一種檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法。該方法首先將陽離子型共軛聚合物與連接了熒光猝滅劑阿霉素的帶負(fù)電荷的透明質(zhì)酸通過靜電吸引結(jié)合；共軛聚合物的熒光由于與阿霉素之間的電子轉(zhuǎn)移被猝滅，且熒光強(qiáng)度隨阿霉素濃度的增大而減弱；當(dāng)加入透明質(zhì)酸酶時(shí)，它將透明質(zhì)酸鏈水解，使陽離子型共軛聚合物與透明質(zhì)酸的結(jié)合削弱，距離增大，阿霉素被釋放，熒光猝滅效應(yīng)減弱，共軛聚合物的熒光逐漸恢復(fù)，且共軛聚合物熒光恢復(fù)的程度與透明質(zhì)酸酶的濃度相關(guān)。該方法操作簡(jiǎn)便，響應(yīng)速度快，成本較低，具有較高的選擇性和靈敏度，在生物檢測(cè)、疾病的早期診斷和治療中有重要的意義。
【專利說明】一種檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物傳感及分析領(lǐng)域，特別涉及一種利用陽離子型共軛聚合物和透明質(zhì)酸探針檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法。
【背景技術(shù)】
[0002]共軛聚合物的共同特征是分子內(nèi)有大的η-電子共軛體系，提供了電荷大范圍遷移的條件，因?yàn)槠渲麈湹摩?- 共軛結(jié)構(gòu)與能提供P軌道的原子(如N，S等)相連的P- π共軛結(jié)構(gòu)形成了沿高分子鏈的離域η鍵，電荷可通過該離域η鍵沿高分子鏈運(yùn)動(dòng)。因此，共軛聚合物是一種非常高效的能量/電子傳遞介質(zhì)，它具有“分子導(dǎo)線”特征，即受激發(fā)產(chǎn)生的激子可以沿共軛主鏈迅速遷移。把銨根、羧酸根、磺酸根基團(tuán)或寡聚乙二醇等親水性基團(tuán)共價(jià)連接到共軛聚合物側(cè)鏈上可使其具有水溶性。通過引入陽離子基團(tuán)，可使整條聚合物鏈在水溶液中帶正電荷，能與帶負(fù)電荷的生物分子發(fā)生相互作用。
[0003]透明質(zhì)酸是一種帶負(fù)電的線性黏多糖，由(IH)D-葡糖醛酸(1-β-3)N-乙?；?D-氨基葡糖的雙糖單位重復(fù)連接組成。1934年美國哥倫比亞大學(xué)眼科教授Meyer等首先從牛眼玻璃體中分離出該物質(zhì)，隨后在人體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了它的存在。在機(jī)體內(nèi)，透明質(zhì)酸顯示出多種重要的生理功能:如維持組織結(jié)構(gòu)完整性、形成圍繞各個(gè)細(xì)胞的高度水合矩陣、促進(jìn)細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移及調(diào)解細(xì)胞間信號(hào)等(Rafal Fudala, MarkE.MummertjZygmunt Gryczynskijet al.Journal ofPhotochemistry and Photob1logyB:B1logy, 2012, (106):69 - 73)。它和蛋白質(zhì)、核酸一樣，都是生命過程的基本物質(zhì)，廣泛存在于生物體的軟結(jié)締組織中。透明質(zhì)酸分子中含有的大量羧基、羥基、酰胺基，在生理?xiàng)l件或適當(dāng)?shù)腜H環(huán)境下，羧基可充分解離成負(fù)離子。因此，透明質(zhì)酸具有突出的保水性能，還有粘彈性的雙重特征，即它的水溶液既具有凝膠的彈性，也具有溶液的粘性。近年來，由于透明質(zhì)酸獨(dú)特的理化性質(zhì)和生理功能，它已經(jīng)在諸多方面得到廣泛應(yīng)用，例如:保護(hù)眼睛、保護(hù)和潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)傷口愈合以及腫瘤的治療等。
[0004]透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase, HAase)是廣泛分布于自然界中的一類糖苷酶,它可斷開透明質(zhì)酸糖鏈中的N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖羧酸之間的糖苷鍵，將其解聚和水解成低相對(duì)分子質(zhì)量透明質(zhì)酸或寡糖。透明質(zhì)酸酶首次發(fā)現(xiàn)于1929年，Duran-Reynals在哺乳動(dòng)物睪丸及其他組織提取物中發(fā)現(xiàn)一種可促進(jìn)疫苗、染料、毒素等擴(kuò)散的“擴(kuò)散因子”，隨后被鑒定為透明質(zhì)酸酶(F.Duran-Reynals.Tissue permeability and the spreadingfactor in infect1n:A contribut1n to the host:parasite problem[J].Bacter1lRev, 1942,6(4):197-252)。透明質(zhì)酸酶在許多不同的癌癥細(xì)胞中都有過度表達(dá)，例如膀胱癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤等。幾種致癌細(xì)胞行為，包括組織入侵及血管再生的增強(qiáng)作用等，也與透明質(zhì)酸酶的活性增加有關(guān)。此外，透明質(zhì)酸酶也可用于抗癌化療劑，透明質(zhì)酸酶的加入可減少腫瘤細(xì)胞的抗藥性。因此，對(duì)透明質(zhì)酸酶進(jìn)行高效的檢測(cè)在腫瘤的早期診斷和治療等方面具有重要的理論和應(yīng)用研究?jī)r(jià)值。
[0005]目前已報(bào)道的透明質(zhì)酸酶的檢測(cè)方法有濁度法、粘度法、酶譜法、免疫測(cè)定法以及一些其他的化學(xué)方法等(Dan Cheng, Weiye Han, Kuncheng Yang, etal.Talanta, 2014(130):408 - 414)。其中應(yīng)用較多的方法濁度法，濁度法是基于大分子量的透明質(zhì)酸鹽于酸化血清中發(fā)生沉降現(xiàn)象建立起來的，但這種方法需要大量的酶，且測(cè)量結(jié)果相對(duì)不準(zhǔn)確。酶譜法較簡(jiǎn)單但不適合敏感的定量分析。免疫測(cè)定法則需要專業(yè)和昂貴的試劑。因此找到一種既能特異性檢測(cè)透明質(zhì)酸酶，又操作簡(jiǎn)便、快速、成本低的檢測(cè)方法，成為亟待解決的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]技術(shù)問題:本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)透明質(zhì)酸酶方法的不足，提供一種利用透明質(zhì)酸探針與陽離子型水溶性共軛聚合物結(jié)合的利用熒光信號(hào)來檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的方法，靈敏度和特異性好，并且操作簡(jiǎn)便、快速，成本低。
[0007]技術(shù)方案:本發(fā)明為一種基于陽離子型水溶性共軛聚合物和透明質(zhì)酸探針檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法，運(yùn)用該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)透明質(zhì)酸酶的定性和定量檢測(cè)。該技術(shù)的核心是利用透明質(zhì)酸酶與結(jié)合熒光猝滅劑透明質(zhì)酸探針發(fā)生作用前后，陽離子型水溶性共軛聚合物的熒光猝滅和恢復(fù)的程度進(jìn)行透明質(zhì)酸酶的檢測(cè)。當(dāng)透明質(zhì)酸酶濃度為零時(shí)，共軛聚合物與透明質(zhì)酸探針通過靜電作用結(jié)合，共軛聚合物的熒光由于與透明質(zhì)酸探針上的阿霉素之間的電子轉(zhuǎn)移被猝滅；當(dāng)透明質(zhì)酸酶濃度增大時(shí)，透明質(zhì)酸酶與透明質(zhì)酸發(fā)生作用，透明質(zhì)酸鏈被水解成片段，大大削弱了共軛聚合物與透明質(zhì)酸探針的靜電結(jié)合作用，使兩者的距離增大，因此共軛聚合物的熒光得以恢復(fù)；共軛聚合物熒光恢復(fù)的程度與透明質(zhì)酸酶的濃度相關(guān)，因此根據(jù)本方法可以對(duì)透明質(zhì)酸酶進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0008]本發(fā)明的檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法基于陽離子型水溶性共軛聚合物和透明質(zhì)酸HA探針，包括以下步驟:
[0009]I)制備結(jié)合熒光猝滅劑的透明質(zhì)酸探針；
[0010]2)將陽離子型水溶性共軛聚合物與所述透明質(zhì)酸探針結(jié)合，進(jìn)行熒光檢測(cè)；
[0011]3)在透明質(zhì)酸探針中加入透明質(zhì)酸酶，待其與透明質(zhì)酸酶作用后，在其中加入陽離子水溶性共軛聚合物，再次進(jìn)行熒光檢測(cè)。
[0012]突光粹滅劑包括阿霉素DOX的小分子突光粹滅劑。
[0013]所述陽離子型水溶性共軛聚合物，其熒光發(fā)射由于與阿霉素?zé)晒忖鐒┲g的電子轉(zhuǎn)移能夠被粹滅。
[0014]所述陽離子型水溶性共軛聚合物與透明質(zhì)酸探針是通過靜電吸引作用結(jié)合。
[0015]所述透明質(zhì)酸探針與透明質(zhì)酸酶的作用，是透明質(zhì)酸酶將透明質(zhì)酸鏈水解為透明質(zhì)酸短鏈的過程。
[0016]所述的熒光檢測(cè)中，所使用的緩沖溶液是0.15M NaCU0.02M PBS緩沖液，pH =
5.6o
[0017]所述的熒光檢測(cè)中，溫度為25°C。
[0018]所述熒光檢測(cè)，是加入透明質(zhì)酸酶溶液在37°C下孵育30分鐘后測(cè)量熒光發(fā)射光
-1'TfeP曰。
[0019]所述的熒光檢測(cè)是用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)在陽離子型水溶性共軛聚合物最大紫外-可見吸收峰處，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為415 — 600nm。
[0020]有益效果:本發(fā)明所述的熒光檢測(cè)方法基于水溶性共軛聚合物信號(hào)倍增和實(shí)時(shí)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，以及阿霉素能夠猝滅水溶性共軛聚合物的熒光和透明質(zhì)酸酶能夠水解透明質(zhì)酸的特點(diǎn)，利用透明質(zhì)酸酶與透明質(zhì)酸探針發(fā)生作用前后，陽離子型水溶性共軛聚合物的熒光恢復(fù)的程度進(jìn)行透明質(zhì)酸酶的檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)便，響應(yīng)速度快，成本較低，且具有較高的選擇性和靈敏度，是一種分析效率較高的檢測(cè)方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為陽離子型水溶性共軛聚合物(PFEP)、透明質(zhì)酸(HA)、阿霉素(DOX)的分子結(jié)構(gòu)式。
[0022]圖2為利用陽離子型水溶性共軛聚合物和透明質(zhì)酸探針檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的工作原理圖。
[0023]圖3為基于陽離子型水溶性共軛聚合物和透明質(zhì)酸探針的熒光檢測(cè)方法對(duì)不同濃度的透明質(zhì)酸酶進(jìn)行檢測(cè)的熒光光譜圖。透明質(zhì)酸酶濃度范圍為O?1.85U/mL。
[0024]圖4為不同濃度透明質(zhì)酸酶加入待測(cè)體系前后，體系熒光強(qiáng)度變化的對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線圖。注解:小圖表示體系熒光強(qiáng)度與O?1.30U/mL濃度范圍內(nèi)的透明質(zhì)酸酶的線性關(guān)系圖。
[0025]圖5為特異性分析圖。分別為檢測(cè)底液中加入透明質(zhì)酸酶，凝血酶(Thrombin),溶菌酶(Lysozyme)和PBS緩沖溶液的對(duì)比結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0026]為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面以陽離子型水溶性共軛聚合物和熒光素標(biāo)記的透明質(zhì)酸探針檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的實(shí)驗(yàn)為例，說明本發(fā)明技術(shù)的【具體實(shí)施方式】。
[0027]運(yùn)用該技術(shù)包括如下三個(gè)步驟:
[0028]I)制備結(jié)合阿霉素的透明質(zhì)酸探針；
[0029]2)將陽離子型水溶性共軛聚合物與所述透明質(zhì)酸探針結(jié)合，進(jìn)行熒光檢測(cè)；
[0030]3)在透明質(zhì)酸探針中加入透明質(zhì)酸酶，待其與透明質(zhì)酸酶作用后，在體系中加入陽離子水溶性共軛聚合物，再次進(jìn)行熒光檢測(cè)。
[0031]其中:
[0032]步驟I反應(yīng)機(jī)理為:透明質(zhì)酸上的羧基與阿霉素上的氨基在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的催化作用下發(fā)生縮合反應(yīng)連接在一起。透明質(zhì)酸和阿霉素的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。
[0033]步驟2中的陽離子型水溶性共軛聚合物可參照文獻(xiàn)(Huang Y Q, Fan QL，Lu X M，F(xiàn)ang C，Liu S J，Li Hj Wen Yj Wang L H，Huang W.Journal ofPolymerScience: PartA: Polymer Chemistry2006，44 (19)，5778-5794)制備，其濃度以重復(fù)單兀的摩爾濃度表示。透明質(zhì)酸探針的濃度也以其重復(fù)單元的摩爾濃度表示。該共軛聚合物通過靜電吸引作用與透明質(zhì)酸探針結(jié)合，使該共軛聚合物的熒光被阿霉素猝滅，從而使熒光信號(hào)顯著減弱。共軛聚合物的熒光恢復(fù)程度用加入透明質(zhì)酸酶前后的熒光強(qiáng)度的比值，即I。/Itl來表示。當(dāng)透明質(zhì)酸酶濃度為零時(shí)，共軛聚合物的熒光強(qiáng)度用Itl表示。
[0034]熒光檢測(cè)所用的儀器為島津RF-5301PC熒光分光光度計(jì)。熒光光譜測(cè)量條件:氣燈激發(fā)，激發(fā)波長(zhǎng)為404nm，發(fā)射掃描范圍為415_600nm。檢測(cè)緩沖液為pH = 5.6的0.15MNaCU0.02M PBS緩沖液，用4mL石英比色皿進(jìn)行測(cè)量，樣品體積2.7mL ;陽離子型水溶性共軛聚合物濃度為1.5X 10_7mol/L，透明質(zhì)酸探針的濃度為O?3.1X 10_6mol/L，檢測(cè)溫度25。。。
[0035]步驟3在透明質(zhì)酸探針中加入透明質(zhì)酸酶，在37°C下孵育30分鐘后，在體系中加入陽離子水溶性共軛聚合物后進(jìn)行熒光檢測(cè)。由于透明質(zhì)酸酶將透明質(zhì)酸鏈水解，削弱了共軛聚合物與透明質(zhì)酸探針的靜電結(jié)合作用，使兩者的距離增大，阿霉素對(duì)共軛聚合物的熒光猝滅作用減弱，共軛聚合物的熒光得以恢復(fù)。用^表示加入透明質(zhì)酸酶后共軛聚合物的熒光強(qiáng)度，計(jì)算熒光強(qiáng)度變化的相對(duì)值Λ I:
[0036]Δ I = Ic/10
[0037]Λ I與透明質(zhì)酸酶的濃度相關(guān)，根據(jù)兩者的關(guān)系曲線可以對(duì)透明質(zhì)酸酶進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0038]熒光檢測(cè)所用的儀器、熒光光譜測(cè)量條件、檢測(cè)緩沖液同步驟2，用700uL石英比色皿進(jìn)行測(cè)量，樣品體積540uL ;陽離子型水溶性共軛聚合物濃度為1.5X10_7mol/L，透明質(zhì)酸探針的濃度為1.48X 10_6mOl/L，透明質(zhì)酸酶的濃度為O?1.85U/mL，檢測(cè)溫度25°C。
[0039]實(shí)施例1檢測(cè)不同濃度的透明質(zhì)酸酶
[0040]在溫度為25°C，pH = 5.6的PBS緩沖液中，向含8 X 10_5mol/L透明質(zhì)酸探針的底液中加入一系列不同量的透明質(zhì)酸酶，在37°C下孵育30分鐘，之后稀釋至透明質(zhì)酸探針濃度為1.48X10_6mol/L，加入1.5X10_7mol/L陽離子型水溶性共軛聚合物，掃描其熒光發(fā)射光譜，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示透明質(zhì)酸酶的終濃度分別為0、0.19,0.38,0.56,0.74,0.93、1.11、
1.30、1.49、1.85U/mL。從圖中可見隨著透明質(zhì)酸酶的濃度增大，陽離子型水溶性共軛聚合物的熒光恢復(fù)程度越高。計(jì)算△ I，對(duì)透明質(zhì)酸酶的濃度作圖得圖4。該圖表明在透明質(zhì)酸酶濃度為O?1.30U/mL范圍內(nèi)具有很好的線性范圍，大于該范圍，Λ I的曲線趨向平緩，表示加入透明質(zhì)酸酶的濃度趨于飽和。
[0041]該方法的檢測(cè)限公式:L0D = 3&/S，其中Stl表示空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S表示在該方法線性范圍內(nèi)的靈敏度(Eggins B R, Chemical Sensors and B1sensors, Johnffiley&Sons Ltd, West Sussex, England, 2002)。本實(shí)驗(yàn)空白樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04,結(jié)合線性曲線的靈敏度計(jì)算得到檢測(cè)限為0.075U/mL。
[0042]實(shí)施例2特異性分析
[0043]檢測(cè)1:將濃度為0.38U/mL的透明質(zhì)酸酶加入檢測(cè)底液中，其它實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例I。
[0044]同時(shí)，做如下試驗(yàn)作為對(duì)比。
[0045]檢測(cè)2:用等體積濃度為透明質(zhì)酸酶5倍的溶菌酶(Lysozyme)和凝血酶(Thrombin)進(jìn)行試驗(yàn),作為陰性對(duì)照,其它實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例1。
[0046]檢測(cè)3:用等體積的空白緩沖溶液代替透明質(zhì)酸酶進(jìn)行試驗(yàn)，作為空白對(duì)照，其它實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例1。
[0047]結(jié)果如圖5所示。加入透明質(zhì)酸酶的檢測(cè)體系的共軛聚合物的熒光恢復(fù)程度顯著高于其他3種對(duì)照體系，表明該方法對(duì)透明質(zhì)酸酶的檢測(cè)具有較高的特異性。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法，其特征在于該方法基于陽離子型水溶性共軛聚合物和透明質(zhì)酸HA探針，包括以下步驟: 1)制備結(jié)合熒光猝滅劑的透明質(zhì)酸探針； 2)將陽離子型水溶性共軛聚合物與所述透明質(zhì)酸探針結(jié)合，進(jìn)行熒光檢測(cè)； 3)在透明質(zhì)酸探針中加入透明質(zhì)酸酶，待其與透明質(zhì)酸酶作用后，在其中加入陽離子水溶性共軛聚合物，再次進(jìn)行熒光檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法，其特征在于熒光猝滅劑包括阿霉素DOX的小分子熒光猝滅劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法，其特征在于所述陽離子型水溶性共軛聚合物，其熒光發(fā)射由于與阿霉素?zé)晒忖鐒┲g的電子轉(zhuǎn)移能夠被猝滅。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法，其特征在于所述陽離子型水溶性共軛聚合物與透明質(zhì)酸探針是通過靜電吸引作用結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法，其特征在于所述透明質(zhì)酸探針與透明質(zhì)酸酶的作用，是透明質(zhì)酸酶將透明質(zhì)酸鏈水解為透明質(zhì)酸短鏈的過程。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法，其特征在于所述的熒光檢測(cè)中，所使用的緩沖溶液是0.15M NaCU0.02M PBS緩沖液，pH = 5.6。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法，其特征在于所述的熒光檢測(cè)中，溫度為25°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法，其特征在于所述熒光檢測(cè)，是加入透明質(zhì)酸酶溶液在37°C下孵育30分鐘后測(cè)量熒光發(fā)射光譜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)透明質(zhì)酸酶的熒光方法，其特征在于所述的熒光檢測(cè)是用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)在陽離子型水溶性共軛聚合物最大紫外-可見吸收峰處，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為415 — 600nm。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104390947SQ201410669140
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】黃艷琴, 宋彩霞, 劉興奮, 范曲立, 黃維 申請(qǐng)人:南京郵電大學(xué)