一種鹽生杜氏藻中微量元素含量測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鹽生杜氏藻中β-胡蘿卜素和葉綠素a含量測(cè)定方法，屬水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域。β-胡蘿卜素含量測(cè)定傳統(tǒng)上是將β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品用石油醚-異丙醇混合液稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將所得的樣品溶液進(jìn)行液相色譜分析，從而得知樣品中β-胡蘿卜素含量。該法結(jié)果準(zhǔn)確，測(cè)試費(fèi)用低，但耗時(shí)長(zhǎng)，設(shè)備昂貴，操作繁瑣。海藻中葉綠素測(cè)定傳統(tǒng)上采用分光光度計(jì)法，操作麻煩，技術(shù)性強(qiáng)，設(shè)備昂貴。本發(fā)明公開(kāi)的萃取法測(cè)定鹽生杜氏藻中β-胡蘿卜素和葉綠素a含量，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，結(jié)果準(zhǔn)確，費(fèi)用低，可一次完成多個(gè)樣品的測(cè)定。
【專利說(shuō)明】—種鹽生杜氏藻中微量元素含量測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及一種鹽生杜氏藻中β_胡蘿卜素和葉綠素a含量測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]鹽生杜氏藻Dunaliella salina為雙鞭毛單細(xì)胞綠藻，廣布于內(nèi)陸鹽湖，可耐高鹽度(20-300%。)，個(gè)體較大(16-24 μ mX 10-13 μ m)，因能大量合成β-胡蘿卜素(最高可達(dá)干重的14%)而受到廣泛重視。胡蘿卜素是人體內(nèi)維生素A的前體，可用于防治癌癥、心血管病及老年性癡呆等退行性疾病，還能作為高級(jí)天然色素用于食品加工。臨床試驗(yàn)表明，鹽生杜氏藻提取的鹽藻素對(duì)調(diào)節(jié)血壓、降低血脂、降血糖、糖尿病、酒精肝、脂肪肝、胃潰瘍、胃炎、白內(nèi)障、夜盲癥、干眼病有較好療效且可明顯提高機(jī)體免疫力。目前，澳大利亞、以色列、美國(guó)、中國(guó)、日本、西班牙、加拿大等已有幾十家公司從事鹽生杜氏藻生產(chǎn)。我國(guó)具有漫長(zhǎng)的海岸線和星羅棋布的內(nèi)陸鹽湖，具有培養(yǎng)鹽生杜氏藻生產(chǎn)β_胡蘿卜素得天獨(dú)厚的自然條件。
[0003]β_胡蘿卜素含量是衡量鹽生杜氏藻質(zhì)量好壞的最重要指標(biāo)，藻液中β_胡蘿卜素含量的測(cè)定一直是一個(gè)麻煩、費(fèi)時(shí)、費(fèi)事、費(fèi)力、令人頭疼的工作。以前，鄧同樂(lè)發(fā)明了一種β_胡蘿卜素提取物中β_胡蘿卜素含量的定量檢測(cè)方法(專利號(hào)CN201410235214)，具體步驟是:1)將β_胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品用石油醚-異丙醇混合液稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；2)稱取待測(cè)的β-胡蘿卜素提取物溶于石油醚-異丙醇混合液中，作為樣品溶液；3)將步驟I)所得的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和步驟2)所得的樣品溶液分別進(jìn)行高效液相色譜分析；從而分別獲得系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及樣品溶液中胡蘿卜素的吸收峰面積比；4)建立β_胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線；5)將樣品溶液中胡蘿卜素的峰高代入步驟4)所得的曲線方程中，從而最終得知待測(cè)的β_胡蘿卜素提取物中β_胡蘿卜素的含量。該方法結(jié)果準(zhǔn)切可靠，測(cè)試費(fèi)用低，但耗時(shí)長(zhǎng)，設(shè)備昂貴，操作繁瑣，技術(shù)要求高，效率低。
[0004]關(guān)于海藻中葉綠素測(cè)定方法，過(guò)去黃廷林曾公開(kāi)了一種水生藻類葉綠素測(cè)定方法(專利號(hào)200410073542)，該方法用分光光度法測(cè)定水中藻類葉綠素含量，采用醋酸纖維微孔濾膜過(guò)濾水中藻類，用90%乙醇浸泡研磨截留了藻類的醋酸纖維膜，將藻類細(xì)胞中的葉綠素萃取到乙醇中，將萃取液離心獲得澄清液，以90%乙醇作參比，用分光光度計(jì)測(cè)定萃取液在630、647、664、750nm處的吸光度，利用測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算水樣中葉綠素a、b、c的含量。劉春光也發(fā)明了一種水中浮游藻類葉綠素a的測(cè)定方法(專利號(hào)200610129454)，其原理和具體操作步驟與黃廷林的發(fā)明相近。他們的發(fā)明測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，安全無(wú)污染，但缺點(diǎn)也很明顯，操作麻煩，技術(shù)性強(qiáng)，對(duì)測(cè)試人員要求高，設(shè)備昂貴，儀器投資大，實(shí)用性不強(qiáng)。
[0005]為了克服傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，我發(fā)明了一種萃取法測(cè)定鹽生杜氏藻中胡蘿卜素和葉綠素a含量方法，該法操作簡(jiǎn)便，技術(shù)性要求不高，耗時(shí)短，結(jié)果準(zhǔn)確，費(fèi)用低，可一次完成多個(gè)樣品的測(cè)定。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種鹽生杜氏藻中胡蘿卜素和葉綠素a含量測(cè)定方法，方法如下:
[0007]β -胡蘿卜素含量的測(cè)定方法
[0008]步驟I將鹽生杜氏藻培養(yǎng)至第13天時(shí)，藻細(xì)胞密度可達(dá)到250X 104-400X 14Cell/每暈升，用移液管移取藻液100暈升，裝入250暈升的三角燒瓶中；
[0009]步驟2加入15克NaCl，加入80%乙二醇(由乙二醇和蒸餾水按80: 20體積比混合而成)120毫升，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻20分鐘，充分萃??；
[0010]步驟3此時(shí)液體分成上清液和下濁液，用20毫升的移液管移取上清液，加入到250毫升的容量瓶中，用80%乙二醇定容至250毫升；
[0011]步驟4轉(zhuǎn)入250毫升圓底燒瓶中，在搖床上搖勻60分鐘，用721型分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)425nm時(shí)的吸光值OD425，用下式計(jì)算β -胡蘿卜素含量
[0012]β -胡蘿卜素含量(mg/L)=(最后定容體積X 9.84X OD425) + (2.91X藻液取樣體積)
[0013]最后算出的β -胡蘿卜素含量單位是(mg/L)，即每升藻液中含有的β -胡蘿卜素毫克數(shù)。葉綠素a含量的測(cè)定方法
[0014]步驟5將鹽生杜氏藻培養(yǎng)至第9天時(shí)，藻細(xì)胞密度可達(dá)到150 X 104-300 X 14Cell/每暈升，用量筒取藻液200暈升藻液,倒入500暈升的三角燒瓶中；
[0015]步驟6加入20克硫酸亞鐵，加入240毫升85%的丁酮(由丁酮和蒸餾水按85: 15體積比混合而成)，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻25分鐘，充分萃??；
[0016]步驟7此時(shí)液體分成明顯的上下兩層，上層清亮，下層渾濁，用移液管取上清液至500毫升的容量瓶中，用85%丁酮定容至500毫升，轉(zhuǎn)入1000毫升燒杯中，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，置于搖床上搖勻15分鐘；
[0017]步驟8用分光光度計(jì)分別測(cè)定波長(zhǎng)624nm和725nm時(shí)的吸光值OD624、OD725，用下式計(jì)算葉綠素a含量
[0018]葉綠素a含量(mg/L) = [(19.62X0D624+4.83 X OD725) +藻液取樣體積]X最后定容體積最后算出的葉綠素a含量單位是mg/L，即每升藻液中含有的葉綠素a毫克數(shù)。
[0019]有益結(jié)果
[0020]關(guān)于β-胡蘿卜素含量的測(cè)定方法，鄧同樂(lè)曾發(fā)明了一種胡蘿卜素提取物中β_胡蘿卜素含量的定量檢測(cè)方法(專利號(hào)CN201410235214)，該方法結(jié)果準(zhǔn)切可靠，測(cè)試費(fèi)用低，但耗時(shí)長(zhǎng)，設(shè)備昂貴，操作繁瑣，技術(shù)要求高，效率低。關(guān)于海藻中葉綠素測(cè)定方法，過(guò)去黃廷林曾公開(kāi)了一種水生藻類葉綠素測(cè)定方法(專利號(hào)200410073542)，劉春光也發(fā)明了一種水中浮游藻類葉綠素a的測(cè)定方法(專利號(hào)200610129454)，他們的發(fā)明測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，安全無(wú)污染，測(cè)試費(fèi)用低，但缺點(diǎn)也很明顯:操作麻煩，技術(shù)性強(qiáng)，對(duì)測(cè)試人員要求高，設(shè)備昂貴，儀器投資大，實(shí)用性不強(qiáng)。為了克服傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，我發(fā)明了一種鹽生杜氏藻中胡蘿卜素和葉綠素a含量測(cè)定方法，本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，技術(shù)性要求不高，耗時(shí)短，結(jié)果準(zhǔn)確，費(fèi)用低，可一次完成多個(gè)樣品的測(cè)定。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為鹽生杜氏藻中β -胡蘿卜素測(cè)定具體操作流程；
[0022]圖2為鹽生杜氏藻中葉綠素a含量測(cè)定具體操作流程。

【具體實(shí)施方式】
[0023]β -胡蘿卜素含量的測(cè)定方法
[0024]1)步驟1將鹽生杜氏藻培養(yǎng)至第13天時(shí)，藻細(xì)胞密度可達(dá)到250X 104-400X 104cell/每暈升，用移液管移取藻液100暈升，裝入250暈升的三角燒瓶中；
[0025]2)步驟2加入15克NaCl，加入80%乙二醇(由乙二醇和蒸餾水按80: 20體積比混合而成)120毫升，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻20分鐘，充分萃取；
[0026]3)步驟3此時(shí)液體分成上清液和下池液，用20暈升的移液管移取上清液,加入到250毫升的容量瓶中，用80%乙二醇定容至250毫升；
[0027]4)步驟4轉(zhuǎn)入250毫升圓底燒瓶中，在搖床上搖勻60分鐘，用721型分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)425nm時(shí)的吸光值0D425，用下式計(jì)算β -胡蘿卜素含量β -胡蘿卜素含量(mg/L)=(最后定容體積X9.84X0D425) + (2.91 X藻液取樣體積)最后算出的β-胡蘿卜素含量單位是(mg/L)，即每升藻液中含有的β_胡蘿卜素毫克數(shù)。葉綠素a含量的測(cè)定方法
[0028]5)步驟5將鹽生杜氏藻培養(yǎng)至第9天時(shí)，藻細(xì)胞密度可達(dá)到150X 104-300X 104cell/每暈升，用量筒取藻液200暈升藻液，倒入500暈升的三角燒瓶中；
[0029]6)步驟6加入20克硫酸亞鐵，加入240毫升85%的丁酮(由丁酮和蒸餾水按85: 15體積比混合而成)，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻25分鐘，充分萃??；
[0030]7)步驟7此時(shí)液體分成明顯的上下兩層，上層清亮，下層渾濁，用移液管取上清液至500毫升的容量瓶中，用85%丁酮定容至500毫升，轉(zhuǎn)入1000毫升燒杯中，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，置于搖床上搖勻15分鐘；
[0031]8)步驟8用分光光度計(jì)分別測(cè)定波長(zhǎng)624nm和725nm時(shí)的吸光值0D624、0D725，用下式計(jì)算葉綠素a含量
[0032]葉綠素a含量(mg/L) = [ (19.62 X 0D624+4.83 X 0D725) +藻液取樣體積]X最后定容體積最后算出的葉綠素a含量單位是mg/L，即每升藻液中含有的葉綠素a毫克數(shù)；
[0033]9)步驟2、3所用NaCl、乙二醇和步驟6、7所用硫酸亞鐵、丁酮等化學(xué)藥品純度均需分析純級(jí)別而非化學(xué)純或試劑純；
[0034]10)步驟2、6所用蒸餾水如果用三蒸水代替更好；
[0035]11)步驟1至7中所用三角燒瓶、燒杯、圓底燒瓶、容量瓶和移液管等玻璃儀器均需洗刷干凈，后用蒸餾水潤(rùn)洗3遍，最后在50°C烘箱中烘干使用。
[0036]即一種鹽生杜氏藻中β -胡蘿卜素和葉綠素a含量測(cè)定方法，方法如下:
[0037]β -胡蘿卜素含量的測(cè)定方法
[0038]步驟1將鹽生杜氏藻培養(yǎng)至第13天時(shí)，藻細(xì)胞密度可達(dá)到250X 104-400X 104cell/每暈升，用移液管移取藻液100暈升，裝入250暈升的三角燒瓶中；
[0039]步驟2加入15克NaCl，加入80%乙二醇(由乙二醇和蒸餾水按80: 20體積比混合而成)120毫升，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻20分鐘，充分萃??；
[0040]步驟3此時(shí)液體分成上清液和下濁液，用20毫升的移液管移取上清液，加入到250毫升的容量瓶中，用80%乙二醇定容至250毫升；
[0041]步驟4轉(zhuǎn)入250毫升圓底燒瓶中，在搖床上搖勻60分鐘，用721型分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)425nm時(shí)的吸光值0D425，用下式計(jì)算β -胡蘿卜素含量
[0042]β -胡蘿卜素含量(mg/L)=(最后定容體積X9.84X0D425) + (2.91X藻液取樣體積)
[0043]最后算出的β -胡蘿卜素含量單位是(mg/L)，即每升藻液中含有的β -胡蘿卜素毫克數(shù)。葉綠素a含量的測(cè)定方法
[0044]步驟5將鹽生杜氏藻培養(yǎng)至第9天時(shí)，藻細(xì)胞密度可達(dá)到150 X 104_300 X 104cell/每暈升，用量筒取藻液200暈升藻液,倒入500暈升的三角燒瓶中；
[0045]步驟6加入20克硫酸亞鐵，加入240毫升85%的丁酮(由丁酮和蒸餾水按85: 15體積比混合而成)，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻25分鐘，充分萃?。?br> [0046]步驟7此時(shí)液體分成明顯的上下兩層，上層清亮，下層渾濁，用移液管取上清液至500毫升的容量瓶中，用85%丁酮定容至500毫升，轉(zhuǎn)入1000毫升燒杯中，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，置于搖床上搖勻15分鐘；
[0047]步驟8用分光光度計(jì)分別測(cè)定波長(zhǎng)624nm和725nm時(shí)的吸光值0D624、0D725，用下式計(jì)算葉綠素a含量
[0048]葉綠素a含量(mg/L) = [ (19.62 X 0D624+4.83 X 0D725) +藻液取樣體積]X最后定容體積最后算出的葉綠素a含量單位是mg/L，即每升藻液中含有的葉綠素a毫克數(shù)。
[0049]最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種鹽生杜氏藻中微量元素含量測(cè)定方法，其特征在于步驟如下: 所述微量元素為β -胡蘿卜素和葉綠素a, 1)β_胡蘿卜素含量的測(cè)定方法 步驟I將鹽生杜氏藻培養(yǎng)至第13天時(shí)，藻細(xì)胞密度可達(dá)到2 50 X 104-400 X 14Cell/每暈升，用移液管移取藻液100暈升,裝入250暈升的三角燒瓶中； 步驟2加入15克NaCl，加入80%乙二醇(由乙二醇和蒸餾水按80: 20體積比混合而成)120毫升，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻20分鐘，充分萃?。? 步驟3此時(shí)液體分成上清液和下池液,用20暈升的移液管移取上清液,加入到250暈升的容量瓶中，用80%乙二醇定容至250毫升； 步驟4轉(zhuǎn)入250毫升圓底燒瓶中，在搖床上搖勻60分鐘，用721型分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)425nm時(shí)的吸光值OD425，用下式計(jì)算β -胡蘿卜素含量 β -胡蘿卜素含量(mg/L)=(最后定容體積X 9.84 X OD425) + (2.91 X藻液取樣體積) 最后算出的β_胡蘿卜素含量單位是(mg/L)，即每升藻液中含有的β-胡蘿卜素毫克數(shù)； 2)葉綠素a含量的測(cè)定方法 步驟5將鹽生杜氏藻培養(yǎng)至第9天時(shí)，藻細(xì)胞密度可達(dá)到150X 104-300X 14Cell/每暈升，用量筒取藻液200暈升藻液,倒入500暈升的三角燒瓶中； 步驟6加入20克硫酸亞鐵，加入240毫升85%的丁酮(由丁酮和蒸餾水按85: 15體積比混合而成)，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻25分鐘，充分萃??； 步驟7此時(shí)液體分成明顯的上下兩層，上層清亮，下層渾濁，用移液管取上清液至500毫升的容量瓶中，用85 %丁酮定容至500毫升，轉(zhuǎn)入1000毫升燒杯中，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，置于搖床上搖勻15分鐘； 步驟8用分光光度計(jì)分別測(cè)定波長(zhǎng)624nm和725nm時(shí)的吸光值0D624、OD725，用下式計(jì)算葉綠素a含量 葉綠素a含量(mg/L) = [ (19.62 X 0D624+4.83 X OD725) +藻液取樣體積]X最后定容體積最后算出的葉綠素a含量單位是mg/L，即每升藻液中含有的葉綠素a毫克數(shù)。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK104406922SQ201410648082
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】王培磊 申請(qǐng)人:臨沂大學(xué)