大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)光學(xué)與分子影像學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大斯托克斯位移 熒光蛋白CyOFP及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)與分子影像學(xué)領(lǐng)域中，熒光蛋白在研究活體細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)水 平、蛋白相互作用、蛋白質(zhì)構(gòu)象以及蛋白活性中有著重要的應(yīng)用。但是，在使用熒光蛋白進(jìn) 行活體成像時(shí)，往往難以實(shí)現(xiàn)多通道同時(shí)成像，若能突破這一限制，則可實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)生物快 速反應(yīng)事件的檢測(cè)，將極大推動(dòng)神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展。在單光子成像中，可采用由不同激發(fā)波長(zhǎng) 的光激發(fā)多種熒光蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)多通道同時(shí)成像。然而，在多光子成像中，添加一個(gè)二級(jí)鈦藍(lán) 寶石雷射或光學(xué)參數(shù)振蕩器的費(fèi)用較高，并且難以將它們調(diào)控到一起，因此，多種熒光蛋白 同時(shí)成像較難實(shí)現(xiàn)。開(kāi)發(fā)出大斯托克斯位移的熒光蛋白可有效的解決這一問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)同一 激發(fā)波長(zhǎng)的光同時(shí)激發(fā)兩種熒光蛋白，然后發(fā)射出不同波長(zhǎng)區(qū)域的光，達(dá)到兩種熒光蛋白 多光子同時(shí)成像的目的。該方法具有操作簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求不高、成像效果好等優(yōu)點(diǎn)。
[0003] 目前同時(shí)成像多個(gè)生物分子事件的顯微鏡方法包括，探測(cè)薄樣品的超分辨結(jié)構(gòu)光 照明，散射組織中提升分辨率的自適應(yīng)光學(xué)，提高成像速度的隨機(jī)掃描雙光子技術(shù)，以及可 以降低光毒性與光漂白同時(shí)又能提高成像速度的光片式照明，它可以通過(guò)貝塞爾光束或光 學(xué)晶格、非相干聚焦等方式實(shí)現(xiàn)。這些顯微鏡方法均依賴(lài)于對(duì)激光的動(dòng)態(tài)調(diào)制，因此，如果 想做多色的（雙波長(zhǎng)，多波長(zhǎng))熒光成像就要求多套重復(fù)的光學(xué)器件，以及更加精確的同步 控制，這造成了一些技術(shù)難關(guān)。如能開(kāi)發(fā)出一種大斯托克斯位移的熒光蛋白，并能和常用的 綠色熒光蛋白結(jié)合在一起使用，將使兩種不同的生物反應(yīng)事件可視化，大大降低對(duì)光學(xué)器 件的高要求。
[0004] 生物發(fā)光由于其不需要光激發(fā)、背景低特點(diǎn)，已成為活體光學(xué)成像的重要手段之 一。然而較亮的熒光素酶(通過(guò)與底物的生化反應(yīng)而產(chǎn)生光子)不僅量子產(chǎn)率低，而且發(fā)射 光子的波長(zhǎng)較短(激發(fā)峰<600nm)，因此限制其在動(dòng)物體內(nèi)的應(yīng)用。基于熒光素酶和熒光蛋 白的生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)則很好的解決了上述問(wèn)題。然而，目前基于BRET的生物 發(fā)光探針中的紅色熒光蛋白的量子產(chǎn)率相對(duì)較低(〈0.4)，而且熒光素酶的發(fā)射光譜與熒光 蛋白的吸收譜重疊較少，因此BRET效率較低。因此，需要能夠與現(xiàn)有最亮的熒光素酶(Nluc， 發(fā)射峰在460nm)在光譜上有高重疊的焚光蛋白，而且其發(fā)射峰在600nm處。
[0005]斯托克斯位移指的是熒光物質(zhì)的最大發(fā)射波長(zhǎng)和最大激發(fā)波長(zhǎng)之差。該差值若大 于100nm，則認(rèn)為該熒光蛋白具有大斯托克斯位移的特性。大斯托克斯位移的熒光蛋白在多 色雙光子成像時(shí)，可保證兩個(gè)不同光譜的熒光蛋白可被同時(shí)熒光成像，并且有效地減少熒 光光譜的串?dāng)_。此外，它(受體)可以與熒光素酶(供體)一起在生物體內(nèi)進(jìn)行非輻射的能量 轉(zhuǎn)移，也就是生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)。由于BRET不需外源光激發(fā)且背景低，因此生物 發(fā)光成像靈敏度非常高，已經(jīng)在蛋白相互作用、活體影像、核酸分析、蛋白酶檢測(cè)及高通量 篩選等生物分析相關(guān)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。
[0006] 最早報(bào)道的大斯托克斯位移的熒光蛋白為mKeima，它是一種紅色熒光蛋白，其發(fā) 射與吸收峰分別位于440和620nm，采用458nm的光激發(fā)CFP和mKeima，可達(dá)到同時(shí)激發(fā)兩個(gè) 焚光分子的目的，從而實(shí)現(xiàn)單光源的多色成像(KogureT，KarasawaS，ArakiT，SaitoK， KinjoM,MiyawakiA.Afluorescentvariantofaproteinfromthestonycoral Montiporafacilitatesdual-colorsingle-laserfluorescencecross-correlation spectroscopy.NatBiotechnol，2006，24:577-581)。但mKeima的缺點(diǎn)在于，它有兩個(gè)激發(fā) 峰，除了能在440nm處被激發(fā)，還能在584nm處被激發(fā)，這對(duì)多色成像造成了一些困難。為了 克服mKeima的這一缺點(diǎn)，？丨&丨1^￥；[0111(.0.等人于2010年得到了焚光蛋白突變體1^3-1111^七61 和LSS-mKate2,這兩個(gè)突變體具有同樣的激發(fā)波長(zhǎng)，但發(fā)射波長(zhǎng)卻不同，因此，可較好的利 用它們進(jìn)行雙光子活體觀察腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等生理生化反應(yīng)(PiatkevichKD，HulitJ， SubachOM,ffuB,AbdullaA,SegallJE,VerkhushaVV.Monomericredfluorescent proteinswithalargeStokesshift.ProcNatlAcadSciUSA,2010,107:5369-5374)。崔博宇等人在2014年構(gòu)建了一種基于細(xì)菌熒光素酶LuxAB的BRET系統(tǒng)，將LuxAB作為 供體，增強(qiáng)型黃色熒光蛋白eYFP作為受體，該系統(tǒng)可有效的接受細(xì)菌熒光素酶LuxAB發(fā)射的 藍(lán)色光，并激發(fā)出黃色的熒光，產(chǎn)生明顯的能量轉(zhuǎn)移信號(hào)，進(jìn)一步證實(shí)發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)還能夠檢 測(cè)細(xì)菌胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)相互作用（崔博宇.基于細(xì)菌熒光素酶的BRET蛋白相互作用檢測(cè) 技術(shù)研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014)。
[0007] 然而，在活體生物體內(nèi)，雙光子同步成像的BRET系統(tǒng)效果并不理想。經(jīng)典的BRET技 術(shù)使用受體多為綠色熒光蛋白突變體，體系發(fā)射光較短，活體成像深度較淺;現(xiàn)有的大斯托 克斯位移熒光蛋白不能高效的與綠色熒光蛋白一起被激發(fā)，發(fā)射出有別于EGFP的光子，因 此雙光子成像靈敏度相對(duì)較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決上述存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種大斯托克斯位移熒光 蛋白CyOFP，該焚光蛋白是由遠(yuǎn)紅外焚光蛋白mNeptune定點(diǎn)誘變篩選得到的。
[0009] 本發(fā)明的另一目的還在于提供上述大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP在顯微成像和 高靈敏活體生物發(fā)光成像中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：
[0011] -種大斯托克斯位移熒光蛋白，該熒光蛋白是一種突變的遠(yuǎn)紅外熒光蛋白 mNeptune，與遠(yuǎn)紅外焚光蛋白mNeptune的氨基酸序列相比，大斯托克斯位移焚光蛋白CyOFP 具有以下突變位點(diǎn):Μ160K。該突變位點(diǎn)體現(xiàn)了該大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP的大斯托 克斯位移特性，具體為mNeptune氨基酸序列的第160位的Met被Lys所取代;其中mNeptune的 氨基酸序列的第1-240位對(duì)應(yīng)于如SEQIDNo: 1所示的第4-244位。
[0012]上述的大斯托克斯位移焚光蛋白的氨基酸序列與遠(yuǎn)紅外焚光蛋白mNeptune的氨 基酸序列相比，具有以下突變位點(diǎn)：M11S、M15L、S28H、G41N、C61H、T94M、Y96F、C172V、L174F。 這些突變位點(diǎn)體現(xiàn)了該大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP的亮度特性，具體為mNeptune的氨 基酸序列的第11位的Met被Ser所取代，第15位的Met被Leu所取代，第28位的Ser被His所取 代，第41位的Gly被Asn所取代，第61位的Cys被His所取代，第94位的Thr被Met所取代，第96 位的Tyr被Phe所取代，第172位的Cys被Val所取代，第174位的Leu被Phe所取代。
[0013]上述的大斯托克斯位移焚光蛋白的氨基酸序列與遠(yuǎn)紅外焚光蛋白mNeptune的氨 基酸序列相比，具有以下突變位點(diǎn)：H10R、T18S、N21G、H23Q、T38K、T68V、N71K、H72Y、T73P、 Q74A、G75D、I76L、F79Y、C114E、I121V、S128A、A142P、R179K、L187V、Y193H、H214Y、V216H。這 些突變位點(diǎn)體現(xiàn)了該大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP的成熟率特性，具體為mNeptune的氨 基酸序列的第10位的His被Arg所取代，第18位的Thr被Ser所取代，第21位的Asn被Gly所取 代，第23位的His被Gin所取代，第38位的Thr被Lys所取代，第68位的Thr被Val所取代，第71 位的Asn被Lys所取代，第72位的His被Tyr所取代，第73位的Thr被Pro所取代，第74位的Gin 被Ala所取代，第75位的Gly被Asp所取代，第76位的Ile被Leu所取代，第79位的Phe被Tyr所 取代，第114位的Cys被Glu所取代，第121位的Ile被Val所取代，第128位的Ser被Ala所取代， 第142位的Ala被Pro所取代，第179位的Arg被Lys所取代，第187位的Leu被Val所取代，第193 位的Tyr被His所取代，第214位的His被Tyr所取代，第216位的Val被His所取代。
[0014]上述的大斯托克斯位移焚光蛋白的氨基酸序列與遠(yuǎn)紅外焚光蛋白mNeptune的氨 基酸序列相比，具有以下突變位點(diǎn)：T95V、I171H、F194Y、C222S、D223N、P225G、S226G、K227G、 Δ228-234。這些突變位點(diǎn)體現(xiàn)了該大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP的單體性，具體為 mNeptune的氨基酸序列的第95位的Thr被Val所取代，第171位的lie被His所取代，第194位 的Phe被Tyr所取代，第222位的Cys被Ser所取代，第2