)控序列或另一基因(例如，調(diào)控LAL的基因)的突變。不足LAL活性還可以歸因于環(huán)境因素。本發(fā)明可以用于治療受試者或患者的多種病狀。因此，可以根據(jù)本發(fā)明由外源性LAL有益地治療的任何病狀均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案關(guān)注治療由于溶酶體酸性脂肪酶缺乏引起的溶酶體貯積病(LSD)，特別是沃爾曼氏病(WD)和膽固醇酯貯積病(CESD)。不希望將本發(fā)明限于任何特定理論或操作機(jī)制，WD與CESD都可以歸因于LAL基因座處的突變，并且導(dǎo)致脂質(zhì)材料在多種組織的溶酶體中大量積聚，和膽固醇與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)機(jī)制的強(qiáng)烈干擾，所述積聚和干擾可以根據(jù)本發(fā)明的方法通過(guò)施用外源性LAL來(lái)治療。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明治療的LAL缺乏是WD。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明治療的LAL缺乏是CESD。在一些實(shí)施方案中，WD或CESD的診斷是基于遺傳分析(例如LAL編碼序列中功能性突變的鑒定)。在其它實(shí)施方案中，WD或CESD的診斷是基于臨床發(fā)現(xiàn)(例如，身體檢查和/或?qū)嶒?yàn)室檢驗(yàn))。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL可以用于治療多種病狀中的并發(fā)癥，如非酒精性脂肪肝(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NAFLD是指與由于過(guò)量攝取酒精而引起的肝臟疾病具有類(lèi)似的組織病理學(xué)的肝臟疾病。其特征為引起肝臟增大的大泡脂肪變性。NAFLD可以發(fā)展為NASH，其是指類(lèi)似于NAFLD并且增加了可導(dǎo)致纖維化和肝硬化的炎癥和肝臟損傷的肝臟疾病。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL可以用于治療以下病狀:包括胰腺炎，例如慢性胰腺炎和/或急性胰腺炎，以及酒精誘發(fā)的胰腺損傷，如酒精誘發(fā)的胰腺炎。由任何有用的方 法產(chǎn)生的外源性LAL都可以用于治療由于酒精誘發(fā)的細(xì)胞損傷而引起的疾病，包括但不限于導(dǎo)致脂質(zhì)酯在身體組織(如但不限于肝臟、脾臟、腸以及心血管組織)中積聚的那些酒精誘發(fā)的細(xì)胞損傷。根據(jù)本發(fā)明，吸收障礙也可以通過(guò)施用外源性LAL來(lái)治療。外源性LAL還可用于治療患有丹吉爾病(Tangier disease)和家族性低α脂蛋白血癥的患者。丹吉爾病/家族性低α脂蛋白血癥與膽固醇酯在巨噬細(xì)胞中的積聚相關(guān)，伴隨有肝脾腫大和/或淋巴結(jié)病連同低HDL水平，這可以通過(guò)施用外源性LAL來(lái)治療。例如，不希望將本發(fā)明限于任何特定理論或操作機(jī)制，降低的LAL活性可降低ABCAl表達(dá)，并且相反地，通過(guò)施用外源性LAL至患有丹吉爾病/家族性低α脂蛋白血癥的患者獲得的增加的LAL活性將增加ABCAl表達(dá)，以克服由于多態(tài)性而具有降低的功能活性的ABCAl基因的作用。在一些實(shí)施方案中，在治療前患者的LAL活性水平為正常LAL活性水平的約I %、約 2%、約 3%、約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%或約80%。在一個(gè)實(shí)施方案中，在治療前患者的LAL活性水平為正常LAL活性水平的約50%或以下。在一個(gè)實(shí)施方案中，在治療前患者的LAL活性水平為正常LAL活性水平的約40%或以下。在一些實(shí)施方案中，在治療前患者的LAL活性水平為正常LAL活性水平的約30%或以下。在一些實(shí)施方案中，在治療前患者的LAL活性水平為正常LAL活性水平的約30%或以下。在一些實(shí)施方案中，在治療前患者的LAL活性水平為正常LAL活性水平的約20%或以下。在一些實(shí)施方案中，在治療前患者的LAL活性水平為正常LAL活性水平的約10%或以下。在一些實(shí)施方案中，在治療前患者的LAL活性水平為正常LAL活性水平的約5%或以下。在一些實(shí)施方案中，在治療前患者顯示不可測(cè)量的LAL活性。在一些實(shí)施方案中，LAL活性水平在獲自患有LAL缺乏的人患者的培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，LAL活性水平在患有LAL缺乏的人患者的淋巴細(xì)胞(例如，白細(xì)胞)中測(cè)量。淋巴細(xì)胞包括但不限于外周血單核細(xì)胞(PMBC)。測(cè)量方法例如描述于 Burton 等.，(1980)Clinica Chimica Acta 101:25-32 和 Anderson 等.，(1999)Mol.Genet.& Metab.,66:333-345中，這兩個(gè)文獻(xiàn)整體并入本文。待用外源性LAL治療的LAL缺乏患者可以展現(xiàn)出成纖維細(xì)胞LAL酶活性小于約30、約20、約10、約5、約4、約3、約2或約lpmol/mg/min,如使用三油精作為底物所測(cè)量。待用外源性LAL治療的LAL缺乏患者可以展現(xiàn)出白細(xì)胞LAL酶活性小于約30、約20、約10、約5、約4、約3、約2或約lpmol/mg/min,如使用三油精作為底物所測(cè)量。待用外源性LAL治療的LAL缺乏患者可以展現(xiàn)出成纖維細(xì)胞LAL酶活性小于約30、約20、約10、約5、約4、約3、約2或約lpmol/mg/min,如使用油酸膽固醇酯作為底物所測(cè)量。待用外源性LAL治療的LAL缺乏患者可以展現(xiàn)出白細(xì)胞LAL酶活性小于約30、約20、約10、約5、約4、約3、約2或約lpmol/mg/min,如使用油酸膽固醇酯作為底物所測(cè)量。外源性LAL的施用本發(fā)明提供用外源性LAL治療人患者的方法，所述方法包括施用外源性LAL至患者，其中施用足以在患者中恢復(fù)生長(zhǎng)、改善肝功能、降低肝臟損害、增加LAL的組織水平和/或增加LAL活性。本發(fā)明提出以有用和之前未特征化的頻率施用(即，給藥方案)外源性LAL,以治療源自LAL缺乏的病狀，包括WD和CESD，以及之前未特征化的給藥量，用于治療這些病狀。本發(fā)明提出將治療有效劑量的外源性LAL在每5天I次至每30天I次施用至患者持續(xù)由熟悉醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的從業(yè)者確定的一段時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)間段將是患者的壽命的剩余時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥頻率在每5天I次與每25天I次之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥頻率在每5天I次與每21天I次之間。在另一實(shí)施方案中，給藥頻率在每7天I次與每14天I次之間。外源性LAL可以每5天I次、每6天I次、每7天I次、每8天I次、每9天I次、每10天I次、每11天I次、每12天I次、每13天I次或每14天I次進(jìn)行施用。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL約每周施用一次。在其它實(shí)施方案中，外源性LAL約每?jī)芍苁┯靡淮?。在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥頻率是約每30天I次。為了治療病狀，通常施用的外源性LAL的量可以取決于已知的因素而變化，所述因素如接受者的年齡、健康狀況和體重、并行治療的類(lèi)型、治療頻率等。通常，活性成分的劑量可以為約0.01至約50mg/公斤體重。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的外源性LAL的劑量為約0.1至0.5mg/公斤體重。在一個(gè)實(shí)施方案中，齊Li量為約0.1mg至約5.0mg/公斤。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量為約0.1mg至約5.0mg/公斤。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量為約0.1、約0.2、約0.25、約0.30、約0.35、約0.40、約0.45、約0.50mg/公斤。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量為約Img至約5mg/公斤。 在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量為約Img/公斤。在一個(gè)實(shí)施方案中，齊Li量為約3mg/公斤。例如,可以施用0.1mg/公斤體重、0.2mg/公斤體重、0.3mg/公斤體重、
0.4mg/公斤體重、0.5mg/公斤體重、lmg/公斤體重、2mg/公斤體重、3mg/公斤體重、4mg/公斤體重或5mg/公斤體重。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量為約Img至約20mg/公斤體重。當(dāng)采用本發(fā)明的給藥方案時(shí)，本發(fā)明還包括其它劑量。例如根據(jù)本發(fā)明的給藥方案，將對(duì)患者施用約0.1mg至約50mg/公斤體重。在一些實(shí)施方案中，將約0.5至約50mg的外源性LAL施用至例如年齡在I個(gè)月與24個(gè)月之間的患有沃爾曼氏病的患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者小于I歲。在另一實(shí)施方案中，患者小于2歲。在一些實(shí)施方案中，將約0.lmg、約0.2mg、約0.3mg、約0.4mg、約0.5mg、約 lmg、約 2mg、約 3mg、約 5mg、約 10mg、約 15mg、約 20mg、約 25mg、約 30mg、約 35mg、約 40mg或約45mg的外源性LAL施用至患有沃爾曼氏病的患者。在一些實(shí)施方案中，將約0.5至約30mg、約0.5至約20mg、約0.5至約IOmg或約0.5至約5mg施用至患有沃爾曼氏病的患者。在一些實(shí)施方案中，施用約I至約30mg、約I至約20mg、約I至約IOmg或約I至約5mg。在一些實(shí)施方案中，將約Img至約350mg的外源性LAL施用至例如診斷患有CESD的患者。因此，在一些實(shí)施方案中，將約 1、5、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325或350mg的外源性LAL施用至患有CESD的患者。在一些實(shí)施方案中，將約5至約350mg、約5至約300mg、約5至約250mg或約5至約200mg施用至患有CESD的患者。在一些實(shí)施方案中，將約10至約350mg、約10至約300、約10至約250或約10至約200mg施用至患有CESD的患者。聯(lián)合治療本文公開(kāi)的治療蛋白可聯(lián)合其它治療劑使用。本發(fā)明提供預(yù)治療程序來(lái)使可以由施用根據(jù)本發(fā)明的外源性LAL而招致的任何潛在的過(guò)敏性反應(yīng)減至最少或預(yù)防所述反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了預(yù)治療潛在過(guò)敏性反應(yīng)，將H-1受體拮抗劑、也稱為抗組胺劑(例如，苯海拉明)施用至患者。在一·個(gè)實(shí)施方案中,H-1受體拮抗劑是以約Img至約IOmg/公斤體重的劑量施用。例如，抗組胺劑可以以約5mg/公斤的劑量施用。抗組胺劑的施用可以在施用根據(jù)本發(fā)明的外源性LAL之前。在一個(gè)實(shí)施方案中，H-1受體拮抗劑在施用外源性LAL之前約10至約90分鐘，例如約30至約60分鐘進(jìn)行施用。H-1受體拮抗劑可以使用連接至血管接入端口的攜帶式系統(tǒng)來(lái)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗組胺劑在施用外源性LAL之前約90分鐘施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗組胺劑在施用外源性LAL之前約10與約60分鐘之間進(jìn)行施用。在另一實(shí)施方案中，抗組胺劑在施用外源性LAL之前約20與約40分鐘之間進(jìn)行施用。例如，抗組胺劑可以在施用外源性LAL之前20、25、30、35或40分鐘施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用的抗組胺劑是苯海拉明。可以使用任何有用的抗組胺劑。這些抗組胺劑包括但不限于克立馬丁(clemastine)、多西拉敏(doxylamine)、氯雷他定(1ratidine)、地氯雷他定(desloratidine)、非索非那定(fexofenadine)、非尼拉敏(pheniramine)、西替立嗪(pheniramine)、依巴斯汀(ebastine)、異丙嗪(promethazine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、左西替利嗪(chlorpheniramine)、奧洛他定(olopatadine)、喹硫平(quetiapine)、氯苯甲嗪(quetiapine)、茶苯海明(dimenhydrinate)、恩布拉敏(embramine)、二甲卻P定(dimethidene)以及右氯苯那敏(dexchloropheniramine)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗組胺劑的施用劑量在約0.1mg與約IOmg/公斤體重之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗組胺劑的施用劑量在約Img與約5mg/公斤體重之間。例如劑量可以為lmg、2mg、3mg、4mg或5mg/公斤體重。抗組胺劑可以通過(guò)任何有用的方法來(lái)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗組胺劑是靜脈內(nèi)施用。在另一實(shí)施方案中，抗組胺劑是以藥學(xué)上可接受的膠囊來(lái)施用。在另一實(shí)施方案中，就靜脈輸注而論,過(guò)敏性反應(yīng)的可能性可以通過(guò)使用遞增(ramp-up)方案來(lái)施用輸注而降低。在這一上下文中，遞增方案是指隨著輸注過(guò)程緩慢地提高輸注的速率，以使患者對(duì)于藥物的輸注不敏感。例如，如果患者預(yù)期或經(jīng)歷過(guò)敏性反應(yīng)或不良免疫反應(yīng)，那么還可以在外源性LAL施用之前、期間或之后施用免疫抑制劑，如但不限于抗組胺劑、皮質(zhì)類(lèi)固醇、西羅莫司(sirolimus)、伏環(huán)抱素(voclosporin)、環(huán)抱素(ciclosporin)、甲氛蝶呤(methotrexate)、針對(duì)IL-2受體的抗體、針對(duì)T-細(xì)胞受體的抗體、針對(duì)TNF-α的抗體或融合蛋白(例如，英夫利昔單抗(infliximab)、依那西普(etanercept)或阿達(dá)木單抗(etanercept))、CTLA_4_Ig(例如阿巴他賽(abatacept))、抗 0X-40 抗體。本發(fā)明還涵蓋涉及施用含有外源性LAL的組合物聯(lián)合一種或多種降膽固醇劑(例如HMG-CoA還原酶抑制劑)的療法。這些藥劑的非限制性實(shí)例包括:阿托伐他汀(atorvastatin) ( Lipitor 和Torvast ')、氟伐他汀(atorvastatin) (Lescol )、 洛伐他汀(1vastatin) ( Mevacor 、Alto cor %Altoprev )、匹伐他汀(pitavastatin) (Livalo 、Pitava )、普伐他汀(pravastatin) (Pravachol 、Selektine 、Lipostat )、羅蘇伐他汀(pravastatin) (Crestor )以及辛伐他汀 (simvastatin) (Zocor 、Lipex )。外源性LAL的作用本發(fā)明提出在用外源性LAL治療后疾病相關(guān)的癥狀得到校正或正?；??；貞?yīng)于外源性LAL的臨床進(jìn)展(即，癥狀的改善)可以通過(guò)任何有用的方法或程序來(lái)監(jiān)控。在一些實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以達(dá)成約200ng/mL至約1，500ng/mL的Cmax。在一些實(shí)施方 案中，施用外源性LAL足以達(dá)成約200ng/mL至約1，000ng/mL的Cmax。在一些實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以達(dá)成約200ng/mL至約800ng/mL的Cmax。在一些實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以達(dá)成約200ng/mL、約300ng/mL、約400ng/mL、約500ng/mL、約 600ng/mL、約 700ng/mL、約 800ng/mL、約 900ng/mL、約 1，000ng/mL、約 1，250ng/mL 或約1，500ng/mL的Cmax。在一些實(shí)施方案中，Cmax在輸注過(guò)程中達(dá)到。在一些實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以達(dá)成少于40分鐘的LAL半衰期(t1/2)。在一些實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以達(dá)成少于30分鐘的LAL半衰期(t1/2)。在一些實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以達(dá)成少于20分鐘的LAL半衰期(t1/2)。在一些實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以達(dá)成少于15分鐘的LAL半衰期(t1/2)。在一些實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以達(dá)成少于10分鐘的LAL半衰期(t1/2)。在一些實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以達(dá)成約 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35 或 40 分鐘的 LAL 半衰期(t1/2)。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL增加患者的LAL活性。LAL活性可以在例如肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、主動(dòng)脈、外周血液白細(xì)胞和/或皮膚成纖維細(xì)胞中增加。在一些實(shí)施方案中，LAL活性在分離自血液樣品的淋巴細(xì)胞的提取物中測(cè)量。外源性LAL可以使LAL活性增加至LAL施用之前的活性的至少約1.5、約2、約
2.5、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15或約20倍。外源性LAL可以使LAL活性增加至LAL施用之前的活性的至少約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約
17、約18、約19、約20倍。LAL活性可以使用本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)評(píng)價(jià)，所述方法包括例如，使用[1-14c]油酸膽固醇酯、三油精(三[1-14C]油酸甘油酯)、肉豆蘧酸對(duì)硝基苯酯或
4-MU0(4-甲基傘形酮油酸酯)底物的測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用器官和組織體積與表征來(lái)確定在施用本發(fā)明的外源性LAL后病狀的改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用外源性LAL后肝功能/損傷的臨床進(jìn)展通過(guò)血液轉(zhuǎn)氨酶如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和/或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，和/或其它生物標(biāo)記物如白蛋白、堿性磷酸酶以及膽紅素(直接和總值)隨時(shí)間的量化來(lái)監(jiān)控。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用成像技術(shù)來(lái)監(jiān)控臨床進(jìn)展。例如且不限于，使用的成像技術(shù)可以是超聲、CT掃描、核磁共振成像以及核磁共振光譜法。在一些實(shí)施方案中，以本文所述的劑量施用外源性LAL足以在人患者中恢復(fù)生長(zhǎng)和/或增加體重。施用外源性LAL還可以提高患有早發(fā)性LAL缺乏的嬰兒或兒童患者的生長(zhǎng)速率(即，體重增加)。例如，施用外源性LAL可以使體重增加速率增加達(dá)施用之前觀察到的生長(zhǎng)速率/速度的至少約10 %、約20 %、約30 %、約40 %、約50 %、約60 %、約70 %、約80 %、約90 %、約100 %、約200 %、約300 %、約400 %或約500 %。在一些實(shí)施方案中，施用外源性LAL恢復(fù)年齡在約I個(gè)月與約24個(gè)月之間的患有早發(fā)性LAL缺乏(例如，沃爾曼氏病)的兒童患者的正常生長(zhǎng)速率。在所述上下文中，“正?！笔侵溉玑t(yī)學(xué)領(lǐng)域的普通從業(yè)者所確定的所治療的患者的正常生長(zhǎng)速率。 在一個(gè)實(shí)施方案中，例如就WD和CESD或其它LAL缺乏而論，肝腫大明顯逆轉(zhuǎn)，其中肝臟大小回復(fù)到比正常大小大約1%至約60%以內(nèi)的大小。在所述上下文中，“正常”是指如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的普通從業(yè)者所確定的所治療的患者的正常肝臟大小。在一個(gè)實(shí)施方案中，肝臟大小被減小至比正常大約1%與約50%之間。在另一實(shí)施方案中，肝臟大小被減小至比正常大約1%與約40%之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，肝臟大小被減小至比正常大約1%與約30%之間。在另一實(shí)施方案中，肝臟大小被減小至比正常大約1%與約20%之間。在另一實(shí)施方案中，肝臟大小被減小至比正常大約10%與約20%之間。例如，肝臟可以比正常大小大 10%,11%>12% 13% 14%、15%、16%、17%、18%、19%或 20%。在另一實(shí)施方案中，肝臟大小被減小至比正常大約0%與約10%之間。例如，肝臟可以比正常肝臟大小大0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或 10%。用外源性LAL治療還可以改善肝功能。因此，在一些實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以恢復(fù)正常肝功能和/或使肝臟檢驗(yàn)正?；?。在一些實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以使肝臟轉(zhuǎn)氨酶的血清水平降低例如至少約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、和/或至少約90%。在一個(gè)實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以使肝臟轉(zhuǎn)氨酶血清水平降低至少約40%。在一個(gè)實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以使肝臟轉(zhuǎn)氨酶血清水平降低至少約50%。在一個(gè)實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以使肝臟轉(zhuǎn)氨酶血清水平降低至少約60%。在一個(gè)實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以使肝臟轉(zhuǎn)氨酶血清水平降低至少約70%。在一個(gè)實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以使肝臟轉(zhuǎn)氨酶血清水平降低至少約80%。在一個(gè)實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以使肝臟轉(zhuǎn)氨酶血清水平降低至少約90%。
在一些實(shí)施方案中，肝臟轉(zhuǎn)氨酶是丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以降低血清ALT。例如，施用外源性LAL可以使血清ALT降低例如至少約50%、60%、70%、80%或90%。血清ALT水平可以起到指示肝臟損傷的作用。因此，本發(fā)明還涵蓋通過(guò)施用有效降低血清ALT的量的外源性LAL來(lái)降低患有LAL缺乏的人患者的肝臟損傷的方法。在一些實(shí)施方案中，肝臟轉(zhuǎn)氨酶是血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以降低血清AST。例如，施用外源性LAL可以使血清AST降低例如至少約50%、60%、70%、80%或90%。血清AST水平可以起到指示肝臟損傷的作用。因此，本發(fā)明還涵蓋通過(guò)施加有效降低血清AST的量的外源性LAL來(lái)降低患有LAL缺乏的患者的肝臟損傷的方法。在一些實(shí)施方案中，用外源性LAL治療可以降低血清鐵蛋白水平。因此，在一些實(shí)施方案中，與治療前的水平相比，用外源性LAL治療足以使血清鐵蛋白降低例如至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。在一個(gè)實(shí)施方案中，用外源性 LAL治療足以使鐵蛋白血清水平降低至少50%。在另一實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以使鐵蛋白血清水平降低至少約60%。在一個(gè)實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以使鐵蛋白血清水平降低至少約70%。在一個(gè)實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以使鐵蛋白血清水平降低至少約80%。在一個(gè)實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以使鐵蛋白血清水平降低至少約90%。在一個(gè)實(shí)施方案中，用外源性LAL治療足以使鐵蛋白血清水平降低至少約95%。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，就沃爾曼氏病和CESD或其它LAL缺乏而論，脾腫大明顯逆轉(zhuǎn)，其中脾臟大小回復(fù)到比正常大小大約1%至約60%以內(nèi)的大小。在所述上下文中“正?！笔侵溉玑t(yī)學(xué)領(lǐng)域的普通從業(yè)者所確定的所研究的患者的正常脾臟大小。在一個(gè)實(shí)施方案中，脾臟大小被減小至比正常大約1%與約50%之間。在另一實(shí)施方案中,脾臟大小被減小至比正常大約1%與約40%之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，脾臟大小被減小至比正常大約1%與約30%之間。在另一實(shí)施方案中，脾臟大小被減小至比正常大約1%與約20%之間。在另一實(shí)施方案中，脾臟大小被減小至比正常大約10%與約20%之間。例如，脾臟可以比正常大小大 10%、11%、12 % 13% 14%、15%、16%、17%、18%、19%或 20%。在另一實(shí)施方案中，脾臟大小被減小至比正常大約0%與約10%之間。例如,脾臟可以比正常脾臟大小大0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或 10%。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以減輕淋巴結(jié)病(B卩，增大的淋巴結(jié))。因此，在一些實(shí)施方案中，淋巴結(jié)被減小至大約比正常大小大約1%至約60%以內(nèi)的大小。在所述上下文中“正?！笔侵溉玑t(yī)學(xué)領(lǐng)域的普通從業(yè)者所確定的所研究的患者的正常淋巴結(jié)大小。在一個(gè)實(shí)施方案中，淋巴結(jié)大小被減小至比正常大約1%至約50%。在另一實(shí)施方案中，淋巴結(jié)大小被減小至比正常大約1%至約40%。在一個(gè)實(shí)施方案中，淋巴結(jié)大小被減小至比正常大約1%至約30%。在另一實(shí)施方案中，淋巴結(jié)大小被減小至比正常大約1%至約20%。在另一實(shí)施方案中，淋巴結(jié)大小被減小至比正常大約10%至約20%。例如，淋巴結(jié)可以比正常大小大10%Λ1%Λ2% 13% 14%U5%U6%U7%,18%、19%或20%。在另一實(shí)施方案中，淋巴結(jié)大小被減小至比正常大約0%至約10%。例如，淋巴結(jié)可以比正常淋巴結(jié)大小大0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。在另一實(shí)施方案中，進(jìn)行脂質(zhì)分析以監(jiān)控病癥的改善。例如，可以進(jìn)行脂質(zhì)分析來(lái)評(píng)估外源性LAL的治療效果。脂質(zhì)分析可以通過(guò)任何有用的方法對(duì)患者的組織樣品(例如，血液樣品、肝臟活組織檢查樣品)來(lái)進(jìn)行，所述方法如但不限于本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為適當(dāng)?shù)母咝б合嗌V、氣相色譜、質(zhì)譜或薄層色譜或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的脂質(zhì)分析證實(shí)總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和/或膽固醇酯的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，就沃爾曼氏病和CESD或其它LAL缺乏而論，根據(jù)本發(fā)明治療的患者的脂質(zhì)分析顯示在肝臟、脾臟、腸、淋巴結(jié)和/或主動(dòng)脈中脂質(zhì)濃度正常化，如可以由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的普通從業(yè)者所確定。脂質(zhì)水平可以使用血漿脂質(zhì)分析或組織脂質(zhì)分析來(lái)評(píng)價(jià)。在血漿脂質(zhì)分析中，可以收集血漿，并且總血漿游離膽固醇水平可以使用例如比色測(cè)定用COD-PAP試劑盒(WakoChemicals)來(lái)測(cè)量，總血衆(zhòng)甘油三酯可以使用例如甘油三酯/GB試劑盒(BoehringerMannheim)來(lái)測(cè)量，和/或總血衆(zhòng)膽固醇可以使用膽固醇/HP試劑盒(BoehringerMannheim)來(lái)測(cè)定。在組織脂質(zhì)分析中，脂質(zhì)可以提取自例如肝臟、脾臟、和/或小腸樣品(例如，使用 Folch 等.J.Biol.Chem 226 =497-505 (1957)中提供的 Folch 法)?？偨M織膽固醇濃度可以例如使用O-鄰苯二醛來(lái)測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，施用外源性LAL足以增加營(yíng)養(yǎng)物吸收。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用外源性LAL增加營(yíng)養(yǎng)物吸收，如通過(guò)血清α生育酚、250Η維生素D、血清視黃醇、二去氫視黃醇或運(yùn)甲狀腺素蛋白的水平所測(cè)量。在一些實(shí)施方案中， 例如就WD和CESD或其它LAL缺乏而論，施用外源性LAL足以增加血清血紅蛋白水平(Hb)。在一個(gè)實(shí)施方案中，相比于在施用外源性LAL之前觀察到的情況，血紅蛋白水平增加至少約10%或約20%。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL可以使用使副作用減至最小的方法來(lái)施用。例如，施用外源性LAL可以使對(duì)外源性LAL的免疫反應(yīng)減至最小。LAL和包含外源性LAL的藥物組合物本發(fā)明涵蓋治療本文所述的任何LAL缺乏相關(guān)病癥和之前未提及、但將受益于所述治療的其它病狀。根據(jù)本發(fā)明采用的外源性LAL包括重組LAL，其可在任何有用的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生，所述蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于細(xì)胞培養(yǎng)物(例如，CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞)、細(xì)菌如大腸桿菌(E.coli)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)(例如，雞、鴨和火雞)、以及植物系統(tǒng)(例如，浮萍和煙草植物)。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及根據(jù)2006年10月3日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)7, 524，626 ；2007年10月10日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/973，853,2007年10月29日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/978,360以及2009年I月7日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?2/319，396產(chǎn)生的重組LAL，所述文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及如 Du 等.，(2005) Am.J.Hum.Genet.77:1061-1074 和 Du 等.，(2008) J.LipidRes.,49 =1646-1657中所述產(chǎn)生的重組LAL，所述文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。在一個(gè)有用的實(shí)施方案中，外源性LAL是例如，根據(jù)2011年4月23日提交的PCT/US2011/033699中所述的方法，在轉(zhuǎn)基因禽(例如轉(zhuǎn)基因雞)的輸卵管中產(chǎn)生，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。在一些實(shí)施方案中，重組LAL在禽類(lèi)細(xì)胞系中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，重組LAL在哺乳動(dòng)物(例如，人)細(xì)胞系中產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的外源性溶酶體酸性脂肪酶含有聚糖，所述聚糖具有實(shí)質(zhì)性N-乙?；咸前?GlcNAc)和甘露糖封端的N-連接型結(jié)構(gòu)。外源性LAL上的GlcNAc和甘露糖封端的聚糖可以被巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞特異性識(shí)別和內(nèi)化。甘露糖-6-磷酸(M6P)可以使蛋白質(zhì)靶向在牽涉于可通過(guò)外源性LAL施用治療的病癥中的細(xì)胞上表達(dá)的GlcNAc/甘露糖受體，也通常存在于根據(jù)本發(fā)明使用的外源性LAL上。通常，本文討論和描述的本發(fā)明的外源性LAL是人LAL。在一個(gè)實(shí)施方案中，外源性LAL具有Genbank RefSeq NM_000235.2)中提供的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，成熟外源性LAL具有下列氨基酸序列:SGGKLTAVDPETNMNVSE11SYffGFPSEEYLVETEDGYILCLNRIPHGRKNHSDKGPKPVVFLQHGLLADSSNWVTNLANSSLGFILADAGFDVWMGNSRGNTWSRKHKTLSVSQDEFWAFSYDEMAKYDLPASINFILNKTGQEQVYYVGHSQGTTIGFIAFSQIPELAKRIKMFFALGPVASVAFCTSPMAKLGRLPDHLIKDLF⑶KEFLPQSAFLKWLGTHVCTHVILKELCGNLCFLLCGFNERNLNMSRVDVYTTHSPAGTSVQNMLHWSQAVKFQKFQAFDWGSSAKNYFHYNQSYPPTYNVKDMLVPTAVWSGGHDWLADVYDVNILLTQITNLVFHESIPEffEHLDFIffGLDAPffRLYNKIINLMRKYQ(SEQ ID NO:1)在一些實(shí)施方案中，外源性LAL包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-378、SEQ ID NO:1的氨基酸3-378、SEQ ID NO:1的氨基酸6-378、或SEQ ID NO:1的氨基酸7-378。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL包含選自由以下組成的組的至少兩種多肽的混合物:SEQ ID N0:1的氨基酸 1_378、SEQ ID NO:1 的氨基酸 3-378、SEQ ID NO:1 的氨基酸 6-378 以及 SEQ ID NO:1的氨基酸7-378。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸1-378的多肽、含有SEQ ID NO:1的氨基酸3-378的多肽和含有SEQ ID NO:1的氨基酸6-378的多肽的混合物。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL包含與SEQ ID NO:1的氨基酸1-378、SEQID NO:1 的氨基酸 3-378、SEQ ID NO:1 的氨基酸 6-378、或 SEQ ID NO:1 的氨基酸 7-378相同的多肽。在其它實(shí)施方案中，外源性LAL包含與SEQ ID NO:1的氨基酸1_378、SEQ IDNO:1的氨基酸3-378、SEQ ID NO:1的氨基酸6-378、或SEQ ID NO:1的氨基酸7-378至少約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%或約 99%相同的多肽。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL包含作為SEQ ID NO:1的功能性片段或與SEQID NO:1的功能性片段至少約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約96 %、約97%、約98%或約99%相同的多肽。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL是2011年4月23日提交的PCT/US2011/033699中所述的重組LAL蛋白，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，不相同的氨基酸位置經(jīng)常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基取代為具有類(lèi)似化學(xué)特性(例如，電荷或或疏水性)的其它氨基酸殘基，并且因此不改變分子的功能特性。如果序列的保守取代不同，那么序列同一性百分率可以向上調(diào)節(jié)以校正取代的保守性質(zhì)。進(jìn)行這種調(diào)節(jié)的方式是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。保守取代的得分可以根據(jù)例如Meyers和Millers,Computer Applic.Biol.Sc1.4:11-17(1988)的算法來(lái)進(jìn)行計(jì)笪
ο“比較窗”是指如在約25與約4 00個(gè)位置之間、或約50至200個(gè)位置之間、或約100與150個(gè)位置之間的連續(xù)位置的區(qū)段，在所述區(qū)段上，序列可以在兩個(gè)序列最優(yōu)地比對(duì)后與相同數(shù)量的連續(xù)位置的參比序列進(jìn)行比較。用于比較的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域所熟知的。用于比較的序列的最優(yōu)比對(duì)可以例如通過(guò)以下來(lái)進(jìn)行:局部同源性算法(Smith 和 Waterman, Adv.Appl.Math.2:482(1981)、全局比對(duì)算法(Needleman 和 ffunsch,J.Mol.Biol.48:443 (1970)、相似性搜索方法(Pearson 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:2444 (1988) ；Altschul 等.，Nuc1.Acids Res.25:3389-402 (1997)、通常使用默認(rèn)設(shè)置的這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施(例如，Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, ffis.中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和BLAST)、或手動(dòng)比對(duì)和視覺(jué)檢查(例如參見(jiàn) Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等.(編著)，1994)。例如，BLAST蛋白質(zhì)搜索可以使用XBLAST程序，得分=50，字長(zhǎng)=3來(lái)進(jìn)行，以獲得與SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段超過(guò)80%相同的氨基酸序列。有用算法實(shí)施的一個(gè)實(shí)例是PILEUP。PILEUP使用漸進(jìn)性成對(duì)比對(duì)從一組相關(guān)序列來(lái)產(chǎn)生多重序列比對(duì)。還可以繪制樹(shù)形圖，所述樹(shù)形圖顯示用于產(chǎn)生比對(duì)的集群關(guān)系。PILEUP 使用 Feng 和 Doolittle，J.Mol.Evol.35:351-360(1987)的漸進(jìn)性比對(duì)方法的簡(jiǎn)化。使用的方法類(lèi)似于Higgins和Sharp，CABIOS 5:151-3 (1989)所描述的方法。多重比對(duì)程序開(kāi)始于兩個(gè)最類(lèi)似序列的成對(duì)比對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)比對(duì)的序列的集群。然后可以將所述集群與下一個(gè)最相關(guān)序列或比對(duì)序列的集群相比對(duì)。序列的兩個(gè)集群可以通過(guò)兩個(gè)單個(gè)序列的成對(duì)比對(duì)的簡(jiǎn)便延 伸來(lái)進(jìn)行比對(duì)。在每次迭代時(shí)包括越來(lái)越不相似的序列或序列集群的一系列所述成對(duì)比對(duì)產(chǎn)生最終比對(duì)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的外源性LAL多肽包括野生型序列的變異體。這些變異體屬于三種類(lèi)別中的一種或多種:取代、插入或缺失變異體。這些變異體可以是天然存在的等位基因或種間變異體，或它們可以通過(guò)編碼蛋白質(zhì)的DNA中的核苷酸的位點(diǎn)特異性誘變來(lái)制備。位點(diǎn)特異性誘變可以使用序列盒，或PCR誘變或其它本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來(lái)進(jìn)行，以便產(chǎn)生編碼變異體的DNA，并且此后在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)DNA。具有至多約100-150個(gè)氨基酸殘基的變異型靶蛋白片段可以通過(guò)活體外合成使用建立的技術(shù)來(lái)進(jìn)行制備。提供功能上類(lèi)似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域所熟知的(Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.89: 10915-10919 (1992))。氨基酸取代通常是單一殘基。插入通常是約I至約20個(gè)氨基酸，不過(guò)可以容忍顯著更長(zhǎng)的插入。缺失范圍為約I至約20個(gè)殘基，不過(guò)在一些情況下，缺失可以長(zhǎng)得多。取代、缺失以及插入或其任何組合可以用于得到最終衍生物。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL的比活性為至少約100U/mg。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL的比活性為至少約200U/mg。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL的比活性為至少約250U/mg。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL的比活性為約100至約1000U/mg。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL的比活性為約100至約500U/mg。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL的比活性為約100至約350U/mg。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL的比活性為約200至約350U/mg。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL的比活性為約250至約350U/mg。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL的比活性為約250U/mg。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL的比活性為約275U/mg。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL的比活性為約300U/mg。人LAL在它的氨基酸序列中具有6個(gè)潛在位點(diǎn)用于N-連接型糖基化:Asn36、Asn72、AsnlOl、Asnl61、Asn273以及Asn321，如SEQ ID N0:1中所示。在一些實(shí)施方案中，至少1、2、3、4或5個(gè)N-連接型糖基化位點(diǎn)被糖基化。在一些實(shí)施方案中，所有6個(gè)糖基化位點(diǎn)都被糖基化。在一些實(shí)施方案中，Asn36、Asnl01、Asnl61、Asn273 以及Asn321 被糖基化。在一些實(shí)施方案中，Asn36、Asnl01、Asnl61、Asn273以及Asn321被糖基化，并且Asn72未糖基化。在一些實(shí)施方案中，N-聚糖結(jié)構(gòu)包含具有N-乙?；咸前?GlcNAc)、甘露糖和/或甘露糖-6-磷酸(M6P)的二、三以及四觸角結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL在AsnlOl、Asnl61以及Asn273處包含M6P-修飾的N-聚糖。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL不包含O-連接型聚糖。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL不包含唾液酸。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL具有2011年4月23日提交的PCT/US2011/033699中所述的糖基化型態(tài)，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL的分子量是約55kD。在某些實(shí)施方案中，受試者可以用例如在載體中的編碼外源性LAL的核酸分子進(jìn)行治療。編碼多肽的核酸的劑量在每名患者約IOng至lg、IOOng至100mg、ly g至IOmg或30-300 μ g DNA范圍內(nèi)。感染性病毒載體的劑量在每個(gè)劑量10-100或更多個(gè)病毒粒子之間變化。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，外源性LAL在包括以下的治療方法中施用:(1)用表達(dá)LAL或其活性片段、變異體、或衍生物的核酸(例如載體)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染可植入的宿主細(xì)胞；以及(2)將轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞植入到哺乳動(dòng)物中。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將可植入的宿主細(xì)胞從哺乳動(dòng)物中移出、短暫培養(yǎng)、用分離的編碼外源性LAL的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染、并且再植入到移出它的同一哺乳動(dòng)物中。所述細(xì)胞可以但不要求從它所植入的同一部位處移出。所述實(shí)施方案，有時(shí)稱為離體基因療法，可以持續(xù)一段有限的時(shí)間提供外源性LAL多肽的連續(xù)供應(yīng)。盡管本發(fā)明中提供的治療蛋白，即重組LAL，有可能以原始形式施用，但是優(yōu)選的是將治療蛋白作為藥物制劑的一部分施用。因此本發(fā)明還提供藥物制劑，所述制劑包含禽類(lèi)得到的糖基化治療蛋白或其藥學(xué)上可接受的衍生物連同其一種或多種藥學(xué)上可接受的載劑以及任選地其它治療和/或預(yù)防成分；和施用所述藥物制劑 的方法。本發(fā)明還提供藥物制劑，所述制劑包含哺乳動(dòng)物得到的糖基化治療蛋白或其藥學(xué)上可接受的衍生物連同其一種或多種藥學(xué)上可接受的載劑，以及任選地其它治療和/或預(yù)防成分；和施用所述藥物制劑的方法。載劑在與制劑的其它成分可相容并且對(duì)其接受者無(wú)害的意義上必須是“可接受的”。使用本發(fā)明的藥物組合物治療患者的方法(例如，施用的藥物蛋白的量、施用頻率以及治療持續(xù)時(shí)間)可以使用熟悉本領(lǐng)域的醫(yī)生已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定。藥物制劑包括適于口服、直腸、經(jīng)鼻、局部(包括頰和舌下)、陰道或腸胃外的那些制劑。藥物制劑包括適于通過(guò)注射(包括肌肉內(nèi)、皮下以及靜脈內(nèi)施用)來(lái)施用的那些制齊U。藥物制劑還包括通過(guò)吸入或吹入施用的那些制劑。適當(dāng)時(shí)，制劑可以便利地以不連續(xù)劑量單位形式呈現(xiàn)，并且可以通過(guò)藥劑學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法來(lái)制備。制備藥物制劑的方法通常包括下列步驟:使治療蛋白與液體載劑或細(xì)粉狀固體載劑或兩者相締合，并且然后必要時(shí)，使產(chǎn)物成形為所需的制劑。適于口服施用的藥物制劑可以便利地作為以下形式呈現(xiàn):不連續(xù)單位，如各自含有預(yù)定量的活性成分的膠囊、扁囊或片劑；作為粉末或顆粒；作為溶液；作為懸浮液；或作為乳液?；钚猿煞诌€可以作為大丸劑、舐劑或糊劑呈現(xiàn)。用于口服施用的片劑和膠囊可以含有常規(guī)賦形劑，如粘合劑、填料、潤(rùn)滑劑、崩解劑或潤(rùn)濕劑。片劑可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法來(lái)涂覆包衣?？诜后w制劑可以呈例如水性或油性懸浮液、溶液、乳液、糖漿或酏劑的形式，或可以作為干燥產(chǎn)物呈現(xiàn)，以在使用之前用水或其它適合的媒介物復(fù)原。所述液體制劑可以含有常規(guī)添加劑，如懸浮劑、乳化劑、非水性媒介物(可以包括可食用油)或防腐劑。本發(fā)明的治療蛋白還可以被配制用于腸胃外施用(例如通過(guò)注射，例如團(tuán)注或連續(xù)輸注)，并且可以與添加的防腐劑一起以單位劑型在安瓿、預(yù)填充注射器、小體積輸注液中或在多劑量容器中呈現(xiàn)。治療蛋白可以例如通過(guò)皮下注射、肌肉內(nèi)注射和靜脈內(nèi)(IV)輸注或注射來(lái)進(jìn)行注射。在一個(gè)實(shí)施方案中，外源性LAL通過(guò)任何有用的方法通過(guò)IV輸注來(lái)靜脈內(nèi)施用。在一個(gè)實(shí)例中。外源性LAL可以通過(guò)外周管線通過(guò)靜脈內(nèi)輸注施用。在另一實(shí)例中，外源性LAL可以通過(guò)外周插入的中心導(dǎo)管通過(guò)靜脈內(nèi)輸注施用。在另一實(shí)例中，夕卜源性LAL可以通過(guò)靜脈內(nèi)輸注來(lái)施用，所述靜脈內(nèi)輸注由附接至靜脈血管接入端口的攜帶式輸注機(jī)來(lái)促進(jìn)。在一個(gè)靜脈內(nèi)輸注的實(shí)施方案中，取決于待輸注的藥劑的量和患者之前的輸注相關(guān)的反應(yīng)歷史，藥劑在I至8小時(shí)的一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行施用，如由熟悉本領(lǐng)域的醫(yī)生所確定。在另一實(shí)施方案中，外源性LAL通過(guò)IV注射靜脈內(nèi)施用。在另一實(shí)施方案中，夕卜源性LAL可以經(jīng)由腹膜內(nèi)注射施用。在另一實(shí)施方案中，外源性LAL經(jīng)由治療蛋白的藥學(xué)上可接受的膠囊來(lái)施用。例如，膠囊可以是腸衣包覆的明膠膠囊。在一些實(shí)施方案中，治療蛋白通過(guò)輸注施用，并且輸注可以在一段延長(zhǎng)的時(shí)間段例如30分鐘至10小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。因此,輸注可以在例如約I小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)或約5小時(shí)的一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。輸注還可以以多種速率來(lái)進(jìn)行。因此，例如，輸注速率可以為約ImL/小時(shí)至約20mL/小時(shí)。在一些實(shí)施方案中，輸注速率為5mL至IOmL/小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸注速率為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或20mL/小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸注速率為0.1至5mg/kg/h。在一個(gè)實(shí)施方案中，輸注速率為約 0.1、約 0.2、約 0.3、約 0.5、約 1.0、約 1.5、約 2.0 或約 3mg/kg/h。治療蛋白可以呈這些形式，如油性或水性媒介物中的懸浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制試劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。治療蛋白可以呈粉末形式，所述形式通過(guò)無(wú)菌固體的無(wú)菌分離或溶液的凍干而獲得，以用于在使用之前用適合的媒介物例如無(wú)菌、無(wú)熱原質(zhì)水進(jìn)行復(fù)原。對(duì)于局部施用至表皮，治療蛋白可以配制成藥膏劑、乳膏劑或洗劑或透皮貼片。藥膏劑和乳膏劑可以例如用水性或油性基劑在添加適合的增稠劑和/或膠凝劑的情況下進(jìn)行配制。洗劑可以用水性或油性基劑來(lái)進(jìn)行配制，并且一般還含有一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。適于在口中局部施用的制劑包括錠劑，其在調(diào)味的基劑(通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)中包含活性成分；香錠，其在惰性基劑如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中包含活性成分；以及漱口劑，其在適合的液體載劑中包含活性成分。將適于直腸施用的其中載劑是固體的藥物制劑最優(yōu)選地表示為單位劑量栓劑。適合的載劑包括可可脂和本領(lǐng)域通常使用的其它材料，并且栓劑可以便利地通過(guò)下列方式形成:混合活性化合物與軟化的或熔融的載劑，然后冷卻并在模具中成型。適于陰道施用的制劑可以呈現(xiàn)為子宮托、止血栓、乳膏劑、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧齊IJ，其除了活性成分還含有如本領(lǐng)域已知適當(dāng)?shù)倪@些載劑。對(duì)于鼻內(nèi)施用，本發(fā)明的治療蛋白可以用作液體噴霧劑或可分散粉末或滴劑的形式。
滴劑可以用水性或非水性基劑來(lái)進(jìn)行配制，所述基劑還包含一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮液。液體噴霧劑宜從加壓包遞送。對(duì)于吸入施用，根據(jù)本發(fā)明的治療蛋白可以便利地從吹入器、噴霧器或加壓包或者遞送氣霧劑噴霧的其它便利構(gòu)件遞送。加壓包可以包含適合的推進(jìn)劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適合的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單位可以通過(guò)提供閥以遞送計(jì)量的量來(lái)確定。對(duì)于通過(guò)吸入或吹入施用，根據(jù)本發(fā)明的治療蛋白可以采取干粉組合物的形式，所述形式例如化合物與適合的粉末基劑例如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末組合物可以以單位劑型形式在例如膠囊或藥筒，或者例如在吸入器或吹入器輔助下可以施用粉末的明膠或泡罩袋中呈現(xiàn)。當(dāng)需要時(shí)，可以采用經(jīng)過(guò)適配以便提供活性成分的持續(xù)釋放的上述制劑。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物還可以含有其它活性成分，如抗微生物劑或防腐劑。在一些實(shí)施方案中，外源性LAL在藥物組合物中的濃度為約0.5至約10mg/ml。在一些實(shí)施方案中，LAL的濃度為約I至約5mg/mL。在一些實(shí)施方案中，LAL的濃度為約1、約
1.5、約 2、約 2.5、約 3、約 3.5、約 4、約 4.5、約 5、約 5.5、約 6、約 6.5 或約 7.5mg/mL。在一些實(shí)施方案中，包含外源性LAL的藥物組合物還包含緩沖劑。示例性緩沖劑包括乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽以及谷氨酸鹽緩沖劑。示例性緩沖劑還包括檸檬酸鋰、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸鈣、乳酸鋰、乳酸鈉、乳酸鉀、乳酸鈣、磷酸鋰、磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈣、馬來(lái)酸鋰、馬來(lái)酸鈉、馬來(lái)酸鉀、馬來(lái)酸鈣、酒石酸鋰、酒石酸鈉、酒石酸鉀、酒石酸鈣、琥珀酸鋰、琥珀酸鈉、琥珀酸鉀、琥珀酸鈣、乙酸鋰、乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸鈣、以及其混合物。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑是二水合檸檬酸三鈉。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑是單水合檸檬酸。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含檸檬酸三鈉脫水物和單水合檸檬酸。

在一些實(shí)施方案中，包含外源性LAL的藥物組合物還包含穩(wěn)定劑。示例性穩(wěn)定劑包括白蛋白、海藻糖、砂糖、氨基酸、多元醇、環(huán)糊精，如氯化鈉、氯化鎂以及氯化鈣等鹽，凍干保護(hù)劑以及其混合物。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含人血清白蛋白。在一個(gè)特定實(shí)例中，如本文公開(kāi)產(chǎn)生的重組人LAL被用于藥物制劑中，其中每I毫升含有外源性LAL(例如，2mg LAL)、檸檬酸三鈉脫水物(例如，13.7mg)、單水合檸檬酸(例如，1.57mg)以及人血清白蛋白(例如，IOmg),并且被配制成酸性pH,如5.9±0.1。本發(fā)明涵蓋有利于外源性LAL攝取到相關(guān)器官和組織的溶酶體中的任何施用途徑。
實(shí)施例下列特定實(shí)施例意欲說(shuō)明本發(fā)明，并且不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1通過(guò)施用重組LAL來(lái)治療早發(fā)性LAL缺乏(沃爾曼氏病)在15周齡時(shí)，男性嬰兒因?yàn)槌錾笤鲋夭涣?出生體重:3.88kg)而住院。嬰兒呈現(xiàn)有嘔吐、喂養(yǎng)問(wèn)題、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)差、腹瀉、腹脹和貧血增加?；颊弑辉\斷患有沃爾曼氏病。在初始身體檢查時(shí)，患者體重5.62kg，使他處于年齡標(biāo)準(zhǔn)體重的第5個(gè)百分位數(shù)以下。在從15周齡初始檢查并且在19周齡初始輸注之前的接下來(lái)的4周中，患者未能增重。估計(jì)的生長(zhǎng)速度經(jīng)過(guò)計(jì)算小于年齡標(biāo)準(zhǔn)體重的第I個(gè)百分位數(shù)。腹部明顯膨脹，具有明顯的肝腫大和脾腫大。腹部超聲和CT掃描證實(shí)肝脾腫大和雙邊對(duì)稱增大的伴有鈣化的腎上腺。血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平升高到119U/L(正常10-50U/L)，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)也升高到216U/L (正常10-45U/L)。在治療起始之前，血清鐵蛋白(炎癥標(biāo)記物)為約1，500yg/L(正常7-144 μ g/L)。患者在治療前持續(xù)貧血，血紅蛋白值的范圍在7.2與
8.3g/dL 之間。在19周齡，以0.2mg/kg的初始計(jì)量起始每周一次IV輸注rhLAL(SBC-102)。在SBC-102輸注之前患者用lmg/kg的苯海拉明預(yù)治療約90分鐘，以抵消潛在的輸注反應(yīng)。輸注持續(xù)時(shí)間為約4小時(shí)。輸注耐受良好，并且患者未經(jīng)歷任何不良事件或輸注相關(guān)反應(yīng)。在初始輸注七天后，對(duì)患者施用第二次輸注?；颊弑唤o予0.3mg/kg的SBC-102持續(xù)約4小時(shí)，并且耐受輸注，而未展現(xiàn)出任何不良事件的跡象。在開(kāi)始治療兩周內(nèi)，患者展現(xiàn)出總體健康狀況顯著改善，包括機(jī)敏性和反應(yīng)性增力口。腹瀉和嘔吐穩(wěn)定?；颊唛_(kāi)始增重，并且展現(xiàn)出血清轉(zhuǎn)氨酶(例如，AST和ALT)明顯降低，基本上到達(dá)正常水平(圖1A和1B)。患者的生長(zhǎng)速度快速正?；?圖3和4)。腹脹降低，對(duì)應(yīng)的腹圍減小。肝功能檢驗(yàn)顯示持續(xù)改善(圖1A和1B)。在第三次就診時(shí)，患者接受0.5mg/kg的SBC-102。輸注持續(xù)耐受良好。臨床狀態(tài)顯示持續(xù)改善，在7天內(nèi)增重150g，并且從治療起始時(shí)起，臂圍增加了 1.5cm(圖3和4)。肝臟檢驗(yàn)是穩(wěn)定的，血紅蛋白水平增加(ΙΟ-llg/dL)，并且鐵蛋白水平持續(xù)降低(圖2)。在治療之前堿性磷酸酶在低正常范圍內(nèi):137U/L (正常110-300U/L)，并且隨著治療增加(204U/L)。SBC-102施用的這種作用與臨床前疾病模型中獲得的觀察情況一致。開(kāi)始第四次輸注，患者開(kāi)始接受每周劑量1.0mg/kg。在治療起始兩個(gè)月后，患者的生長(zhǎng)實(shí)質(zhì)性改善，估計(jì)的生長(zhǎng)速度接近第95個(gè)百分位數(shù)。生長(zhǎng)的這一增加導(dǎo)致在63天中增重1.25kg或2.79磅，體重為7.21kg，使他處于年齡標(biāo)準(zhǔn)體重的30百分位數(shù)(圖3和4)。AST和ALT水平都在第一次輸注后快速降低。

治療三個(gè)月后，AST和ALT正常。除了肝功能改善以外，還觀察到鐵蛋白顯著降低(圖 2)。在4個(gè)月的治療過(guò)程中，患者的GI癥狀消退，并且患者的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)優(yōu)良。患者持續(xù)增重(圖3和4)并且證實(shí)了正常健康嬰兒的身體體征?；颊叱掷m(xù)耐受輸注，而未展現(xiàn)出任何輸注反應(yīng)或其它副作用。患者作為門(mén)診病人接受了第21個(gè)劑量1.0mg/kg。實(shí)施例2用于早發(fā)性LAL缺乏的研究設(shè)計(jì)通過(guò)每周IV輸注施用SBC-102，即在轉(zhuǎn)基因雞中產(chǎn)生的rhLAL。所述研究被設(shè)計(jì)成評(píng)估通過(guò)每周IV輸注施用SBC-102的兩個(gè)給藥方案的安全性、耐受性以及功效。因而，本研究中的主要結(jié)果變量決定了 SBC-102在由于LAL缺乏而患有生長(zhǎng)不足的兒童中的安全性和耐受性，并且包括:生命體征和身體檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)果；臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)；抗藥物抗體檢驗(yàn)；以及并行藥劑的使用?？紤]到生長(zhǎng)不足是LAL缺乏/沃爾曼表型的普遍臨床特征，因此對(duì)此病癥的成功治療應(yīng)能夠解決受LAL缺乏影響的兒童中所見(jiàn)的生長(zhǎng)不足。評(píng)估與兒童的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)直接相關(guān)的參數(shù)作為次要或探索性目標(biāo):例如體重的增量生長(zhǎng)速度、體重增加以及線性生長(zhǎng)速率。本研究還調(diào)查了 SBC-102對(duì)藥效學(xué)生物標(biāo)記物；肝臟和脾臟大??；淋巴結(jié)??；血紅蛋白和血小板；肝功能和營(yíng)養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)；腹圍、中上臂圍以及頭圍的影響。本研究還描述了 SBC-102在由于LAL缺乏而患有生長(zhǎng)不足的兒童中的初步藥物代謝動(dòng)力學(xué)，包括血衆(zhòng)Cmax和估計(jì)的清除率。表1:評(píng)價(jià)方案:篩選直至第24周
權(quán)利要求
1.一種治療患有溶酶體酸性脂肪酶(LAL)缺乏的人患者的方法，其包括向所述人患者施用重組人LAL，其中所述施用足以改善所述人患者的肝功能。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述施用足以使肝臟檢驗(yàn)正?；?br> 3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述施用足以使肝腫大減至最小。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以降低肝臟大小。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以降低血清肝轉(zhuǎn)氨酶水平。
6.如權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以降低脂質(zhì)水平。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以降低甘油三酯水平。
8.如權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以降低膽固醇酯水平。
9.一種增加患有LAL缺乏的人患者的LAL活性的方法，所述方法包括將重組人LAL施用至所述患者，其中所述施用使得所述患者的LAL活性增加。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述施用足以將所述患者的LAL活性增加至少大約35pmol/mg/ 分鐘。
11.一種在需要的患者中治療LAL缺乏相關(guān)的病狀的方法，其包括每5天I次至每30天I次向所述患者施用治療有效量的外源LAL蛋白。
12.—種在需要的患者中治療LAL缺乏相關(guān)的病狀的方法，其包括每7天I次至每14天I次向所述患者施用0.1 50mg/kg的劑量的外源LAL蛋白。
13.一種在需要的患者中治療LAL缺乏相關(guān)的病狀的方法，其包括向所述患者施用0.1 50mg/kg的劑量的外源LAL蛋白。
14.一種在需要的人患者中治療沃爾曼氏病或CESD的方法，其包括每5天I次至每30天I次向所述患者施用約0.1 50mg/kg的劑量的外源LAL蛋白。
15.如權(quán)利要求11 14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述外源LAL是重組人LAL。
16.如權(quán)利要求11 15中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述外源LAL包含至少一個(gè)甘露糖或至少一個(gè)甘露糖-6-磷酸。
17.如權(quán)利要求1 12或14 16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述LAL以約0.10 約5.0mg/kg的量施用。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述量是約0.3mg/kg。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述量是約0.35mg/kg。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述量是約1.0mg/kg。
21.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述量是約3.0mg/kg。
22.如權(quán)利要求1 21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用約每周進(jìn)行一次。
23.如權(quán)利要求1 21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用約每?jī)芍苓M(jìn)行一次。
24.如權(quán)利要求1 23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以將血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平從治療前水平降低至少50%。
25.如權(quán)利要求1 24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以將血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平從治療前水平降低至少50%。
26.如權(quán)利要求1 25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以使LAL半衰期(t1/2)少于約17分鐘。
27.如權(quán)利要求1 26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以使LAL半衰期(t1/2)為約 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16 或 17 分鐘。
28.如權(quán)利要求1 27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以使Cniax為每mL血清至少約200ng。
29.如權(quán)利要求1 28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以使Cniax為每mL血清約200ng至每mL血清800ng之間。
30.如權(quán)利要求1 29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述LAL被成纖維細(xì)胞內(nèi)化。
31.如權(quán)利要求1 30中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述LAL被巨噬細(xì)胞內(nèi)化。
32.如權(quán)利要求1 31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述LAL由轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)產(chǎn)生。
33.如權(quán)利要求1 31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述LAL由哺乳動(dòng)物細(xì)胞系產(chǎn)生。
34.如權(quán)利要求3 3所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是人細(xì)胞系。
35.如權(quán)利要求1 34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用是靜脈內(nèi)的。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述施用是通過(guò)輸注的。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述輸注為約2小時(shí)至約4小時(shí)。
38.如權(quán)利要求36或37所述的方法,其中所述輸注的速率是約0.lmg/kg/h至約4mg/kg/h0
39.如權(quán)利要求1 38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用使對(duì)重組人LAL的免疫反應(yīng)減至最小。
40.如權(quán)利要求1 39中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用減輕淋巴結(jié)病。
41.如權(quán)利要求1 40中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以降低血清鐵蛋白水平。
42.如權(quán)利要求1 41中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以增加血清血紅蛋白水平。
43.如權(quán)利要求1 42中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以增加兒童患者的生長(zhǎng)
44.如權(quán)利要求1 43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以增加體重增加的速率。
45.如權(quán)利要求1 44中任一項(xiàng)所述的方法，其中施用后所述患者的生長(zhǎng)速率為施用前所述患者的生長(zhǎng)速率的至少約2倍。
46.如權(quán)利要求1 45中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用足以增加脂肪組織。
47.如權(quán)利要求1 46中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者小于I歲。
48.如權(quán)利要求1 46中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者至少I(mǎi)歲。
49.如權(quán)利要求1 48中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者已被診斷為沃爾曼氏病。
50.如權(quán)利要求1 49中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者已被診斷為膽固醇酯貯積病(CESD)。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述CESD是在10歲前被診斷的。
52.如權(quán)利要求1 51中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括施用第二治療劑。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述第二治療劑是降膽固醇藥物。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述第二治療劑是斯達(dá)汀。
55.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述第二治療劑是依澤替米貝。
56.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述第二治療劑減少LAL的免疫原性。
57.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述第二治療劑是抗組胺劑。
58.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述第二治療劑是免疫抑制劑。
59.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述抗組胺劑是在LAL施用之前施用的藥物有效劑量的苯海拉明。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述苯海拉明的劑量為約I 約5mg/kg。
61.如權(quán)利要求59或60所述的方法，其中所述苯海拉明在施用LAL之前約20 約90分鐘施用。
62.如權(quán)利要求1 61中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括完成評(píng)價(jià)以監(jiān)控患者的臨床和病理學(xué)表現(xiàn)。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其中所述評(píng)價(jià)為:脂質(zhì)分析、胸部X-射線、肝功能檢驗(yàn)、糞便分類(lèi)檢查、血漿甲羥戊酸分析、免疫原性檢驗(yàn)、血漿溶酶體酸性脂肪酶分析、殼三糖苷酶分析、門(mén)脈高血壓分析、人體測(cè)量、肝 或脾的分析、胃腸道成像、或它們的組合。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述成像技術(shù)是超聲波、核磁共振成像或核磁共振光譜法。
65.—種組合物，用于根據(jù)權(quán)利要求1 64中任一項(xiàng)所述的方法施用LAL。
全文摘要
本發(fā)明提供LAL缺乏(例如沃爾曼氏病，CESD)的治療，所述治療包括以有效給藥頻率向哺乳動(dòng)物施用治療有效量的溶酶體酸性脂肪酶。還提供了在患有LAL缺乏的人患者中改善生長(zhǎng)和肝功能、增加LAL組織濃度和增加LAL活性的方法。
文檔編號(hào)A61K38/46GK103200958SQ201180053951
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者A·奎因 申請(qǐng)人:辛那杰瓦生物制藥股份有限公司