本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)和分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)七種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑的免疫電化學(xué)傳感器及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

β-腎上腺素受體激動(dòng)劑，簡(jiǎn)稱β-激動(dòng)劑，是動(dòng)物源性食品中檢出率最高、危害最嚴(yán)重的化學(xué)性殘留危害物，其中最著名的就是克倫特羅(clenbuterol,CL)，俗稱“瘦肉精”。上世紀(jì)80年代，美國脂胺公司的科研人員意外發(fā)現(xiàn)，“瘦肉精”能增強(qiáng)動(dòng)物脂肪分解，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，大大縮短肉品上市周期，顯著提高胴體瘦肉率、飼料回報(bào)率和經(jīng)濟(jì)效益。隨后在世界各地迅速推廣，80年代后期，傳入我國并在許多地區(qū)的飼料加工企業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)推廣使用，很快成為養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)用最廣泛的“添加劑”。

“瘦肉精”除克倫特羅外，還包括沙丁胺醇(salbutamol,SAL)、萊克多巴胺(ractopamine,RAC)等20多個(gè)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相類似的化合物。這類化合物進(jìn)入體內(nèi)后選擇性作用于腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致人體產(chǎn)生低敏感現(xiàn)象，哮喘發(fā)生率和發(fā)病程度升高；還可導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂，誘發(fā)染色體畸變及惡性腫瘤，嚴(yán)重時(shí)可致人死亡。因此我國和世界上大多數(shù)國家都明文禁止“瘦肉精”用作飼料添加劑。

目前，β-激動(dòng)劑類獸藥殘留的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)和熒光免疫法(FIA)等。

色譜法是β-激動(dòng)劑獸藥殘留的主要檢測(cè)方法，但是色譜法檢測(cè)成本高、操作復(fù)雜、大量的陰性樣品重復(fù)檢測(cè)；而酶聯(lián)免疫法具有特異性強(qiáng)、樣品前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但特異性強(qiáng)的特點(diǎn)同時(shí)也決定了它的致命缺點(diǎn)：一種酶聯(lián)免疫試劑盒或試紙條只能檢測(cè)一種獸藥殘留，而無法檢測(cè)其它的同類獸藥殘留，這就是容易出現(xiàn)漏檢的原因(如2011年轟動(dòng)全國的“雙匯瘦肉精”事件)；此外，隨著β-激動(dòng)劑多種替代品的出現(xiàn)，如果進(jìn)行完全檢測(cè)，一個(gè)樣品需要使用多種檢測(cè)產(chǎn)品，大大提高了檢測(cè)成本和工作時(shí)間，失去了快速篩選的意義。

多殘留免疫分析能同時(shí)檢測(cè)一類藥物殘留，其低成本、高通量、快速現(xiàn)場(chǎng)的優(yōu)點(diǎn)是現(xiàn)有的色譜法和特異性免疫方法無法比擬的，是未來食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)之一，逐漸引起重視。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)七種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑的免疫電化學(xué)傳感器及其制備方法和應(yīng)用，所述電化學(xué)傳感器基于寬譜特異性抗體抗體的交叉反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)七種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑的檢測(cè)。

為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種檢測(cè)七種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑的免疫電化學(xué)傳感器，包括基底玻碳電極，和依次涂布在所述基底玻碳電極表面的石墨烯/殼聚糖混合膜層、檢測(cè)層，所述檢測(cè)層的材料為β-激動(dòng)劑通用半抗原4-(4-(2-叔丁胺基)1-羥乙基)苯基丁酸(TBPBA)溶液，β-激動(dòng)劑通用半抗原4-(4-(2-叔丁胺基)1-羥乙基)苯基丁酸的結(jié)構(gòu)式為

作為改進(jìn)的是，所述檢測(cè)曾上設(shè)有封閉層。

作為改進(jìn)的是，所述封閉層的材料為牛血清蛋白溶液。

上述檢測(cè)七種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑的免疫電化學(xué)傳感器的制備方法為，在潔凈的基底玻碳電極表面滴涂石墨烯/殼聚糖分散液，晾干形成膜層，然后在膜層表面滴涂4-(4-(2-叔丁胺基)1-羥乙基)苯基丁酸溶液，晾干得免疫電化學(xué)傳感器。

作為改進(jìn)的是，所述石墨烯/殼聚糖分散液的體積為2-20μl，濃度為5mg/ml。

作為改進(jìn)的是，所述4-(4-(2-叔丁胺基)1-羥乙基)苯基丁酸溶液的濃度為0.2mg/ml。

上述一種檢測(cè)七種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑的免疫電化學(xué)傳感器在食品中β-腎上腺素受體激動(dòng)劑檢測(cè)中的應(yīng)用。

作為改進(jìn)的是，所述所述β-腎上腺素受體激動(dòng)劑為克倫特羅、沙丁胺醇、馬布特羅、溴布特羅、西布特羅、妥布特羅或特步他林。

有益效果

本發(fā)明的傳感器以K₃[Fe(CN)₆]為探針，基于抗TBPBA-BSA抗體對(duì)β-激動(dòng)劑的交叉免疫反應(yīng)，能實(shí)現(xiàn)對(duì)克倫特羅、沙丁胺醇、馬布特羅、溴布特羅、西布特羅、妥布特羅和特步他林七種β-激動(dòng)劑的檢測(cè)。所述的傳感器快速、高效、靈敏度高，并且所述的方法具有較低的檢出限(0.3ng/ml～0.5ng/ml)和較寬的線性范圍(50～5000ng/ml或10～7000ng/ml)。本發(fā)明免疫電化學(xué)傳感器檢測(cè)前樣品處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)多殘留檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)用價(jià)值極強(qiáng)，市場(chǎng)潛力巨大。

附圖說明

圖1為通用半抗原TBPBA的合成路線圖。

圖2為石墨烯/殼聚糖/TBPBA修飾的免疫電化學(xué)傳感器在含有效價(jià)濃度為1：6400的β-激動(dòng)劑寬譜特異性抗體和不同濃度的游離的克倫特羅(a)6000ng/ml，(b)5000ng/ml，(c)4000ng/ml，(d)3000ng/ml，(e)1000ng/ml，(f)500ng/ml，(g)100ng/ml，(h)50ng/ml，(i)0的孵育液中孵育后，在2mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]的磷酸緩沖溶液中的DPV曲線圖。

圖3為響應(yīng)電流的變化ΔI與克倫特羅濃度的工作曲線圖。

圖4為石墨烯/殼聚糖/TBPBA修飾的免疫電化學(xué)傳感器在含有效價(jià)濃度為1：6400的β-激動(dòng)劑寬譜特異性抗體和不同濃度的游離的沙丁胺醇(a)7000ng/ml，(b)5000ng/ml，(c)2000ng/ml，(d)1000ng/ml，(e)100ng/ml，(f)10ng/ml，(g)0ng/ml的孵育液中孵育后，在2mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]的磷酸緩沖溶液中的DPV曲線圖。

圖5為響應(yīng)電流的變化ΔI與沙丁胺醇濃度的線性曲線圖。

圖6為石墨烯/殼聚糖/TBPBA修飾的免疫電化學(xué)傳感器在含有效價(jià)濃度為1：6400的β-激動(dòng)劑寬譜特異性抗體和不同濃度的游離的馬布特羅(a)5000ng/ml，(b)4000ng/ml，(c)3000ng/ml，(d)2000ng/ml，(e)1000ng/ml，(f)500ng/ml，(g)100ng/ml，(h)50ng/ml，(i)0ng/ml的孵育液中孵育后，在2mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]的磷酸緩沖溶液中的DPV曲線圖。

圖7為響應(yīng)電流的變化ΔI與馬布特羅濃度的線性曲線圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1β-激動(dòng)劑通用半抗原4-(4-(2-叔丁胺基)1-羥乙基)苯基丁酸(TBPBA)的合成

(1)芐基叔丁胺(NS-0)

將4.8ml苯甲醛溶解于無水乙醇中，再加入5ml叔丁胺，室溫反應(yīng)2h后再加入1.8g硼氫化鈉反應(yīng)1h。用二氯甲烷萃取后經(jīng)過硅膠柱純化，得到產(chǎn)物NS-06.2g。

(2)4-(4-溴乙酰基)苯基丁酸(NS-1)

將8.56g無水氯化鋁溶解于二氯甲烷中，加入1.64ml溴乙酰溴反應(yīng)0.5h，再加入2.19g4-苯基丁酸反應(yīng)3-5h。用二氯甲烷萃取后蒸去溶劑，得到產(chǎn)物3.5g。

(3)4-(4-溴乙?；?苯基丁酸甲酯(NS-2)

將2.85g NS-1溶解于甲醇中，加入濃硫酸加熱回流3h。蒸去甲醇后用二氯甲烷萃取，除去溶劑并純化，得到產(chǎn)物2.6g。

(4)4-(4-(2-芐基叔丁胺基)乙?；?苯基丁酸甲酯(NS-3)

將203mg NS-0和337mg NS-2溶解于乙腈中，加入314mg無水碳酸鉀反應(yīng)過夜。加水后用二氯甲烷萃取，經(jīng)過硅膠柱純化，得到產(chǎn)物187mg。

(5)4-(4-(2-芐基叔丁胺基)1-羥乙基)苯基丁酸甲酯(NS-4)

將74mg NS-3溶解于甲醇中，加入11mg硼氫化鈉反應(yīng)1h。加酸后用二氯甲烷萃取，經(jīng)過硅膠柱純化，得到產(chǎn)物41mg。

(6)4-(4-(2-芐基叔丁胺基)1-羥乙基)苯基丁酸(NS-5)

將45mg NS-4溶解于甲醇中，加入氫氧化鈉反應(yīng)過夜。加酸后用二氯甲烷萃取，經(jīng)過硅膠柱純化，得到產(chǎn)物39mg。

(7)4-(4-(2-叔丁胺基)1-羥乙基)苯基丁酸(TBPBA)

將37mg NS-5和適量鈀碳加入到盛有甲醇的反應(yīng)瓶中，置換空氣后反應(yīng)2h。過濾后過硅膠柱純化，得終產(chǎn)物，即通用半抗原TBPBA 39mg。

實(shí)施例2用半抗原-牛血清白蛋白(TBPBA-BSA)偶聯(lián)物的制備

將0.2mmol TBPBA溶于無水乙醇中，加入等量N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-[3-(二甲氨基)丙基]-3乙基碳二亞胺碳酸鹽(EDC)，室溫下反應(yīng)3～5h。將上述反應(yīng)液緩慢加入到5～10ml含有5～10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的磷酸緩沖溶液中，室溫反應(yīng)過夜。將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖溶液透析3～6次，冷凍干燥即可得到TBPBA-BSA偶聯(lián)物凍干粉。

實(shí)施例3寬譜特異性抗體(抗TBPBA-BSA抗體)的制備

用TBPBA-BSA偶聯(lián)物作為免疫原免疫體重約2kg的健康大白兔。首次免疫時(shí)將0.25mg免疫原與等量弗氏完全佐劑混合并充分乳化，背部皮下多點(diǎn)注射。兩周后用同樣劑量免疫原與等量弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化并進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每?jī)芍芗訌?qiáng)免疫一次，共加強(qiáng)三次。最后一次免疫10天后對(duì)大白兔進(jìn)行頸靜脈采血，放在4℃環(huán)境下靜置30min，再用硫酸銨多級(jí)沉淀法進(jìn)行純化，即可得到抗TBPBA-BSA多克隆抗體。

實(shí)施例4免疫電化學(xué)傳感器的制備

將直徑為3mm的玻碳電極依次用直徑為0.3μm和0.05μm的Al₂O₃拋光粉打磨，依次用無水乙醇-蒸餾水、蒸餾水超聲清洗5min，再用蒸餾水沖洗干凈。在電極上滴涂4μl石墨烯/殼聚糖(濃度為5mg/ml)分散液，然后將2μl的通用半抗原TBPBA溶液(濃度為0.2mg/ml)滴涂于電極表面，室溫下晾干。最后將電極浸泡在質(zhì)量百分為濃度5％的BSA溶液中，在37℃烘箱中孵育30min，以封閉剩余的活性位點(diǎn)。

實(shí)施例5對(duì)克倫特羅的檢測(cè)

將實(shí)施例4中制備的免疫電化學(xué)傳感器浸入總體積為50μL的含有不同濃度的游離克倫特羅，和效價(jià)濃度為1：6400的抗TBPBA-BSA抗體的磷酸緩沖溶液中，在37℃孵育30min，用磷酸緩沖溶液沖洗后于2mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描(圖2)。

將在克倫特羅濃度為0的孵育液中孵育后的修飾電極的DPV峰電流定義為I0，在含有不同濃度克倫特羅的孵育液孵育后的修飾電極的DPV峰電流定義為IX，計(jì)算ΔI＝IX-I0，以ΔI對(duì)克倫特羅濃度(C)作圖可得ΔI-C工作曲線(圖3)。采用線性回歸法得到ΔI-C線性回歸方程：Y＝1.07415+0.00134X，克倫特羅的濃度在50～6000ng/ml范圍內(nèi)與ΔI成正比，線性相關(guān)系數(shù)為0.9932。以大于噪音信號(hào)3倍的電流信號(hào)對(duì)應(yīng)的濃度為最低檢出限，重復(fù)5次以上實(shí)驗(yàn)得出，上述方法的最低檢出限為0.4ng/ml。

實(shí)施例6對(duì)沙丁胺醇的檢測(cè)

將實(shí)施例4中制備的免疫電化學(xué)傳感器浸入總體積為50μL的含有不同濃度的游離沙丁胺醇，和效價(jià)濃度為1：6400的抗TBPBA-BSA抗體的磷酸緩沖溶液中，在37℃孵育40min，用磷酸緩沖溶液沖洗后于2mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描(圖4)。

將在沙丁胺醇濃度為0的孵育液中孵育后的修飾電極的DPV峰電流定義為I0，在含有不同濃度沙丁胺醇的孵育液孵育后的修飾電極的DPV峰電流定義為IX，計(jì)算ΔI＝IX-I0，以ΔI對(duì)沙丁胺醇濃度(C)作圖可得ΔI-C工作曲線(圖5)。采用線性回歸法得到ΔI-C線性回歸方程：Y＝1.20866+0.0014X，沙丁胺醇的濃度在10～7000ng/ml范圍內(nèi)與ΔI成正比，線性相關(guān)系數(shù)為0.99366。以大于噪音信號(hào)3倍的電流信號(hào)對(duì)應(yīng)的濃度為最低檢出限，重復(fù)5次以上實(shí)驗(yàn)得出，上述方法的最低檢測(cè)限為0.3ng/ml。

實(shí)施例7對(duì)馬布特羅的檢測(cè)

將實(shí)施例4中制備的免疫電化學(xué)傳感器浸入總體積為50μL的含有不同濃度的游離馬布特羅，和效價(jià)濃度為1：6400的抗TBPBA-BSA抗體的磷酸緩沖溶液中，在37℃孵育30min，用磷酸緩沖溶液沖洗后于2mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描(圖6)。

將在馬布特羅濃度為0的孵育液中孵育后的修飾電極的DPV峰電流定義為I0，在含有不同濃度馬布特羅的孵育液孵育后的修飾電極的DPV峰電流定義為IX，計(jì)算ΔI＝IX-I0，以ΔI對(duì)馬布特羅濃度(C)作圖可得ΔI-C工作曲線(圖7)。采用線性回歸法得到ΔI-C線性回歸方程：Y＝3.09399+0.0006734X，馬布特羅的濃度在50～5000ng/ml范圍內(nèi)與ΔI成正比，線性相關(guān)系數(shù)為0.99645。以大于噪音信號(hào)3倍的電流信號(hào)對(duì)應(yīng)的濃度為最低檢出限，重復(fù)5次以上實(shí)驗(yàn)得出，上述方法的最低檢測(cè)限為0.5ng/ml。

實(shí)施例8豬肉樣品中加標(biāo)妥布特羅的測(cè)定

步驟1，豬肉樣品的處理：稱取1±0.0050g豬肉于到10ml的樣品管中，加入妥布特羅標(biāo)準(zhǔn)液，和3ml乙腈-丙酮提取液(V：V＝4:1)，混合物超聲振蕩30分鐘，于2000r/m下離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至氮吹管中，殘?jiān)?ml的相同提取液重復(fù)提取1次，上清液合并在氮吹管中。提取物在氮吹條件下于50℃溫度下濃縮蒸發(fā)，濃縮物加入1ml的pH為7.4磷酸緩沖溶液溶解后用于電化學(xué)分析。

步驟2，豬肉樣品中加標(biāo)妥布特羅的測(cè)定：分別取等量的不同豬肉提取液樣品，和抗TBPBA-BSA抗體溶液及磷酸緩沖溶液混合配成孵育液，使得總體積為50μl，且抗TBPBA-BSA抗體的濃度均相等。將石墨烯/殼聚糖/TBPBA修飾的免疫電化學(xué)傳感器浸入孵育液中，在37℃孵育25min，用磷酸緩沖溶液沖洗后于2mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描。定義空白樣品的峰電流為I0，其他樣品的峰電流IX，計(jì)算△I＝IX-I0。以與實(shí)施例7中相同的方法得到的DPV峰電流差值ΔI與妥布特羅的濃度C的ΔI-C工作曲線，得到妥布特羅的濃度，檢測(cè)回收率結(jié)果如表1。

表1為免疫傳感器檢測(cè)加標(biāo)豬肉中的妥布特羅濃度的回收率

實(shí)施例9鴨肉樣品中加標(biāo)溴布特羅的測(cè)定

步驟1，鴨肉樣品的處理：稱取1±0.0050g鴨肉于到10ml的樣品管中，加入溴布特羅標(biāo)準(zhǔn)液，按照與實(shí)施例8步驟1)中相同的方法進(jìn)行鴨肉樣品前處理。

步驟2，鴨肉樣品中加標(biāo)溴布特羅的測(cè)定：分別取等量的不同鴨肉提取液樣品，和抗TBPBA-BSA抗體溶液及磷酸緩沖溶液混合配成孵育液，按照與實(shí)施例7步驟2)中相同的方法進(jìn)行鴨肉樣品中加標(biāo)溴布特羅的檢測(cè)，檢測(cè)回收率結(jié)果如表2。

表2為免疫傳感器檢測(cè)加標(biāo)鴨肉中的溴布特羅濃度的回收率。

實(shí)施例10牛肉樣品中加標(biāo)西布特羅的測(cè)定

步驟1，牛肉樣品的處理：稱取1±0.0050g牛肉于到10ml的樣品管中，加入西布特羅標(biāo)準(zhǔn)液，按照與豬肉樣品中加標(biāo)妥布特羅的測(cè)定中步驟1)中相同的方法進(jìn)行牛肉樣品前處理。

步驟2，牛肉樣品中加標(biāo)西布特羅的測(cè)定：分別取等量的不同牛肉提取液樣品，和抗TBPBA-BSA抗體溶液及磷酸緩沖溶液混合配成孵育液，按照與豬肉樣品中加標(biāo)妥布特羅的測(cè)定中步驟2)中相同的方法進(jìn)行牛肉樣品中加標(biāo)西布特羅的檢測(cè)，檢測(cè)回收率結(jié)果如表3。

表3為免疫傳感器檢測(cè)加標(biāo)牛肉中的西布特羅濃度的回收率。

通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)可知，本發(fā)明傳感器對(duì)克倫特羅和溴布特羅的檢測(cè)限為0.4ng/mL，線性范圍為50～6000ng/mL；對(duì)沙丁胺醇和特步他林的檢測(cè)限為0.3ng/mL，線性范圍為10～7000ng/mL；對(duì)馬布特羅和西布特羅的檢測(cè)限為0.5ng/mL，線性范線性范圍為50～5000ng/mL；對(duì)妥布特羅的檢測(cè)限為0.5ng/mL，線性范圍為50～6000ng/mL，為食品安全提供了保障。