專利名稱：：杜氏藻耐高溫高光突變株及其誘變選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及杜氏藻(Z)M"a/^〃aenfe/ecta)UTEXLB999的耐高溫高光的突變株，以及所述突變株的誘變選育方法。具體而言，本發(fā)明涉及兩種杜氏藻耐高溫高光突變株，一種是耐受42t:高溫和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-2(CGMCCNo.2982)，另一種是耐受45。C高溫和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-4(CGMCCNo.2983)。
背景技術(shù)：
：杜氏藻CD朋afe〃ae^o/ecto)隸屬于綠藻門(CWorap/^a)、真綠藻綱(C72/ora//y/ceae)、衣藻目(C77/飾yc/omora(ia/as1)、杜氏藻禾斗(Z^簡/z'e〃ace(2e)，具有單細(xì)胞、無細(xì)胞壁、基因組小等特點(diǎn)。杜氏藻天然沒有細(xì)胞壁,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的少數(shù)極端耐鹽的真核生物之一。杜氏藻富含p-胡蘿卜素、維生素C、維生素E，油脂含量高，并且杜氏藻具有罕見的耐受極端高鹽(可在飽和鹽水中生存)、高溫和高光強(qiáng)等極端生長環(huán)境的能力，生長條件相當(dāng)粗放，因此成為人類主要的養(yǎng)殖藻類之一。據(jù)測算，杜氏藻室外全年養(yǎng)殖的平均生產(chǎn)率是平均20g干藻粉'm^d"或0.25g胡蘿卜素'm—、d—1。因此美、澳、以、日等國己興起大規(guī)模養(yǎng)殖杜氏藻提取胡蘿卜素的產(chǎn)業(yè)，同時(shí)還可收獲大量的蛋白質(zhì)和甘油等副產(chǎn)物。杜氏藻的最適生長溫度為253(TC，當(dāng)溫度超過35。C時(shí)，生長完全被抑制，藻細(xì)胞會(huì)逐漸死亡。而我國大部分地區(qū)夏季炎熱高溫，光照強(qiáng)度較高，常規(guī)的杜氏藻種難以耐受夏季高溫和強(qiáng)光照，因此，杜氏藻難以在夏季實(shí)現(xiàn)大規(guī)模養(yǎng)殖。如果能通過誘變獲得耐受高溫及高光的藻株，將擴(kuò)大該藻株的應(yīng)用范圍，對我國杜氏藻的養(yǎng)殖具有重要意義。對于藻類的育種，目前普遍采用誘變育種法。誘變育種是指通過物理(射線照射等)和化學(xué)(誘變劑等)方法使藻類發(fā)生變異，從中選育出具有優(yōu)良性狀的藻種，是微藻育種中使用最多也是最有效的一種方法。誘變育種既能誘發(fā)基因突變，又能促進(jìn)遺傳基因重新組合，在短時(shí)間內(nèi)獲得大量優(yōu)良突變體作為新品種直接利用或作為種質(zhì)資源間接利用，具有選擇育種難以替代的優(yōu)點(diǎn)。常用的物理誘變輻射源有紫外線、倍頻Nd:YAG激光、He-Ne激光、半導(dǎo)體激光、^Co-Y射線、超聲波等。紫外線是一種非電離輻射，可引起DNA鏈的斷裂、DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)、核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，以及胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用等，從而導(dǎo)致基因突變?，F(xiàn)有的研究己經(jīng)通過紫外誘變的方法篩選獲得了很多有應(yīng)用價(jià)值的藻株。然而，目前用于藻類育種的一些現(xiàn)有的誘變育種技術(shù)存在一些缺點(diǎn)現(xiàn)有技術(shù)篩選時(shí)間較短，通常只經(jīng)過一次篩選，得到的突變藻株遺傳穩(wěn)定性相對較差，容易出現(xiàn)回復(fù)突變；而且，現(xiàn)有技術(shù)一般只在室外進(jìn)行高溫高光暴曬，很容易受到天氣因素的影響，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差。
發(fā)明內(nèi)容為了杜氏藻類的大規(guī)模培養(yǎng)，擴(kuò)大其應(yīng)用的目的，本發(fā)明人在尋找高效的、可操作的和重復(fù)性好的誘變育種篩選方法的同時(shí)，篩選得到穩(wěn)定的耐高溫高光的杜氏藻UTEXLB999誘變株系，完成了本發(fā)明。本發(fā)明所用的野生株是UTEXLB999，來源于UTEXTheCultureofAlage(TheUniversityofTexas)。因此，在第一方面中，本發(fā)明的一個(gè)目的在于針對常規(guī)的杜氏藻無法耐受高溫的缺陷以及常規(guī)選育方法的缺陷，提供一種采用紫外線誘變選育杜氏藻的耐受高溫高光突變株的方法。所述方法包括下列步驟(1)將處于對數(shù)生長期的杜氏藻進(jìn)行紫外誘變后，無光暗培養(yǎng)；(2)取步驟(1)的誘變藻株培養(yǎng)液，在室外高溫高光條件下進(jìn)行預(yù)備高溫高光處理，篩選存活的單個(gè)藻株；(3)將步驟(2)的單個(gè)藻株進(jìn)行高溫高光的初步篩選；和(4)將步驟(3)篩選得到的單個(gè)藻株進(jìn)行高溫高光復(fù)篩。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述誘變篩選方法步驟(1)的紫外誘變用2個(gè)20W紫外燈管作為紫外誘變的光源，距離藻液30cm，照射75s。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知常識(shí)適當(dāng)選擇紫外誘變所用的紫外線波長/頻率、紫外光源距離藻液的距離、紫外照射的時(shí)間、紫外線照射量等參數(shù)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述誘變篩選方法步驟(2)所述的在室外高溫高光條件下進(jìn)行預(yù)備高溫高光處理是在夏季每天將所述藻液置于室外，高溫高光照強(qiáng)度暴曬4至8小時(shí)，然后取回藻液置室內(nèi)人工氣候箱(例如，型號(hào)MGC-350HP，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司)中在室溫和正常光照條件下繼續(xù)靜置或搖動(dòng)培養(yǎng)，期間間斷補(bǔ)充適量新鮮培養(yǎng)基，18天篩選結(jié)束。該預(yù)備高溫高光處理是利用炎熱夏季(例如，5月晴天)的高溫和高光照在室外進(jìn)行的，溫度和光照強(qiáng)度波動(dòng)較大，但基本保持為溫度在35-45。C和光照強(qiáng)度在100001ux以上。選擇在室外進(jìn)行預(yù)備高溫高光處理的主要原因是因?yàn)?l)微藻的培養(yǎng)條件本身比較粗放；并且，(2)本發(fā)明的最終目的是獲得能夠在夏季高溫高光照條件下，即在炎熱夏季室外條件下生長的突變藻株。此外，在室外利用夏季自然條件進(jìn)行預(yù)備高溫高光處理也可以節(jié)約篩選成本。在--個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述誘變篩選方法步驟(2)所述的在室外高溫高光條件下進(jìn)行高溫高光處理是在夏季每天將所述藻液置于室外，高溫高光照強(qiáng)度暴曬6小時(shí)，然后取回藻液置室內(nèi)人工氣候箱中在正常培養(yǎng)溫度和正常光照條件下繼續(xù)靜置或搖動(dòng)培養(yǎng)，每6天補(bǔ)充適量新鮮Erdschreiber，sMedium(簡稱EM)培養(yǎng)基，18天篩選結(jié)束，其中所述室外高溫高光條件基本保持在溫度在35-45。C和光照強(qiáng)度在100001ux以上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中步驟(3)的高溫高光初步篩選和步驟(4)的高溫高光復(fù)篩在室內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選在人工氣候箱中進(jìn)行?？梢岳萌斯夂蛳鋰?yán)格控制溫度和光照強(qiáng)度，避免室外篩選的溫度和光照強(qiáng)度不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述誘變篩選方法步驟(3)的高溫高光初步篩選是將步驟(2)得到的單個(gè)藻株每天在人工氣候箱中在38°C和100001ux以上光照強(qiáng)度下培養(yǎng)6小時(shí)，持續(xù)7天。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述誘變篩選方法步驟(4)的高溫高光復(fù)篩是將步驟(3)得到的單個(gè)藻株每天在人工氣候箱中在42。C和IOOOOIUX以上光照強(qiáng)度下培養(yǎng)6小時(shí)，持續(xù)7天。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述誘變篩選方法步驟(4)的高溫高光復(fù)篩是將步驟(3)得到的單個(gè)藻株每天在人工氣候箱中在42t:和10000lux以上光照強(qiáng)度下培養(yǎng)6小時(shí)，持續(xù)2天后，每天在人工氣候箱中在45。C和100001ux以上光照強(qiáng)度下培養(yǎng)6小時(shí)，持續(xù)5天。綜上所述，本發(fā)明所述的高溫高光條件是指溫度在35-45。C和光照強(qiáng)度在lOOOOkDc以上的條件，所述高溫高光條件是與微藻正常光培養(yǎng)所需要的溫度和光照強(qiáng)度相對的，其中微藻正常光培養(yǎng)條件一般為溫度在2530°C，光照強(qiáng)度為400050001ux。所述高溫高光條件可以包括炎熱夏季的粗放的自然高溫高光照條件，或在人工氣候箱中嚴(yán)格控制的高溫高光條件，溫度優(yōu)選為38t:，更優(yōu)選為42。C或45"C。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的用紫外線誘變選育杜氏藻耐高溫高光誘變株的具體步驟如下-(1)紫外誘變?nèi)≡贓M培養(yǎng)基中在25'C,濕度60%，光照4000-50001ux，光周期12hL/12hD的正常生長條件下生長至對數(shù)生長期的杜氏藻UTEXLB999，置超凈工作臺(tái)中以2個(gè)20W紫外燈管作為紫外誘變的光源，距離30cm，照射75s，進(jìn)行誘變后，在25。C無光暗培養(yǎng)3天；(2)將暗培養(yǎng)后的藻液置于人工氣候箱中，在25。C、濕度60%、光照強(qiáng)度4000-50001ux、光周期12hL/12hD的正常生長條件下培養(yǎng)10-13天；(3)預(yù)備高溫高光篩選取經(jīng)過步驟(2)培養(yǎng)的誘變藻株藻液用新鮮EM培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，在夏季高溫和強(qiáng)光照射下在室外進(jìn)行預(yù)備高溫高光處理6小時(shí)，其間每6天補(bǔ)充適量的新鮮EM培養(yǎng)基，18天篩選結(jié)束，其中所述室外高溫高光條件基本保持在溫度在35-45。C和光照強(qiáng)度在100001ux以上；(4)將高溫篩選后存活的藻細(xì)胞涂布在EM固體培養(yǎng)基平板上，在人工氣候箱中，在25°C、濕度60%、光照強(qiáng)度4000-50001ux、光周期12hL/12hD的正常生長條件下培養(yǎng)14天后，挑取生長迅速的黃綠色單藻落，分離保存；(5)耐受高溫高光的藻株的初篩從原始保存板上挑取上述步驟(4)篩選得到的藻落分別接種到EM液體培養(yǎng)基中，在人工氣候箱中培養(yǎng)，正常培養(yǎng)條件下(即，溫度25°C、濕度60%、光照4000-50001ux、光周期12hL/12hD，每天搖動(dòng)三次)培養(yǎng)約3-4天至藻株的生長達(dá)到指數(shù)生長期，然后每天在38。C和100001ux以上光照強(qiáng)度下培養(yǎng)6小時(shí)，其余時(shí)間的培養(yǎng)條件為在25。C、光照4000-50001ux、濕度60%的光照培養(yǎng)和在25°C、濕度60%的暗培養(yǎng)，保持光周期12hL/12hD，持續(xù)7天，通過光密度的測定初步確定生長迅速的耐受高溫高光的藻株；(6)耐受高溫高光的藻株的復(fù)篩(I):將在步驟(5)中初步篩選確定的耐受高溫高光的藻株作為復(fù)篩的樣本。從原始保存板挑取篩選出的單個(gè)藻落，在人工氣候箱中培養(yǎng)，在三角瓶中在25°C、濕度60%、光照強(qiáng)度4000-50001ux、光周期12hL/12hD的正常培養(yǎng)條件下擴(kuò)大培養(yǎng)后，調(diào)整到同樣的起始濃度，正常條件下(即，溫度25°C、濕度60%、光照4000-50001ux、光周期12hL/12hD，每天搖動(dòng)三次)培養(yǎng)約3-4天至藻株達(dá)到指數(shù)生長期，然后，然后在人工氣候箱中，每天在42。C和100001ux以上光照強(qiáng)度下培養(yǎng)6小時(shí)，其余時(shí)間的培養(yǎng)條件為在25。C、光照4000-50001ux、濕度60%的光照培養(yǎng)和在25t:、濕度60%的暗培養(yǎng)，保持光周期12hL/12hD，持續(xù)7天，進(jìn)行42。C高溫高光篩選，通過光密度的測定最終確定生長迅速的耐受42。C高溫高光的藻株；(7)耐受高溫高光的藻株的復(fù)篩(II):將在步驟(5)中初步篩選確定的耐受高溫高光的藻株作為復(fù)篩的樣本。從原始保存板挑取篩選出的單個(gè)藻落，在人工氣候箱中培養(yǎng)，在三角瓶中在25°C、濕度60%、光照強(qiáng)度4000-50001idc、光周期12hL/12hD的正常培養(yǎng)條件下擴(kuò)大培養(yǎng)后，調(diào)整到同樣的起始濃度，正常條件下(即，溫度25°C、濕度60%、光照4000-50001ux、光周期12hL/12hD，每天搖動(dòng)三次)培養(yǎng)至藻株達(dá)到指數(shù)生長期，然后在人工氣候箱中，每天在42。C和100001ux以上光照強(qiáng)度下培養(yǎng)6小時(shí)，其余時(shí)間的培養(yǎng)條件為在25。C、光照4000-50001ux、濕度60%的光照培養(yǎng)和在25。C、濕度60%的暗培養(yǎng)，保持光周期12hL/12hD，持續(xù)2天后，每天在45。C和100001ux以上光照強(qiáng)度下培養(yǎng)6小時(shí)，其余時(shí)間的培養(yǎng)條件仍為在25°C、光照4000-50001ux、濕度60。/。的光照培養(yǎng)和在25°C、濕度60%的暗培養(yǎng)，保持光周期12hL/12hD，持續(xù)5天，進(jìn)行45'C高溫高光篩選，通過光密度的測定最終確定生長迅速的耐受45。C高溫高光的藻株。與常規(guī)的杜氏藻選育方法相比，本發(fā)明的誘變選育杜氏藻耐高溫高光誘變株的方法具有下列優(yōu)點(diǎn)第一，本發(fā)明人先對出發(fā)藻種進(jìn)行紫外誘變，在藻體基因組中引入基因突變，引發(fā)藻株的基因突變，且經(jīng)過至少23輪高溫高光篩選，篩選時(shí)間長，紫外誘變與高溫高光篩選結(jié)合，得到的突變藻株的遺傳性狀和生長特性較穩(wěn)定；第二，高溫高光篩選在室外進(jìn)行預(yù)備篩選后，又在室內(nèi)高溫和高光條件下進(jìn)行初篩和復(fù)篩，可以利用人工氣候箱嚴(yán)格控制高溫和高光條件的穩(wěn)定性，避免了單純在室外篩選天氣變化等因素的不利影響。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的紫外誘變選育方法高效、穩(wěn)定、操作性好、重復(fù)性好。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明所述的用于杜氏藻的紫外誘變選育方法也可以適用于誘變選育其它藻類的耐高溫高光突變株。在第二方面中，本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過利用本發(fā)明第一方面的紫外線誘變篩選方法得到耐受42。C高溫和100001ux以上高光的杜氏藻株ENN0001-2，和耐受45。C高溫和100001ux以上高光的杜氏藻株ENN0001-4。上述耐受高溫高光的杜氏藻株已于2009年3月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國北京朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏登記號(hào)分別為CGMCCNo.2982(ENN0001-2)禾PCGMCCNo.2983(ENN0001-4)。在第三方面中，本發(fā)明人鑒定了耐受42。C高溫和100001ux以上高光的杜氏藻突變株ENN0001-2，以及耐受45。C高溫和100001ux以上高光的杜氏藻突變株ENN0001-4的生長性狀。簡述如下1.形態(tài)特征在25X:，在EM、F/2等自養(yǎng)培養(yǎng)基中均能生長，藻體在液體中分散均勻。藻細(xì)胞呈梨形，長度約6-10iuM,具有2根等長的鞭毛，無細(xì)胞壁，僅有一層糖蛋白和神經(jīng)氨酸組成的外膜包裹，為天然原生質(zhì)體。2.在固體培養(yǎng)基上的生長特征在25。C，在EM固體培養(yǎng)基上生長良好，5-7天即可形成明顯的單藻落。藻落呈規(guī)則的圓形，藻體呈黃綠色。在第四方面中，提供本發(fā)明的杜氏藻耐高溫高光的突變株ENN0001-2和ENN0001-4的應(yīng)用。我國大部分地區(qū)夏季炎熱高溫，光照強(qiáng)度較大，常規(guī)的杜氏藻種難以耐受夏季高溫高光，因此，常規(guī)杜氏藻難以實(shí)現(xiàn)夏季的大規(guī)模養(yǎng)殖。然而，本發(fā)明的突變株ENN0001-2和ENN0001-4可以在炎熱高溫高光照條件下應(yīng)用于小規(guī)模的培養(yǎng)，還可應(yīng)用于大規(guī)模的封閉式(如平板式反應(yīng)器)和開放式(如跑道池)的反應(yīng)器中的杜氏藻的培養(yǎng)，并進(jìn)一步用于提取胡蘿卜素、維生素C、維生素E和油脂等，并且用于生產(chǎn)生物柴油等。從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中圖1顯示兩種杜氏藻突變株分別在42。C和45。C高溫和100001ux以上高光條件下與野生株比較的生長狀況。A.在42。C高溫和100001ux以上高光條件下，耐受42t:高溫和高光的杜氏藻突變株ENN0001-2與野生株的葉綠素含量(OD68。)和生物量(0075。)的變化；B.在45。C高溫和100001ux以上高光條件下，耐受45t:高溫和高光的杜氏藻突變株ENN0001-4與野生株的葉綠素含量(OD68Q)和生物量(OD"o)的變化。橫坐標(biāo)為藻株株系，W(6)為野生株，縱坐標(biāo)為OD值的變化。圖2顯示在45。C高溫和100001ux以上高光培養(yǎng)條件下兩種杜氏藻突變株與野生株的生長狀況。從圖中可見，在45。C高溫和10000lux以上高光的條件下，兩種突變株的生長狀況均比野生株W(6)好，并且ENN0001-2的生長狀況雖然比野生株好，但是比ENN0001-4差，這說明本發(fā)明篩選得到ENN0001-2和ENN0001-4是獨(dú)立的突變株。具體實(shí)施例方式以杜氏藻UTEXLB999的野生株(來源于UTEXTheCultureofAlage，TheUniversityofTexas)為出發(fā)藻株，首先進(jìn)行紫外誘變，隨后于室外高溫高光照強(qiáng)度暴曬，選擇存活的藻落，分離并傳代培養(yǎng)后保存，然后將此次處理后的藻株經(jīng)活化后于人工氣候箱(型號(hào)MGC-350HP，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司)中進(jìn)行至少23輪髙溫高光篩選，選出在高溫和高光條件下生長良好的藻株，分離并傳代培養(yǎng)后保存，即獲得杜氏藻耐受高溫高光的突變藻株。本發(fā)明用于培養(yǎng)杜氏藻UTEXLB999的Erdschreiber，sMedium培養(yǎng)基(簡稱EM)的組成及其含量如表1所示，在配制培養(yǎng)液時(shí)，將其中一些成分以固體形式加入蒸餾水中，一些成分事先配成50-1000倍的母液，使用時(shí)再按需稀釋配置成培養(yǎng)液，詳情參見下表2-5。表1.EM培養(yǎng)基的組成及其含量成分量.儲(chǔ)液濃度使用時(shí)終濃度1人工海水3L2P-IV金屬儲(chǔ)液36mL/3LNaN0310mL/3L0.7M2.3mM4Na2HP04.7H2010mL/3L0.02M6.7mM5.:h壤水GR+培養(yǎng)基150mL/3L6維生素B,，3mlV3L注下劃線表示需要事先配制成母液，所述母液的配制參見下表2-5。表2.人工海水的組成及其含量#成分量(g/L)使用時(shí)終濃度1NaCl49.726850mM2MgCl27.2676mM3MgS043.24827mM4CaCl21.15310mM5NaHC030.1982.4mM6KCI0.72110mM7NaBr0.0580.56mM8H3B030.0589.4mM9■Na2Si030.00240.02mM10H]P040.0020.02mM11A12CI60.0130.0075mM12NH30.0020.12mM13LiN030細(xì)30.019mM14Na2S04428mM表3.P-IV金屬溶液儲(chǔ)液的組成及其含量成分量.'::')::，::'「■....■使用時(shí)終濃度.1Na2EDTA.2H200.75g/L2mM2FeCl3.6H200.097g/L0.36mM3MnCI2.4H200.041g/L0.21mM4ZnCl20.005g/L0.037mM5CoCI2.6H200.002g/L0.0084mM6Na2Mo04'2H200.004g/L0.017mM11表4.土壤水011+培養(yǎng)基的組成及其含量<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中，GreenHouseSoil的處理方法將園藝用土置于鋪好鋁箔的耐熱平板上，厚度不超過0.64cm，150°C烘干2小時(shí)。室內(nèi)放置降溫后，用鋁箔蓋在平板上，放置在黑暗通風(fēng)干燥處，以備隨時(shí)取用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，除非另外指明，本發(fā)明所用的試劑均可從普通的生物試劑公司或化學(xué)試劑公司購買，其配制方法也是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。實(shí)施例1:杜氏藻UTEXLB999藻株的紫外誘變和預(yù)備高溫高光篩選將杜氏藻UTEXLB999藻株的單個(gè)菌落從平板上接種至含有20mlEM培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，置于人工氣候箱(型號(hào)MGC-350HP，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司)中在25°C，光照4000-50001ux、濕度60%、光周期12hL/12hD的條件下培養(yǎng)至指數(shù)生長期。取3mL藻液置于直徑3.5cm的無菌培養(yǎng)皿中，加攪拌子攪拌(攪拌速度約為60-90rpm)，以2個(gè)20W紫外燈管作為紫外誘變的光源，距離30cm，照射75s，關(guān)閉紫外燈，加入17mlEM培養(yǎng)液，蓋上培養(yǎng)皿蓋，用錫紙包好，在25。C無光培養(yǎng)3天。暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮EM液體培養(yǎng)基按1:1的體積比例在250ml三角瓶中混勻，在人工氣候箱中在25。C、光照4000-50001ux、濕度60%、光周期12hL/12hD的正常培養(yǎng)條件下靜置培養(yǎng)10-13天。然后，將由經(jīng)紫外誘變后的藻株經(jīng)過這樣培養(yǎng)10-13天得到的藻液和新鮮EM液體培養(yǎng)基按l:50的體積比例重新接種于250ml三角瓶中，稱為藻液l，另外將由經(jīng)紫外誘變后的藻株經(jīng)過這樣培養(yǎng)10-13天得到的藻液和新鮮EM液體培養(yǎng)基按l:3的體積比例重新接種于500ml三角瓶中，稱為藻液2，將藻液1和藻液2分別同時(shí)獨(dú)立地在室外進(jìn)行預(yù)備高溫高光篩選選擇5月晴天，每天從10時(shí)至16時(shí)將上述藻液置于室外花崗巖石板上，高溫高光照強(qiáng)度暴曬進(jìn)行篩選，其中所述室外高溫高光條件基本保持在溫度在35-45。C和光照強(qiáng)度在100001ux以上；每天16時(shí)后取回藻液置室內(nèi)人工氣候箱中在25。C和正常光照4000-50001ux條件下繼續(xù)靜置或搖動(dòng)培養(yǎng)。每6天補(bǔ)充50ml新鮮EM培養(yǎng)基，18天篩選結(jié)束，取少量液體鋪平板培養(yǎng)14天并挑取較大的單藻落保存，得到150株突變株，概率約為40%。實(shí)施例2:杜氏藻耐受高溫髙光的突變藻株的初步篩選將上述實(shí)施例1中經(jīng)分離后平板保存的150株單個(gè)藻株分別活化，以相同濃度接種于4ml液體EM培養(yǎng)基中，在人工氣候箱中在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中在25。C，濕度60%，光照4000-5000lux、光周期12hL/12hD的正常條件下培養(yǎng)5天后，每天從10時(shí)至16時(shí)將人工氣候箱溫度升至38°C，光照強(qiáng)度調(diào)整為100001ux以上，曝露于高溫高光下進(jìn)行篩選；每天16時(shí)后溫度降至25。C，光照強(qiáng)度重新調(diào)整為4000-50001ux，20時(shí)后進(jìn)入無光照培養(yǎng)階段，第二日8日寸-10時(shí)又進(jìn)入正常光照培養(yǎng)(即，25°C、光照4000-50001ux、濕度60%)，整個(gè)過程中保持光周期12hL/12hD。如此循環(huán)進(jìn)行高溫高光篩選，持續(xù)7天，通過光密度的測定初步確定生長迅速的耐受高溫高光的藻株，分離培養(yǎng)并保存，初步得到12株耐受高溫高光的藻株，概率約為8%。實(shí)施例3:杜氏藻耐受42'C高溫高光的突變藻株的篩選將實(shí)施例2中經(jīng)室內(nèi)高溫和高光初步篩選后得到的12株藻株分別活化，以相同起始濃度接種于20mlEM液體培養(yǎng)基，置于100ml三角瓶中，每個(gè)樣品做三個(gè)平行樣。藻液在人工氣候箱中在溫度25°C、光照4000-50001ux、濕度60%，光周期12hL/12hD的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天后，每天從10時(shí)至16時(shí)將人工氣候箱溫度升至42°C，光照強(qiáng)度調(diào)整為100001ux以上，曝露于高溫高光下進(jìn)行篩選；每天16時(shí)后溫度降至25。C，光照強(qiáng)度重新調(diào)整為4000-50001ux，20時(shí)后進(jìn)入無光照培養(yǎng)階段，第二日8時(shí)-10時(shí)又進(jìn)入正常光照培養(yǎng)(即，25°C、光照4000-50001ux、濕度60%)，整個(gè)過程中保持光周期12hL/12hD。如此循環(huán)進(jìn)行42°(:高溫高光篩選，持續(xù)7天，通過光密度的測定確定生長迅速的耐受42TT高溫高光的藻株，分離培養(yǎng)并保存，得到1株耐受42'C高溫和高光的杜氏藻突變株，命名為ENN0001-2(CGMCCNo.2982，于2009年3月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，中國北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，100101)。實(shí)施例4:杜氏藻耐受45。C高溫高光的突變藻株的篩選將實(shí)施例2中經(jīng)室內(nèi)高溫和高光初步篩選后得到的12株藻株活化，以相同起始濃度接種于20mlEM液體培養(yǎng)基，置于100ml三角瓶中，每個(gè)樣品做三個(gè)平行樣。藻液在人工氣候箱中在溫度25°C、光照4000-50001ux、濕度60%，光周期12hL/12hD的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天后，每天從10時(shí)至16時(shí)將人工氣候箱溫度升至42°C，光照強(qiáng)度調(diào)整為100001ux以上，曝露于高溫高光下進(jìn)行篩選；每天16時(shí)后溫度降至25。C，光照強(qiáng)度重新調(diào)整為4000-50001ux，20時(shí)后進(jìn)入無光照培養(yǎng)階段，第二曰8時(shí)-10時(shí)又進(jìn)入正常光照培養(yǎng)(即，25°C，光照強(qiáng)度4000-50001ux,濕度60%)，整個(gè)過程中保持光周期12hL/12hD。如此循環(huán)進(jìn)行42。C篩選，持續(xù)2天后，把每天10時(shí)至16時(shí)的光培養(yǎng)箱溫度升至45°C，光照仍調(diào)整為100001ux以上，其余條件不變，如此循環(huán)進(jìn)行45。C高溫高光篩選，持續(xù)5天，通過光密度的測定確定生長迅速的耐受45。C高溫高光的藻株，分離培養(yǎng)并保存，得到1株耐受45T:高溫和高光的杜氏藻突變株，命名為ENN0001-4(CGMCCNo.2983，于2009年3月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，中國北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，100101)。實(shí)施例5:杜氏藻耐受高溫高光的突變株的生長性狀鑒定杜氏藻耐受42"C和45t:高溫高光的突變藻株的生長性狀鑒定如下1.形態(tài)特征14在25。C，兩種突變藻株在EM、F/2等自養(yǎng)培養(yǎng)基中均能生長，藻體在液體中分散均勻。藻細(xì)胞呈梨形，長度約6-10pM，具有2根等長的鞭毛，無細(xì)胞壁，僅有一層糖蛋白和神經(jīng)氨酸組成的外膜包裹，為天然原生質(zhì)體。2.在固體培養(yǎng)基上的生長特征在25。C，兩種突變藻株在EM固體培養(yǎng)基上生長良好，5-7天即可形成明顯的單藻落。藻落呈規(guī)則的圓形，藻體呈黃綠色。實(shí)施例6:杜氏藻耐受高溫高光的突變株與野生株的比較鑒定1.在42。C高溫和100001ux以上高光培養(yǎng)條件下，耐受42。C高溫和高光的杜氏藻突變株ENN0001-2比野生株生長狀況好。杜氏藻突變株ENN0001-2藻落和藻體培養(yǎng)液均呈黃綠色，而野生株則呈綠色。將杜氏藻突變株ENN0001-2和野生株W(6)同時(shí)按照實(shí)施例3的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)挑取單個(gè)藻落經(jīng)活化后，以相同起始濃度接種于20mlEM培養(yǎng)基中，先在25°C、光強(qiáng)4000-50001ux、濕度60%、光周期12hL/12hD條件下培養(yǎng)3-4天，然后每天在42。C高溫和100001ux以上光照處理6小時(shí)，其余時(shí)間在25。C、光強(qiáng)4000-50001ux、濕度60。/。光照培養(yǎng)和在25。C、濕度60。/。暗培養(yǎng)，保持光周期12hL/12hD，處理7天。測定葉綠素含量OD68。和生物量OD徹。參考圖1A，在42。C高溫和高光培養(yǎng)條件下，突變株E,0001-2的生長狀況比野生株W(6)好，ENN0001-2的葉綠素含量達(dá)到野生株的109.08%，生物量達(dá)到野生株的107.71%。2.在45。C高溫和100001ux以上高光培養(yǎng)條件下，耐受45。C高溫和高光的杜氏藻突變株ENN0001-4比野生株生長狀況好。杜氏藻突變株ENN0001-4藻落和藻體培養(yǎng)液均呈黃綠色，而野生株則呈綠色。將杜氏藻突變株ENN0001-2和野生株W(6)同時(shí)按照實(shí)施例4的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)挑取單個(gè)藻落經(jīng)活化后，以相同起始濃度接種于20mlEM培養(yǎng)基中，先在25°C、光強(qiáng)4000-50001ux、濕度60%、光周期12hL/12hD條件下培養(yǎng)3-4天，然后每天在42。C高溫和100001ux以上光照處理6小時(shí)，處理2天，隨后每天在45r高溫和100001ux以上光照處理615小時(shí)，處理5天。測定葉綠素含量OD,和生物量OD750。參考圖1B，在45t:高溫和高光培養(yǎng)條件下，突變株ENN0001-4的生長狀況比野生株W(6)好，ENN0001-4的葉綠素含量達(dá)到野生株的149.43%，生物量達(dá)到野生株的135.55%。3.耐受42r高溫和高光的杜氏藻突變株ENN0001-2與耐受45。C高溫和高光的杜氏藻突變株ENN0001-4及野生株W(6)在45。C高溫和100001ux以上高光培養(yǎng)條件下的生長差異。將突變株ENN0001-2和ENN0001-4與野生株W(6)同時(shí)按實(shí)施例4的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)挑取單個(gè)藻落經(jīng)活化后，以相同起始濃度接種于20mlEM培養(yǎng)基中，先在25。C、光強(qiáng)4000-50001ux、濕度60%、光周期12hL/12hD條件下培養(yǎng)3-4天，然后每天在42。C高溫和100001ux以上光照處理6小時(shí)，處理2天，隨后每天在45。C高溫和100001ux以上光照處理6小時(shí)，處理5天。測定葉綠素含量OD68。和生物量OD75Q。參考圖2，ENN0001-2的葉綠素含量達(dá)到野生株的126.57%，生物量達(dá)到野生株的113.75%，而ENN0001-4的葉綠素含量達(dá)到野生株的145.85%，生物量達(dá)到野生株的136.14%。在45。C高溫和100001ux以上高光的條件下，兩種突變株的生長狀況均比野生株W(6)好，并且ENN0001-2的生長狀況雖然比野生株好，但是比ENN0001-4差，二者存在差異，這可以說明本發(fā)明篩選得到ENN0001-2和ENN0001-4是獨(dú)立的突變株。應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，己經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，而不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍。1權(quán)利要求1.杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)UTEXLB999的耐高溫高光突變株ENN0001-2CGMCCNo.2982，其特征在于，在42℃高溫和10000lux以上的強(qiáng)光照下正常生長。2.杜氏藻UTEXLB999的耐高溫高光突變株ENN0001-4CGMCCNo.2983，其特征在于，在45。C高溫和lOOOOlux以上的強(qiáng)光照下正常生長。3.—種誘變選育耐受高溫高光的杜氏藻突變株的方法，所述方法包括下列步驟(1)將處于對數(shù)生長期的杜氏藻進(jìn)行紫外誘變后，無光暗培養(yǎng)；(2)取步驟(1)的誘變藻株培養(yǎng)液，在室外高溫高光條件下進(jìn)行預(yù)備高溫高光處理，篩選存活的單個(gè)藻株；(3)將步驟(2)篩選得到的單個(gè)藻株進(jìn)行高溫高光的初步篩選；和(4)將步驟(3)篩選得到的單個(gè)藻株進(jìn)行高溫高光復(fù)篩。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘變選育方法，其中步驟(3)的高溫高光初步篩選和步驟(4)的高溫高光復(fù)篩在室內(nèi)人工氣候箱中進(jìn)行。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘變選育方法，其中步驟(2)所述的在室外高溫高光條件下進(jìn)行的預(yù)備高溫高光處理是在夏季每天將所述藻液置于室外，高溫高光照強(qiáng)度暴曬4至8小時(shí)，然后取回藻液置室內(nèi)人工氣候箱中在室溫和正常光照條件下繼續(xù)靜置或搖動(dòng)培養(yǎng)，期間間斷補(bǔ)充適量新鮮培養(yǎng)基，18天篩選結(jié)束，其中所述室外高溫高光條件基本保持在溫度在35-45。C和光照強(qiáng)度在100001ux以上。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的誘變選育方法，其中步驟(2)所述的在室外高溫高光條件下進(jìn)行的預(yù)備高溫高光處理是在夏季每天將所述藻液置于室外，高溫高光照強(qiáng)度暴曬6小時(shí)，然后取回藻液置室內(nèi)人工氣候箱中在正常培養(yǎng)溫度和正常光照條件下繼續(xù)靜置或搖動(dòng)培養(yǎng)，期間每6天補(bǔ)充適量新鮮培養(yǎng)基，18天篩選結(jié)束，其中所述室外高溫高光條件基本保持在溫度在35-45。C和光照強(qiáng)度在100001ux以上。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘變選育方法，其中步驟(3)的高溫高光初步篩選是將步驟(2)得到的單個(gè)藻株每天在人工氣候箱中在38。C和lOOOOlux以上光照強(qiáng)度下培養(yǎng)6小時(shí)，持續(xù)7天。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘變選育方法，其中步驟(4)的高溫高光復(fù)篩是將步驟(3)得到的單個(gè)藻株每天在人工氣候箱中在42"C和100001ux以上光照強(qiáng)度下培養(yǎng)6小時(shí)，持續(xù)7天。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘變選育方法，其中步驟(4)的高溫高光復(fù)篩是將步驟(3)得到的單個(gè)藻株每天在人工氣候箱中在42。C和100001ux以上光照強(qiáng)度下培養(yǎng)6小時(shí)，持續(xù)2天后，每天在人工氣候箱中在45。C和100001ux以上光照強(qiáng)度下培養(yǎng)6小時(shí)，持續(xù)5天。10.權(quán)利要求1或2所述的杜氏藻UTEXLB999耐高溫高光突變株的應(yīng)用，其用于在炎熱高溫高光照條件下的杜氏藻小規(guī)模和大規(guī)模培養(yǎng)，其產(chǎn)物進(jìn)一步用于提取胡蘿卜素、維生素C、維生素E和油脂等，并用于生產(chǎn)生物柴油等，其中所述高溫高光照條件為溫度在35-45。C和光照強(qiáng)度在100001ux以上。全文摘要本發(fā)明提供杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)UTEXLB999的耐高溫高光的突變株，以及所述突變株的誘變選育方法。具體而言，本發(fā)明提供兩種杜氏藻耐高溫高光突變株，一種是耐受42℃高溫和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-2CGMCCNo.2982，另一種是耐受45℃高溫和10000lux以上高光的杜氏藻株ENN0001-4CGMCCNo.2983。文檔編號(hào)C12P23/00GK101586080SQ20091013547公開日2009年11月25日申請日期2009年4月28日優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日發(fā)明者洪吳,尹順吉,王媛媛,蔡忠貞,袁普衛(wèi),平鄧申請人:新奧科技發(fā)展有限公司