膜透析-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中7種喹諾酮殘留的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于化學分析領(lǐng)域，涉及膜透析-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中7種喹諾酮殘留的方法。本發(fā)明應用膜透析技術(shù)建立了一種同時測定動物源食品中7種喹諾酮殘留量的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測方法。選用標準再生纖維素膜（RC，截留分子量MWCO：1000D）作為透析膜，藥物殘留通過透析滲入透析液中,用氯仿對透析液中的進行萃取。該方法所有喹諾酮類藥物在5.0～100.0μg/kg濃度范圍內(nèi)線性良好，定量限均為5.0μg/kg。5.0、10.0、25.0μg/kg3個濃度添加水平平均回收率在65.5%～84.1%之間,變異系數(shù)在4.3%～11.6%之間。本方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，經(jīng)濟，可用于動物源食品中7喹諾酮類殘留的檢測確證。
【專利說明】膜透析-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中7種 喹諾酮殘留的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學領(lǐng)域，涉及動物源食品中喹諾酮類的檢測方法，具體涉及利 用膜透析-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中7種喹諾酮殘留的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 喹諾酮類（Quinolones, QNs)藥物是一類抗菌作用強，抗菌譜廣的人工合成抗菌 藥。近年來，喹諾酮類藥物作為抗菌藥被廣泛應用于動物養(yǎng)殖業(yè)中，美國FDA規(guī)定了家禽肉 中的部分QNs的限量。日本批準使用的QNs僅有恩諾沙星、二氟沙星、奧比沙星、達氟沙星、 馬波沙星、氧氟沙星和惡喹酸。歐盟在1999年3月公布的NO. 508 /1999號法規(guī)中對牛奶 中單諾沙星，氟甲喹，馬波沙星，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的最高殘留限量作了規(guī)定。世界 食品法典委員會和世界各國對水產(chǎn)品中QNs殘留均有嚴格的限量要求，國際貿(mào)易中也對 其限量有嚴格規(guī)定。因此，對動物源食品中QNs殘留量的檢測尤為重要。
[0003] 透析（dialysis)是通過小分子經(jīng)過半透膜擴散到水(或緩沖液）的原理，將小分子 與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)。目前透析在醫(yī)學上和廢水處理方面應用較多，也 有應用透析技術(shù)與分析儀器結(jié)合檢測藥物殘留的一些報道，例如Gonzalez等建立了雙向 滲析膜技術(shù)與氣質(zhì)聯(lián)用儀結(jié)合技術(shù)檢測奶牛肝中鹽酸克倫特羅含量，回收率達到99. 3%，檢 測限為 250 ppt(P. Gonza'lez, C.A. Fente, C. Franco, B. Va'zquez, E. Quinto, A. Cepeda, Journal of Chromatography B, 693 (1997) 321 - 326XFente等建立了雙向滲 析膜技術(shù)與氣質(zhì)聯(lián)用儀結(jié)合技術(shù)檢測肉牛毛中鹽酸克倫特羅含量，檢出限達5 ng/g，日內(nèi) 和日間相對標準偏差（RSD)為 7.1%和9.5%((：.1?61^6，8.1.￥3、91?^，（：.卩四11(3〇，八· Cepeda, P. G. GigososjJournal of Chromatography B, 726 (1999) 133 - 139)〇Angeles 等運用雙向滲析膜技術(shù)與氣相色譜結(jié)合測定了牛奶和奶粉中特丁津、西瑪津、阿特拉津含 量，檢測限分別達到〇· 01 mg/L、0. 07 mg/L和0· 04 mg/L，回收率為89%、75%和116% (M. angeles Garcia , M. Santaeufemia, M. Julia Melgar,Food and Chemical Toxicology 50 (2012) 503 - 510)。但尚無利用透析技術(shù)與分析儀器結(jié)合檢測喹諾酮類藥物殘留的報 道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是提供一種檢測7種喹諾酮的檢測方法，本發(fā)明中7種喹諾酮為恩諾沙 星（ENR)、環(huán)丙沙星（CIP)、惡喹酸（0X0)、沙拉沙星（SAR)、雙氟沙星（DIF)、、氟甲喹（FLU)、 萘啶酸（NDL)。該方法樣品處理簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，幾乎沒有基質(zhì)效應，能滿足喹諾 酮類藥物的殘留檢測任務。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是： 膜透析-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中7種喹諾酮殘留的方法，其包括 步驟：將待測組織樣品經(jīng)過樣品預處理后，提取上清液裝入透析袋中，將透析袋放入透析液 中透析，收集透析液用三氯甲烷萃取藥物樣品，萃取液濃縮后用于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 法測定藥物含量；其中， 所述透析袋采用標準再生纖維素膜RC，截留分子量MWCO為IOOOD ;所述透析液為蒸餾 水； 所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，是采用外標法測定7種喹諾酮的含量，其液相色譜 柱采用通用性，填料選自十八烷基鍵合相硅膠，流動相：〇. 1%甲酸溶液A-乙腈B，流 速：0· 2 mL /min，梯度洗脫：t= 0 min, 80%A, 20% B ; t= I min, 80%A, 20%B ; t=6min， 40%A, 60% B ；t=10 min, 20%A, 80% B ；t=14 min, 20%A, 80% B； t=14. I min,80%A, 20% B ; t=20min，80%A，20% B ;質(zhì)譜條件為：電噴霧電離源正離子掃描（ESI+)，多反應監(jiān)測模式 (MRM);電噴霧電壓：5.0 kV;離子源溫度：500 °C，霧化氣壓力（GSl): 70 psi ;輔助氣流 速（GS2) : 55 psi，氣簾氣壓力（CUR) : 20psi ;碰撞室入口電壓（EP) : 10 V ;碰撞室出口電 壓（CXP): 10 V，監(jiān)測分析物的離子對進行藥物殘留確證分析。
[0006] 本發(fā)明中，所述樣品預處理是準確稱取5. 00 g粉碎好的樣品，加入20ml蒸餾水， 混勻，超聲20分鐘，8000轉(zhuǎn)離心5分鐘。
[0007] 本發(fā)明，透析時間彡6小時。
[0008] 本發(fā)明，本發(fā)明7種喹諾酮線性范圍5. 0?100. 0 μ g/kg。
[0009] 本發(fā)明，本發(fā)明7種喹諾酮的定量限為5. 0 μ g/kg，進樣兩20 μ L。
[0010] 本發(fā)明應用膜透析技術(shù)建立了一種同時測定動物源食品中7種喹諾酮殘留量的 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS)檢測方法。選用標準再生纖維素膜（RC，截留分子量 MWCO :1000D)作為透析膜，藥物殘留通過透析滲入透析液中，用氯仿對透析液中的進行萃 取。該方法所有喹諾酮類藥物在5.0?100.0 μ g/kg濃度范圍內(nèi)線性良好，定量限均為 5. 0 μ g/kg。5· 0、10· 0、25· 0 μ g/kg 3個濃度添加水平平均回收率在65. 5%?84. 1%之 間，變異系數(shù)在4. 3%?11. 6%之間。本方法樣品處理簡單、靈敏度高，重現(xiàn)性好，經(jīng)濟，可 用于動物源食品中7喹諾酮類殘留的檢測確證。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1-圖7為多反應監(jiān)測的特征離子色譜圖（空白牛肉基質(zhì)加標5. 0 μ g/kg)。

【具體實施方式】
[0012] 為了具體說明本發(fā)明，結(jié)合以下實施例具體說明，但本發(fā)明并局限于此。
[0013] 1.透析袋的制備 把透析膜剪成適當長度（IOcm左右）的小段，蒸餾水徹底清洗透析膜，不使用的透析膜 放回儲存液中，密封保存，接觸透析膜過程中必須戴手套。使用時，一端用下沉透析袋夾子 夾緊，灌滿水后，用手指適當加壓，檢查不漏，方可裝入樣品。通常要留三分之一至一半的空 間，以防透析過程中，袋外的水和緩沖液過量進入袋內(nèi)將袋漲破。裝完樣品后，用上浮夾子 夾緊袋口，可在袋內(nèi)放一玻璃珠，以使透析袋處于懸浮狀態(tài)，即可進行透析。
[0014] 2.樣品的前處理 準確稱取5. 00 g粉碎好的樣品，加入20ml蒸餾水，混勻，超聲20分鐘，8000轉(zhuǎn)離心5 分鐘，上清液移入透析袋中，將透析袋浸入盛有400-450 ml蒸餾水的棕色燒杯中，放入轉(zhuǎn) 子，將燒杯置于磁力攪拌器上進行透析，攪拌轉(zhuǎn)速以杯內(nèi)形成渦旋帶動透析袋轉(zhuǎn)動，透析袋 不下沉為準，杯外罩上不透明袋子，時間為6 h。透析完成后取出透析袋，將燒杯中的透析液 移入IL的梨形分流漏斗中，加入40ml三氯甲烷萃取2次，合并萃取液進行旋蒸，用流動相 定容成1.0 mL，供HPLC-MS/MS測定分析。
[0015] 3.液相色譜條件 本實施例米用的色譜柱為 Waters Xbridge C18, 3. 5 μ m 2. I X 150mm，Agilent Zorbax SB-C18、XDB-C18等十八烷基鍵合相硅膠也可以滿足分離要求。
[0016] 柱溫35 °C ;進樣體積20μ L。
[0017] 流動相：Α:0. 1%甲酸溶液；Β:乙腈；流速：0. 2 mL /min ;進樣量：20μ L，梯度洗脫 見表1 : 表1梯度洗脫程序

【權(quán)利要求】
1. 膜透析-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中7種喹諾酮殘留的方法，其特 征在于，其包括步驟：將待測組織樣品經(jīng)過樣品預處理后，提取上清液裝入透析袋中，將透 析袋放入透析液中透析，收集透析液用三氯甲烷萃取藥物樣品，萃取液濃縮后用于高效液 相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定藥物含量；其中， 所述7種喹諾酮是恩諾沙星、環(huán)丙沙星、惡喹酸、沙拉沙星、雙氟沙星、氟甲喹、萘啶酸； 所述透析袋采用標準再生纖維素膜RC，截留分子量MWCO為IOOOD ;所述透析液為蒸餾 水； 所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，是采用外標法測定7種喹諾酮的含量，其液相色譜 柱采用通用性，填料選自十八烷基鍵合相硅膠，流動相：〇. 1%甲酸溶液A-乙腈B，流 速：0? 2 mL /min，梯度洗脫：t= 0 min, 80%A, 20% B ; t= I min, 80%A, 20%B ; t=6min， 40%A, 60% B ；t=10 min, 20%A, 80% B ；t=14 min, 20%A, 80% B ； t=14. I min,80%A, 20% B ； t=20min，80%A，20% B ;質(zhì)譜條件為：電噴霧電離源正離子掃描ESI+，多反應監(jiān)測模式MRM ; 電噴霧電壓：5.0 kV;離子源溫度：500 °C，霧化氣壓力GS1: 70 psi;輔助氣流速GS2: 55口8丨，氣簾氣壓力邙1?:2(^81;碰撞室入口電壓￡? :10￥;碰撞室出口電壓0乂？：10￥， 監(jiān)測分析物的離子對進行藥物殘留確證分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述樣品預處理是準確稱取5. 00 g粉碎 好的樣品，加入20ml蒸餾水，混勻，超聲20分鐘，8000轉(zhuǎn)離心5分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：透析時間> 6小時。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：7種喹諾酮線性范圍5. 0?100. 0 ii g/kg。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：7種喹諾酮的定量限為5. 0 y g/kg，進樣 量 20 u L。
【文檔編號】G01N30/02GK104316615SQ201410600800
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月1日
【發(fā)明者】楊麗君, 徐成鋼, 梁君妮, 王美玲, 宋曉華, 安代志 申請人:威海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 湖南省檢驗檢疫科學技術(shù)研究院