本發(fā)明涉及土壤中腐殖質(zhì)的提取方法，具體地說是一種土壤腐殖質(zhì)的提取和純化方法。

背景技術：

土壤腐殖質(zhì)的定量提取、分離與純化是深入研究土壤腐殖質(zhì)的重要前提。對于土壤中腐殖質(zhì)提取的方法研究，有很多報道，包括有機溶劑提取法、無機試劑提取法和有機/無機試劑混合提取法。丙酮、DMSO、Pyridine、二氧雜環(huán)己烷等有機溶劑提取的腐殖質(zhì)提取產(chǎn)率低，產(chǎn)物多為分子量小的有機質(zhì)，且部分有機提取劑最終很難與有機質(zhì)完全分離(Hayes、Eloff等)。混合提取劑Na₄P₂O₇和EDTA提取法，產(chǎn)率較有機溶劑法高，但提取產(chǎn)物中灰分含量很大。無機試劑KOH、NaOH提取產(chǎn)物產(chǎn)量高，分子量大，能代表土壤中的有機質(zhì)的整體性質(zhì)，并且提取劑易于與產(chǎn)物分離，故其作為提取劑提取腐殖質(zhì)的研究也越來越普遍。

由于缺少標準方法，在以往的研究中，土壤腐殖質(zhì)的提取方法各有不同，提取劑、提取液劑量、提取次數(shù)、純化方法的選擇各有特點，使得研究的數(shù)據(jù)可比性較低。為了使腐殖質(zhì)的研究數(shù)據(jù)更具可比性，國際腐殖質(zhì)協(xié)會提出了一個國際標準方法IHSS method。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種土壤腐殖質(zhì)的提取和純化方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：

一種土壤腐殖質(zhì)的提取和純化方法，將待提取樣品依次用鹽酸和氫氧化鈉溶液充分震蕩、溶解，促進待提取有機質(zhì)在酸液和堿液中的溶解，而后分離純化，即分別獲得待提取樣品不同的腐殖質(zhì)。

將待提取樣品用鹽酸溶液充分超聲震蕩，使樣品與鹽酸充分溶解，離心，上清液為FA1組分，殘渣沉淀中加入氫氧化鈉溶液充分超聲震蕩，使殘渣與氫氧化鈉充分溶解，靜置一夜,離心殘渣為Hu1，堿溶性物質(zhì)上清液中再加入鹽酸溶液充分超聲震蕩，使上清液pH＝1，而后抽濾，殘渣為HA，上清液為FA2；殘渣HA再在N₂氣氛下加入KOH進行重溶，而后離心，進一步得到腐殖質(zhì)的粗提物。

將上述重溶離心后上清堿溶性物質(zhì)HA粗產(chǎn)物加入鹽酸充分超聲震蕩，使溶液pH＝1，靜置而后離心，收集殘渣至透析袋中經(jīng)水反復透析直至加入AgNO₃檢驗時無Cl^-冷凍干燥，即得到HA。

所述收集殘渣用體積比為1:20的HCL和HF的混酸溶解，室溫下震蕩，離心分離收集沉淀，進行去灰度處理，離心后收集的沉淀反復進行灰度處理 4-7次后移入滲析袋中透析，直至加入AgNO3檢驗時無Cl^-冷凍干燥，即得到DHA。

將上述收集的FA1和FA2分別過XAD-8非離子交換樹脂吸附，吸附后依次用去離子水、NaOH溶液和去離子水洗脫吸附于樹脂上的富里酸組分，兩部分收集洗脫液并加入HCl攪動，使收集液pH＝1，而后過1/5樣品體積的XAD-8樹脂柱吸附，吸附后依次用水和NaOH洗脫收集洗脫液，洗脫液溶液過3倍溶液Na⁺摩爾數(shù)的氫飽和IR1200陽離子交換樹脂，冷凍干燥，即得FA。

所述pH＝1的收集液中加入濃度為0.3M的HF混勻后過1/5樣品體積的XAD-8樹脂柱吸附，吸附后依次用去離子水和NaOH洗脫收集洗脫液，洗脫液溶液過3倍溶液Na⁺摩爾數(shù)的氫飽和IR1200陽離子交換樹脂，冷凍干燥，即得DFA。

將上述所得殘渣Hu1和Hu2混合，混合后加入NaOH和去離子水溶解充分震蕩，而后離心收集沉淀進行純化，反復純化，直至離心上清液呈無色透明，收集沉淀置于透析袋中經(jīng)水反復透析直至加入AgNO₃檢驗時無Cl^-冷凍干燥，即得Hu。

上述直至離心上清液呈無色透明所收集得沉淀用體積比為1:20的HCL和HF的混酸溶解，室溫下震蕩，離心分離收集沉淀，進行去灰度處理，離心后收集的沉淀反復進行灰度處理4-7次后移入滲析袋中透析，直至加入AgNO3檢驗時無Cl^-冷凍干燥，即得到DHu。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點：

1.本發(fā)明流體運輸裝置提取腐殖質(zhì)原材料其結(jié)構簡單、適用性能強，有效避免人力物力的耗費，工廠大規(guī)模分離純化腐殖質(zhì)時，將裝置放大，調(diào)節(jié)至合適的高度，可通過大氣壓力自動過非離子交換樹脂柱純化FA組分，降低生產(chǎn)成本。

2.本發(fā)明分別對腐殖酸、富里酸和胡敏素產(chǎn)物純化分別進行灰化和未灰化處理，方便實驗室理論研究灰分與有機質(zhì)之間的作用。

3.采用本發(fā)明技術提取腐殖質(zhì)，通過調(diào)節(jié)空瓶空隙體積和簡單的抽濾，提高腐殖質(zhì)提取產(chǎn)率，避免其中某一組分被另一組分的污染。

4.將胡敏素殘留在土壤中進行純化分析，克服用常規(guī)有機溶劑(DMSO/H₂SO₄)提取胡敏素破壞或改變胡敏素結(jié)構的缺陷，保證后期分析結(jié)果的準確性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的輸液管處理示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例提供的富里酸組分溶液靠輸液管恒速轉(zhuǎn)移至樹脂中吸附的裝置圖。

圖3為本發(fā)明實施例提供的同一土壤提取出HA、DHA、FA、DFA的紅外光譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。

實施例1

提取內(nèi)蒙古草原地區(qū)土壤中的腐殖質(zhì)，實施方式如下：

草原土壤預處理，將風干后的土樣研磨過2mm孔徑的篩子，混勻以備實驗使用。

1)草原土壤腐殖質(zhì)三組分的粗分離:

稱取上述過2mm篩子的土樣55g，置于600ml離心瓶中，再加入550mL 0.13M的HCl充分搖勻，離心瓶中空出50mL的空瓶體積，震蕩過程中促進瓶內(nèi)液體劇烈震動，有利于土與提取劑充分接觸，提高提取產(chǎn)率。室溫下150W超聲清洗儀中超聲30min，然后在25℃恒溫下以150rpm速率震蕩1h，再于3500rpm轉(zhuǎn)速下離心30min，下層殘渣含有腐殖酸、富里酸和胡敏素的腐殖質(zhì)。

上清液為土壤中部分被酸溶解的富里酸，標記該上清液為FA1；往殘渣中加入2.86gNaOH固體和550mL去離子水混勻，室溫下150W超聲清洗儀中超聲30min，25℃恒溫下以120rpm速率震蕩6h，靜置一夜，于3500rpm轉(zhuǎn)速下離心30min，殘渣含有胡敏素組分標記為Hu1，堿溶性溶液中有腐殖酸(HA)、富里酸(FA)和部分通過腐殖酸和富里酸作為橋梁而轉(zhuǎn)移到液相中的胡敏素(Hu)；堿性溶液中加入6MHCl，持續(xù)攪動使溶液pH＝7，震蕩4h，析出溶液中的腐殖酸和胡敏素，3500rpm轉(zhuǎn)速下離心30min分離，0.45um醋酸纖維素濾膜抽濾上清液，濾液為酸溶的富里酸標記為FA2；用0.3MKOH洗滌截留在濾紙上的腐殖酸，洗滌液繼續(xù)用于溶解離心分離在瓶底的腐殖酸，將溶解在KOH的腐殖酸溶液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，3500rpm轉(zhuǎn)速下離心30min，上清液為腐殖酸粗產(chǎn)物HA1，離心管底部的殘渣中含有胡敏素組分標記為Hu2。

2)腐殖質(zhì)三組分的純化分離：

腐殖酸HA1純化：向上述腐殖酸粗產(chǎn)物HA1溶液里滴加6MHCl,持續(xù)攪動使pH＝1，懸浮液靜置12h，使腐殖酸從溶液里充分析出，3500rpm轉(zhuǎn)速下離心30min，上清液棄去，析出的殘渣為HA組分。將腐殖酸組分分為兩份，其中一份直接轉(zhuǎn)移至透析袋中，在去離子水中滲析至無Cl^-，冷凍干燥，該部分產(chǎn)物標記為產(chǎn)物HA；另一份經(jīng)去灰分處理，加入按體積比為1:20的濃度0.1M的HCL與濃度為0.3M的HF混酸，25℃下震蕩7h，離心分離，上清液棄去，而后再加入濃度0.1M的HCL與濃度為0.3M的HF混酸反復去灰分過程重復3次，保證灰分被徹底去除。去灰分殘渣移入滲析袋中，在去離子水中滲析至無Cl^-，冷凍干燥，該部分產(chǎn)物標記為產(chǎn)物DHA。

富里酸FA1和FA2純化：上清液FA1、FA2組分分別過XAD-8非離子交換樹脂，使富里酸分子吸附于XAD-8樹脂上，廢棄流出柱子的液體；依次用0.65倍柱體積去離子水、1倍體積0.1MNaOH溶液、2-3倍柱體積去離子水洗脫吸附于樹脂上的富里酸組分，收集洗脫液；洗脫液中加HCl持續(xù)攪動，使pH＝1， 洗脫液分兩份，其中一份進行去灰分處理，向洗脫液中加入HF使其總濃度達到0.3M，標記為DFA洗脫液，另一份不經(jīng)灰化處理標記為FA洗脫液；FA、DFA洗脫液分別過1/5樣品體積的XAD-8樹脂，廢棄流出柱子的液體；依次用0.65倍柱體積去離子水、1倍體積0.1MNaOH洗脫樹脂上的FA和DFA；FA和DFA洗脫液溶液過3倍溶液Na⁺摩爾數(shù)的氫飽和陽離子交換樹脂，冷凍干燥，分別得到產(chǎn)物FA和DFA。

其中，富里酸組分輸送到XAD-8非離子交換柱純化的裝置參見2，所述輸送裝置是將由圖1所示的輸送連接裝置分別與XAD-8非離子交換柱以及承裝富里酸組分的容器連接；

輸送連接裝置包括滴壺、導管和流速調(diào)節(jié)器組成，滴壺1兩端連接有導管，任意一邊與滴壺相連接的導管上設有流速調(diào)節(jié)器；其中，輸送連接裝置長度為35cm，導管為PVC材質(zhì)的輸液管，管外徑4.2mm，內(nèi)徑3mm，截管長大于35cm。

流速調(diào)節(jié)器控制流體流速，通過滴壺里液滴的流速確定液體流速快慢。

使用發(fā)明的裝置前需要一個特定的實驗員持續(xù)往樹脂漏斗里加富里酸酸溶液，通過使用發(fā)明的裝置，調(diào)節(jié)特定的流速流體會恒速流過柱子，待吸附達到樹脂承受容量時即進行洗脫。該裝置在大批量提取實驗中可減少人力的耗費。

胡敏素Hu1和Hu2純化：混合粗分離產(chǎn)物中的殘渣Hu1和Hu2，加0.1MNaOH溶液(土：水＝1:10)，恒溫震蕩4h，離心分離，棄去上清液；所得沉淀再加入NaOH溶液震蕩離心，反復10-20次，直至上清液呈無色透明，使殘留在土壤中的腐殖酸和富里酸組分充分析出；將Hu沉淀分為兩份，其中一份直接移入透析袋，用去離子水透析直至滴入AgNO₃使溶液無AgCl沉淀生成，離心分離，將沉淀冷凍干燥得到Hu產(chǎn)物；另一份去灰分處理，加入按體積比為1:20的濃度0.1M的HCL和濃度為0.3M的HF的混酸洗脫液溶液過3倍溶液Na⁺摩爾數(shù)的氫飽和IR1200陽離子交換樹脂，25℃下震蕩7h，離心分離，上清液棄去，去灰分過程重復6次，保證灰分被徹底去除。去灰分殘渣移入滲析袋中，在去離子水中滲析至透析直至滴入AgNO₃使溶液無AgCl沉淀生成，冷凍干燥，該部分產(chǎn)物標記為DHu產(chǎn)物。

實施例2

將上述實施例提取所得腐殖質(zhì)有去灰分(DHA、DFA和DHu)和不去灰分(HA、FA和Hu)的產(chǎn)物，通過FTIR和滴定實驗對其進行性質(zhì)分析。

分別取DHA、HA、DFA和FA各1mg樣品，將各樣品分別和100mg的KBr混合，充分研磨后壓片并放入紅外干燥箱中干燥以去除樣品中水分子的影響。在傅里葉變換紅外光譜儀上測定，測定參數(shù)為：分辨率4cm^-1，測定范圍4000-400cm^-1(參見圖3)。

由圖3可見，腐殖酸和富里酸分子都有相同的特征吸收峰，其中3600-3100cm^-1的寬峰為-OH(游離或締合)、-NH的伸縮震動吸收峰，2960cm^-1、2850cm^-1分別為甲基或亞甲基的對稱伸縮震動吸收峰，1725cm^-1為羰基伸縮 震動吸收峰，1600-1580cm^-1為苯環(huán)骨架震動吸收峰，1460cm^-1處為甲基的反對稱變形震動和亞甲基的變形震動吸收峰。由于腐殖質(zhì)分子結(jié)構的復雜性，紅外指紋區(qū)輔助定性準確性不是很高，故至考察了官能團區(qū)。對比HA、FA與DHA、DFA紅外譜圖發(fā)現(xiàn)，灰化前后產(chǎn)物均具有相同的特征吸收峰，但出峰強度確不相同，灰化產(chǎn)物弱于未灰化產(chǎn)物，進一步表明有機質(zhì)中灰分的存在會影響有機質(zhì)的化學行為。

腐殖酸和富里酸分子上羧基和酚羥基官能團含量滴定實驗流程如下：

1)以0.1M NaCl作為背景電解質(zhì)，用0.002M NaOH分散實施例1中提取的腐殖酸和富里酸，去離子水稀釋分別配制0.08±0.01g.L^-1的腐殖酸和富里酸儲備液；

2)取100mL儲備液于250mL玻璃燒杯中用于滴定實驗，滴定前加入2.27g0.0881MHCl準確中和儲備液中用于分散腐殖酸和富里酸的NaOH(鹽酸的加入使滴定液體積變化小于2％，即△V<2％)；

3)滴定體系浸于25℃恒溫水浴，N₂鼓動下，以0.05MNaOH滴定體系，記錄滴定過程中滴定液PH值隨NaOH加入體積的變化，滴定劑加入體系pH穩(wěn)定7s，pH變化不超過0.1時讀取pH值。PH滴定范圍：3-10.7，通過Modified Henderson Hasselbach model計算體系中羧基和酚羥基官能團的含量，方程如下：

$Q_{TOT}=\frac{Q_1}{1+{(H/K_1)}^{1/n_1}}+\frac{Q_2}{1+{(H/K_2)}^{1/n_2}}---\left(1\right)$

其中：Q₁、Q₂代指羧基和酚羥基含量；

logK₁、logK₂為分子中兩類質(zhì)子的logK平均值計算而來；

n₁、n₂為經(jīng)驗常數(shù)。

滴定數(shù)據(jù)在origin中擬合，最終求出腐殖酸和富里酸分子單位質(zhì)量所含的羧基和酚羥基的量。

實驗過程中分別對腐殖酸和胡敏素產(chǎn)物灰化前后量進行對比，灰化后總量損失1/4-1/3，通過酸堿滴定實驗羧基和酚羥基官能團滴定結(jié)果見表-1。從滴定結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)FA、HA產(chǎn)物未經(jīng)灰化處理，產(chǎn)物中夾雜著大量無機礦物質(zhì)，致使其單位質(zhì)量羧基和酚羥基的含量比灰化產(chǎn)物含量低。

表-1產(chǎn)物滴定結(jié)果