本發(fā)明涉及有機酸領域，具體為一種從發(fā)酵液中高效地提取利用發(fā)酵生產的有機酸的方法。

背景技術：

目前有機酸、如乳酸、琥珀酸等被用于醫(yī)藥、農藥、化妝品等各種用途。作為有機酸的制造方法，自古以來使用發(fā)酵法。一般而言，由于有機酸生產菌生產的有機酸導致發(fā)酵抑制，大多在發(fā)酵液中加入堿一邊調整至pH中性附近一邊進行發(fā)酵。在該情況下，將有機酸作為pH調整劑的鹽進行回收。例如，乳酸可作為乳酸銨，利用無機酸和烷基胺進行提取。但是，由于這樣的pH調整操作繁雜，還需要從有機酸鹽回到有機酸的工序，因而制造成本高。因此，提出了使用將可在酸性條件下進行發(fā)酵的、賦予了耐酸性的菌，如耐酸性微生物作為宿主的轉化體來進行發(fā)酵。在該情況下，可將有機酸以酸的形態(tài)進行回收。作為該回收方法，已知例如用非水溶性胺與非水溶性有機酸的混合物進行提取的方法，用含氧飽和雜環(huán)式化合物進行提取的方法，用與水共沸的溶劑進行提取的方法。在第1種方法中，為了將提取和反提取設為相同溫度，需要使用非水溶性有機酸。而且，由于必須限定該有機酸和胺的混合比例的范圍，且該范圍必須根據所制造的有機酸進行變更，因此不實際。第2種方法中，作為含氧飽和雜環(huán)式化合物可使用四氫呋喃等，但這樣的親水性溶劑也會提取發(fā)酵液中所含的有機酸以外的親水性物質。在第3 種方法中，作為與水共沸的溶劑，例如可使用甲醇、乙醇等低級醇，但在純化工序中必須大量去除這些提取用醇，并且還存在酯化的問題。

技術實現要素：

針對上述現有技術的缺點，本發(fā)明提供一種在發(fā)酵工序中無需耗費pH調整的工時、不存在上述各種問題、可以高效地回收作為目的物的有機酸的有機酸的制造方法。

本發(fā)明解決上述技術問題采用以下技術方案：一種從發(fā)酵液中提取有機酸的方法，包括通過發(fā)酵生產有機酸，得到pH為1～5的含有機酸粗液的第1工序；和用含酯化合物的提取介質從所述第1工序所得到的含有機酸粗液中提取該有機酸，得到含有所述有機酸的提取液的第2工序。

作為優(yōu)選，所述酯化合物為碳數10～30的二酯化合物。

作為優(yōu)選，所述二酯化合物為脂肪族二羧酸的二烷基酯。

作為優(yōu)選，所述二酯化合物為選自富馬酸雙(2-乙基己基)酯、癸二酸雙(2-乙基己基)酯、衣康酸雙(2-乙基己基)酯、壬二酸雙(2-乙基己基)酯、以及馬來酸雙(2-乙基己基)酯的二酯化合物。

作為優(yōu)選，所述提取介質還含有烷基胺化合物。

作為優(yōu)選，所述烷基胺化合物為碳數15～39的三烷基胺。

作為優(yōu)選，所述三烷基胺為選自三己基胺、三辛基胺、三癸基胺。

作為優(yōu)選，所述提取介質中的烷基胺化合物/酯化合物的體積比為0.6/1～9/1。

作為優(yōu)選，還包括使用水從所述提取液提取所述有機酸，得到含有所述有機酸的提取液的第3工序。

作為優(yōu)選，所述第3工序在60～90℃下進行。

本發(fā)明與現有技術相比具有如下優(yōu)點：如果采用本發(fā)明的制造方法，則不需要在發(fā)酵工序中進行pH調整。此外，通過酯化合物和烷基胺化合物的組合，可選擇性地、高效地得到有機酸。即，可幾乎不提取發(fā)酵液中的成分(尤其是葡萄糖)地以簡便的操作選擇性地得到有機酸。

具體實施方式

為了使本發(fā)明實現的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

在本發(fā)明中，有機酸只要是具有羧基的有機化合物即可，例如可例舉乳酸、3-羥基丙酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、馬來酸、戊二酸、以及己二酸等。其中，從具有廣泛用途的方面考慮，優(yōu)選乳酸。這些有機酸可以是D構型、L構型、DL構型的任一種，此外，也可以形成為低聚物，即聚合度2～ 15左右的聚合物。

第1工序的發(fā)酵如果是利用微生物來生產有機酸，則可以是只生產該有機酸的同型發(fā)酵，也可以是在該有機酸以外還生產乙醇等的異型發(fā)酵。微生物可以是野生型以及轉基因型的任一種。作為野生型微生物，例如可例舉鏈球菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬、以及乳桿菌屬等乳酸發(fā)酵菌；厭氧螺菌屬、以及棒桿菌屬等琥珀酸發(fā)酵菌。

作為轉基因型微生物，可例舉轉基因乳酸生產酵母，例如將粟酒裂殖酵母作為宿主，整合入乳酸脫氫酶基因，并使該宿主的編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的轉化體，將酵母屬的酵母等耐酸性微生物作為宿主，在該耐酸性微生物內導入了編碼乳酸脫氫酶的基因的轉化體，以及導入了編碼乳酸脫氫酶的基因，并使編碼丙酮酸脫羧酶1的基因缺失或失活了的釀酒酵母等。其中，從可不需要將pH調整至中性附近、能夠以高生產性生產乳酸的方面考慮，優(yōu)選將粟酒裂殖酵母作為宿主，整合入乳酸脫氫酶基因，并使該宿主的編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的轉化體。對發(fā)酵所使用的發(fā)酵液沒有特別限定，只要含有適合目的有機酸的生產的Na、K等基本無機鹽類以及碳源即可。此外，根據需要也可以含有氮源以及氨基酸等成分。發(fā)酵液可以是天然、合成或半合成發(fā)酵液的任一種。作為碳源，例如可例舉葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等糖。作為氮源，例如可例舉氨、氯化銨、乙酸銨等無機酸或有機酸的銨鹽、胨、酪蛋白氨基酸、酵母抽提物等。作為無機鹽類，例如可例舉磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸二氫鉀等。另外，可摻合蛋白脂質等發(fā)酵促進因子等。

作為糖，優(yōu)選使用葡萄糖。發(fā)酵初期的發(fā)酵液(100質量％)中的葡萄糖濃度優(yōu)選為1質量％以上，更優(yōu)選1～25質量％，進一步優(yōu)選2～16質量％。由于發(fā)酵導致葡萄糖濃度下降，優(yōu)選根據需要添加葡萄糖來繼續(xù)發(fā)酵。發(fā)酵末期的葡萄糖濃度可以在1質量％以下。此外，在一邊分離有機酸一邊使發(fā)酵液循環(huán)進行連續(xù)發(fā)酵的情況下，優(yōu)選維持上述葡萄糖濃度。通過將葡萄糖濃度設為2質量％以上，可提高有機酸的生產性。此外，通過將發(fā)酵液中的葡萄糖設為16質量％以下，可進一步提高有機酸的生產效率。

此外，為了提高生產性，優(yōu)選進行高密度發(fā)酵。高密度發(fā)酵中，發(fā)酵液中的轉化體的初始菌體濃度以干燥菌體重量換算值表示優(yōu)選設為0.1 ～ 50g/L，更優(yōu)選設為0.2 ～40g/L。通過提高初始菌體濃度可以在短時間內實現高生產性。此外，如果初始菌體濃度過高則有可能產生菌體的凝集和純化效率的降低等問題。另外，后述的實施例等示出的菌體濃度是由通過日本分光株式會社制可視紫外分光器V550測定的波長660nm的光的吸光度(OD660)換算的值。660nm 中的OD ＝1，相當于酵母干燥重量的0.2g/L、濕重量的0.8g/L。

發(fā)酵可以采用公知的發(fā)酵方法，例如可以通過循環(huán)發(fā)酵、攪拌發(fā)酵等進行。發(fā)酵溫度優(yōu)選23～37℃。此外，發(fā)酵時間可適當決定。發(fā)酵可以是分批發(fā)酵，也可以是連續(xù)發(fā)酵。例如，可在以分批發(fā)酵進行發(fā)酵后，將菌體從發(fā)酵液中分離，取得含有有機酸的發(fā)酵液。此外，連續(xù)發(fā)酵法中，例如可例舉重復以下操作來連續(xù)地進行發(fā)酵的方法；該操作是：從發(fā)酵中的發(fā)酵槽取出部分發(fā)酵液，在從取出的發(fā)酵液中分離有機酸的同時，將在分離了有機酸后剩下的發(fā)酵液中加入葡萄糖和新的發(fā)酵液并返回發(fā)酵槽。通過進行連續(xù)發(fā)酵，可進一步提高有機酸的生產性。

所生產的含有有機酸的含有機酸粗液的pH 為1 ～ 5，優(yōu)選1.5 ～ 4，特別優(yōu)選1.5 ～ 3.5。本發(fā)明的有機酸的制造方法中，優(yōu)選采用即使有機酸向發(fā)酵液的積聚導致pH變低，也可不進行pH 調整而生產有機酸的發(fā)酵法。即，優(yōu)選采用即使在發(fā)酵液的pH 變低之后，也可以通過直接繼續(xù)發(fā)酵的連續(xù)發(fā)酵來制造有機酸的發(fā)酵法。在該發(fā)酵法中，為了提高有機酸的生產性，優(yōu)選即使在發(fā)酵液的pH 為3.5 以下之后，也進一步繼續(xù)發(fā)酵。尤其，由于上述粟酒裂殖酵母的轉化體的耐酸性優(yōu)良，可不調整所生產的含有有機酸的發(fā)酵液的pH而繼續(xù)發(fā)酵。

第2 工序中，用含酯化合物的提取介質從第1 工序所得到的含有有機酸的含有機酸粗液提取目的有機酸，得到提取液(1)。該含有機酸粗液可直接用于提取，但優(yōu)選在提取之前通過離心分離或者過濾等菌體分離處理將菌體分離。作為離心分離的條件的例子，可例舉1000 ～ 5000G 中，10 ～ 15 分鐘。此外，作為過濾的條件，可例舉使用標稱篩孔徑0.1 ～2μm 的過濾膜。作為含有機酸粗液的典型組成，例如含有有機酸50 ～ 120g/L、糖0.5 ～20g/L、乙醇1 ～ 20g/L。作為酯化合物，優(yōu)選選自碳數4 ～ 40 的脂肪族酯以及芳香族酯的至少一種。如果是碳數在上述范圍內的酯化合物，則由于具備適當的極性和沸點，因此容易高效地進行提取，并且容易在其后的工序中被除去。作為該酯化合物的常壓下的沸點，優(yōu)選為250℃以上。該沸點的上限沒有特別限定，通常而言為400℃以下。但是，在不存在常壓下的沸點而僅存在分解點的情況下，分解點優(yōu)選為250℃以上。

作為本發(fā)明中的酯化合物，在上述脂肪族酯和芳香族酯中，優(yōu)選脂肪族酯。即，優(yōu)選為酯化合物中的羧酸殘基和醇殘基的任一種脂肪族化合物的殘基。

酯化合物根據1 個分子中的酯基數量，分為單酯化合物和聚酯化合物。作為本發(fā)明中的酯化合物，優(yōu)選酯基數量為2 ～ 4 的聚酯化合物，更優(yōu)選二酯化合物。特別優(yōu)選碳數10 ～ 30 的脂肪族二酯化合物。

作為二酯化合物，可例舉具有1 個二羧酸殘基和2 個一元醇殘基的二酯化合物、具有2 個單羧酸殘基和1 個二元醇殘基的二酯化合物等。作為本發(fā)明中的酯化合物，可以是這些二酯化合物中的任一種，更優(yōu)選具有二羧酸殘基和一元醇殘基的脂肪族的二酯化合物。特別優(yōu)選具有飽和或不飽和脂肪族二羧酸殘基和烷醇殘基的二酯化合物。

本發(fā)明中的優(yōu)選酯化合物為碳數10 ～ 30 的脂肪族二酯化合物，其中更優(yōu)選具有飽和或不飽和脂肪族二羧酸殘基和烷醇殘基( 即，烷基) 的脂肪族二酯化合物。此外，飽和脂肪族二羧酸殘基的碳數( 包括羰基的碳原子的數) 優(yōu)選為5 ～ 15，更優(yōu)選6 ～ 12。不飽和脂肪族二羧酸殘基的碳數( 包括羰基的碳原子的數) 優(yōu)選為4 ～ 8，更優(yōu)選4 ～ 6。烷醇殘基(即，烷基) 的碳數優(yōu)選2 ～ 12，更優(yōu)選6 ～ 10。

具體而言，例如可例舉己二酸二乙酯、己二酸二異壬酯、己二酸二異十一烷酯、己二酸雙(2- 乙基己基)酯、庚二酸二乙酯、庚二酸二癸酯、癸二酸二辛酯、癸二酸雙(2- 乙基己基) 酯、癸二酸二丁酯、壬二酸二乙酯、壬二酸二辛酯、壬二酸雙(2- 乙基己基)酯、壬二酸二己酯、十二烷二酸雙(2- 乙基己基)酯、富馬酸二丁酯、富馬酸二壬酯、富馬酸雙(2- 乙基己基) 酯、馬來酸二己酯、馬來酸雙(2- 乙基己基) 酯、衣康酸二丙酯以及衣康酸雙(2- 乙基己基)酯。

其中，最優(yōu)選選自富馬酸雙(2- 乙基己基) 酯、癸二酸雙(2- 乙基己基) 酯、衣康酸雙(2- 乙基己基) 酯、壬二酸雙(2- 乙基己基) 酯、以及馬來酸雙(2- 乙基己基) 酯的酯化合物。

上述提取介質進一步優(yōu)選含有烷基胺化合物。作為烷基胺化合物，優(yōu)選二烷基胺化合物或三烷基胺化合物。作為二烷基胺化合物，優(yōu)選具有2 個碳數3 ～ 15 的烷基的化合物。作為三烷基胺化合物，優(yōu)選具有3 個碳數3 ～ 15 的烷基的化合物。二烷基胺化合物或三烷基胺化合物的1 分子中的的多個烷基可以不同。

如果是上述烷基胺化合物，則與上述酯化合物的相溶性良好，可提高該酯化合物對目的物有機酸的提取效率。此外，在進一步進行后述的通過水的提取的情況下，也不妨礙將該有機酸提取到水中。

作為該烷基胺的常壓下的沸點，優(yōu)選為250℃以上。該沸點的上限沒有特別限定，通常而言為400℃以下。但是，在不存在常壓下的沸點而僅存在分解點的情況下，分解點優(yōu)選為250℃以上。

更優(yōu)選使用碳數15 ～ 39 的三烷基胺。例如可例舉二丁基十一烷基胺、三戊基胺、二戊基十一烷基胺、三己基胺、三辛基胺、三壬基胺、三( 十一烷基) 胺、三癸基胺、以及三(十二烷基) 胺。其中最優(yōu)選選自三己基胺、三辛基胺、三癸基胺、以及三( 十二烷基)胺的烷基胺化合物。

在并用酯化合物和烷基胺化合物的情況下，它們的比例以烷基胺化合物/ 酯化合物的體積比計，優(yōu)選0.6/1 ～ 9/1，更優(yōu)選1/1 ～ 3/1。如果在該范圍內，則可提高提取效率。

提取如下進行：將含有機酸粗液和提取介質在優(yōu)選0 ～ 40℃、更優(yōu)選0 ～ 30℃的溫度下進行混合、接觸。含有機酸粗液/ 提取介質的體積比為0.5/1 ～ 2/1，優(yōu)選設為0.8/1 ～ 1.2/1。提取時間根據混合、接觸效率而定，但通?？蔀? 分鐘～ 10 分鐘。

提取可以通過分批操作進行，也可以通過連續(xù)操作進行。從提取效率高、容易將操作所需要的能量抑制在低水平的方面考慮，優(yōu)選連續(xù)操作。作為分批操作，可例舉振蕩操作、攪拌操作等。作為連續(xù)操作，可使用板式塔或填充塔等塔進行并流提取或者逆流提取。從提高提取效率、容易將裝置小型化的方面考慮，優(yōu)選使用填充塔進行逆流提取。

由該提取介質進行的提取中的分配系數根據作為對象的有機酸以及提取介質而定，但優(yōu)選0.2 以上，更優(yōu)選0.3 以上。此外，提取率優(yōu)選20％以上，更優(yōu)選25％以上。

作為提取介質，在并用酯化合物和烷基胺化合物的情況下，由該提取介質進行的提取中的分配系數優(yōu)選1.0 以上，更優(yōu)選1.4 以上。此外，提取率優(yōu)選50％以上，更優(yōu)選60％以上。

另一方面，發(fā)酵培養(yǎng)基所含的碳源( 例如葡萄糖)、發(fā)酵中生產的有機物( 例如乙醇)的提取率優(yōu)選20％以下，更優(yōu)選15％以下，進一步優(yōu)選10％以下，特別優(yōu)選5％以下。

提取液(1) 可通過減壓蒸留等除去提取介質，得到有機酸。優(yōu)選在第3 工序中使用水從提取液(1) 中提取該有機酸，得到含有有機酸的提取液(2)。從容易提高最終得到的有機酸的純度的方面考慮，優(yōu)選水中不含有鹽類。即，作為水可以是離子交換水、蒸餾水、純水等的任一種。由水進行的提取優(yōu)選在60 ～ 90℃，更優(yōu)選70 ～ 90℃下進行。在提取液(1)/ 水的體積比為0.5/1 ～ 2/1，優(yōu)選0.8/1 ～ 1.2/1 的條件下進行提取。提取時間根據混合、接觸效率而定，但通?？蔀? 小時～ 6 小時。

作為提取介質，在并用酯化合物和烷基胺化合物的情況下，由水進行的提取中的分配系數優(yōu)選1.0 以上，更優(yōu)選1.4 以上。此外，提取率優(yōu)選50％以上，更優(yōu)選60％以上。

優(yōu)選第3 工序與第2 工序連續(xù)進行，但也可以是分批式進行?？梢酝ㄟ^對第3 工序所得到的提取液(2) 以減壓蒸餾等除去水，得到有機酸。此時，可以對提取液(2)使用公知的方法例如活性碳處理等進行純化。

下面示出實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。但是，本發(fā)明并不局限于這些實施例。

含乳酸粗液的制備：使用現有技術制作的轉基因乳酸生產酵母ASP2782(將粟酒裂殖酵母作為宿主，整合入乳酸脫氫酶基因，并使該宿主的編碼丙酮酸脫羧酶的基因pdc-2缺失的轉化體) 進行乳酸發(fā)酵。在D12 液體培養(yǎng)基( 葡萄糖12％ )上接種該轉化體，在溫度32℃、振蕩速度100rpm 的條件下使其發(fā)酵20 小時，可得到乳酸濃度85.7g/L 的發(fā)酵液(pH2.3)。對該發(fā)酵液實施離心分離(12000G，5 分鐘)，得到作為含乳酸粗液的上清液。

實施例1～6

提取液(1)：將得到的含乳酸粗液和酯化合物以體積比1：1 進行混合。將得到的混合液在25℃下保持15 分鐘后振蕩1 分鐘，以離心分離(3000G，5分鐘) 分開有機相和水相。除去水相，得到提取液(1)。對該提取液(1) 中的乳酸濃度通過高效液相色譜分析(HPLC)法制；柱：東曹株式會社制，進行測定，求出提取率和提取分配系數。此外，在實施例1 中，同樣通過HPLC 法求出的葡萄糖、以及乙醇的提取率分別為2.3％和14.8％。

提取液(2)：在提取液(1) 中添加與該提取液(1) 相同體積的離子交換水，在80℃下攪拌5 小時后，以離心分離分開有機相和水相。除去有機相，得到提取液(2)。通過HPLC 法測定該提取液(2) 中的乳酸濃度，求出提取率和提取分配系數。

實施例7 ～ 12

提取液(1)：將得到的含乳酸粗液、酯化合物、和三正辛胺以體積比5 ∶ 2 ∶ 3 進行混合。將得到的混合液在25℃下保持15 分鐘后振蕩1 分鐘，以離心分離(3000G，5 分鐘)分開有機相和水相。除去水相，得到提取液(1)。通過HPLC 法測定該提取液(1) 中的乳酸濃度，求出提取率和提取分配系數。此外，在實施例7 中，同樣通過HPLC 法求出的葡萄糖、以及乙醇的提取率分別為3％和5％。

提取液(2)：在提取液(1) 中添加與該提取液(1) 相同體積的離子交換水，在80℃下攪拌5 小時后，以離心分離分開有機相和水相。除去有機相，得到提取液(2)。通過HPLC 法測定該提取液(2)中的乳酸濃度，求出提取率和提取分配系數。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點，本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內，本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。