一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾基因的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾基因的方法，以氫氟酸浸泡除雜后的單晶硅片，在其表面形成硅-氫鍵，加入硝酸銀制得硅表面增強(qiáng)拉曼散射基底；將發(fā)夾DNA末端巰基與銀納米粒子共價(jià)形成Ag-S鍵，使發(fā)夾DNA共價(jià)連接到銀納米粒子修飾的硅片上，老化后，加入待檢測(cè)耳聾致病基因序列充分雜交進(jìn)行SERS檢測(cè)；本發(fā)明采用發(fā)夾DNA輔助的SERS硅基底進(jìn)行實(shí)體中耳聾致病基因的檢測(cè)，有效提局了拉曼檢測(cè)靈敏度，降低檢測(cè)線，具有高特異性，重現(xiàn)性好。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，成本低，易于普及和傳播。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾基因的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物體外診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種耳聾基因的檢測(cè)方法，具體涉及一 種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾基因的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是一種最常見(jiàn)的人類(lèi)感覺(jué)系統(tǒng)缺陷，因其病因復(fù)雜、發(fā)生率高和治療困難 等原因而長(zhǎng)久地困擾著廣大患者及其周?chē)巳?，極大地影響著人們的相互交流和生活質(zhì) 量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，重度耳聾在新生兒中發(fā)生率高達(dá)l/80(Tl/1000 (參見(jiàn)：N. Engl. J. Med. 2006，354，2151-2164)，全世界幾乎七千萬(wàn)人罹患55分貝以上的聽(tīng)力減退，70歲以上的 人群中超過(guò)60%具有至少25分貝的聽(tīng)力減退(參見(jiàn)：Curr. Opin. Pediatr. 2012，24， 679-686)。
[0003] 醫(yī)學(xué)界和科研界一直努力探求新的治療手段，正如恩格斯所說(shuō)："社會(huì)一旦有技 術(shù)上的需要，這種需要就會(huì)比10所大學(xué)更能把科學(xué)推向前進(jìn)。"耳聾基因治療的研究始于 1996年，近十幾年來(lái)得益于現(xiàn)代分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的進(jìn)步，耳聾基因治療取得了較 為飛速的發(fā)展。傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、DNA測(cè)序、寡核苷酸探針雜交法等， 需要指出的是這些檢測(cè)方式操作過(guò)程繁雜冗長(zhǎng)、檢測(cè)靈敏度較低、儀器設(shè)備昂貴，這對(duì)于耳 聾突變基因的早期診斷和治療是極為不利的（參見(jiàn) ：J. Hum. Genet. 1999，44，388-390; J. Hum. Genet. 2005，117，9-15; Biosci. Rep. 2008，28，49-59)。
[0004] 表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface-Enhanced Raman Scattering，全文簡(jiǎn)稱(chēng)：SERS)是在 拉曼散射的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的無(wú)損分析表征技術(shù)。由于其具有譜帶窄、分辨率高、水干擾 小、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)分析、表面催化、食品安全檢測(cè)、材料科學(xué)和生物醫(yī) 學(xué)診斷等領(lǐng)域。但是，表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)能否發(fā)展成為一種具有實(shí)際應(yīng)用意義的分析 技術(shù)，很大程度上取決于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，其中關(guān)鍵之處就是制 備出靈敏度高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高、易制備的表面增強(qiáng)拉曼光譜活性基底并能夠在實(shí)體檢 測(cè)中得到廣泛應(yīng)用（參見(jiàn)：Small 2013，9，2493-2499; Nano Today 2011，6，122-130)。
[0005] 目前，現(xiàn)有技術(shù)中，尚無(wú)關(guān)于采用表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)實(shí)際體系中耳聾突變基因 進(jìn)行高靈敏特異檢測(cè)的詳細(xì)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于開(kāi)創(chuàng)性的提供一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾 基因的方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以氫氟酸（HF)浸泡除雜后的單晶硅片，在其表面形成 硅-氫（Si-H)鍵，加入硝酸銀（AgN0 3)制得硅表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)基底；將發(fā)夾DNA 末端巰基（SH基）與銀納米粒子（silver nanoparticles，全文簡(jiǎn)稱(chēng)AgNPs)，使發(fā)夾DNA共 價(jià)連接到 AgNPs 修飾的 Si 材料（AgNPs-decorated silicon wafers，全文簡(jiǎn)稱(chēng) AgNPsOSi) 上，老化后，加入待檢測(cè)耳聾致病基因序列充分雜交進(jìn)行SERS檢測(cè)。
[0008] 具體的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案： 本發(fā)明的基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾基因的方法，包括下述步驟： (1)硅片的預(yù)處理 將單晶硅片置于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離子水超聲清洗，用濃硫酸（H2S04) 和過(guò)氧化氫（H202)混合溶液清洗，用氫氟酸溶液浸泡硅片，將硅片平鋪于反應(yīng)器中，光面朝 上，向其中迅速加入不同pH值的硝酸銀溶液進(jìn)行反應(yīng)，得到表面修飾銀納米顆粒的硅片 SERS基底； 上述技術(shù)方案中，將單晶硅片置于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離子水以60Hz 頻率超聲清洗15分鐘。
[0009] 上述技術(shù)方案中，以體積比=3:1的濃硫酸和30%過(guò)氧化氫混合溶液清洗硅片30 分鐘。
[0010] 優(yōu)選的，所述氫氟酸溶液的濃度為1~30% ; 進(jìn)一步的，所述氫氟酸溶液浸泡硅片的時(shí)間為5~45分鐘。
[0011] 優(yōu)選的，所述硝酸銀溶液濃度為l~5mM，反應(yīng)時(shí)間為5~25分鐘。
[0012] 優(yōu)選的，用1?30%的氫氟酸溶液或0. 001?5M的NaOH溶液調(diào)節(jié)硝酸銀溶液的pH值。
[0013] 優(yōu)選的，用氮?dú)獯蹈杀砻?，得到硅基SERS基底。
[0014] (2)組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA 將步驟（1)制備的硅基SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液（PBS)的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩 儀上混合孵育，向溶液中分次加入氯化鈉/磷酸鹽溶液，過(guò)夜老化； 優(yōu)選的，所述發(fā)夾DNA的最初濃度為l?5uM，反應(yīng)條件為30(T380rpm，反應(yīng)溫度為 23~28°C，反應(yīng)時(shí)間至少12小時(shí)。
[0015] 優(yōu)選的，所述氯化鈉/磷酸鹽溶液最初濃度為廣3M，分次加入使組裝溶液最終濃 度達(dá)到0. 01?1M。
[0016] (3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底，用PBS溶液洗滌多次，加入系列濃度的待檢測(cè)耳聾致 病基因序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行充分雜交后，用PBS或者無(wú)菌去離子水沖洗表面，空氣中 自然晾干，進(jìn)行SERS檢測(cè)。
[0017] 優(yōu)選的，所述的待檢測(cè)耳聾致病基因序列溶解于雜交緩沖液中，反應(yīng)條件為 30(T380rpm，雜交溫度為30?38°C，雜交時(shí)間2?4小時(shí)。
[0018] 本發(fā)明中，調(diào)節(jié)和優(yōu)化硝酸銀溶液的pH值可使硅片表面原位生長(zhǎng)出的銀納米粒 子尺寸均勻、重現(xiàn)性好且具有很強(qiáng)的SERS效應(yīng)，克服了傳統(tǒng)方法中重現(xiàn)性差的問(wèn)題，同時(shí) 避免了銀納米粒子在普通制作工藝中的團(tuán)聚效應(yīng)。本發(fā)明無(wú)需在硅片表面制作硅納米線， 工藝步驟簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)及實(shí)體檢測(cè)?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)的前提下，本發(fā)明采用發(fā) 夾DNA輔助的SERS硅基底進(jìn)行實(shí)體中耳聾致病基因的檢測(cè)，有效提高了拉曼檢測(cè)靈敏度， 降低檢測(cè)線（ΙρΜ)，具有高特異性，重現(xiàn)性好。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，成本低，易于普及和傳 播。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的有關(guān)本發(fā)明的附圖僅僅是本發(fā)明的一 些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些 附圖獲得其他的附圖。
[0020] 圖1是基于表面增強(qiáng)拉曼散射光譜對(duì)耳聾致病基因高效檢測(cè)的技術(shù)示意圖； 圖2是硅基SERS基底（AgNPsOSi)的掃描電鏡和原子力顯微鏡表征照片； 圖3是硅基SERS基底（AgNPsOSi)對(duì)實(shí)體中耳聾致病基因的靈敏檢測(cè)SERS光譜圖； 圖4是硅基SERS基底（AgNPsOSi)對(duì)實(shí)體中耳聾致病基因的特異檢測(cè)SERS光譜圖； 圖5是硅基SERS基底（AgNPsOSi)對(duì)實(shí)體中耳聾致病基因的重現(xiàn)性檢測(cè)SERS光譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描 述。
[0022] 本發(fā)明所用的原料可由市場(chǎng)自由購(gòu)得，均為分析純； 實(shí)施例1 (1)硅片的預(yù)處理工藝 取lcm2大小單硅晶片3~6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離 子水超聲15分鐘，得到表面無(wú)雜質(zhì)無(wú)有機(jī)物的硅片備用。取40mL 98wt%硫酸和30wt%的 過(guò)氧化氫體積比3 :1的混合溶液，邊加邊緩慢搖勻。然后將硅片投入其中浸泡30分鐘后以 去除難溶雜質(zhì)，然后去離子水清洗3~5次去除反應(yīng)溶液備用。
[0023] 用10wt%氫氟酸浸泡硅片20分鐘去除硅片表面的二氧化硅氧化層，使硅片表面形 成Si-H鍵，然后將硅片平鋪于培養(yǎng)皿中，光面朝上，向其中迅速加入15mL具有不同pH值的 硝酸銀溶液（2. 5mM)進(jìn)行反應(yīng)20分鐘，根據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅 片表面原位生長(zhǎng)一層均勻銀納米粒子，從而得到表面修飾銀納米顆粒的硅晶片，最后用氮 氣吹干表面，即可得到硅基SERS基底。
[0024] (2)組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA 將上述過(guò)程制備的硅基SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩儀上 混合孵育，350rpm，25°C恒溫過(guò)夜12小時(shí)，使DNA末端SH基與AgNPs共價(jià)形成Ag-S鍵，使 發(fā)夾DNA共價(jià)連接到AgNPs修飾的Si材料上。然后向溶液中分次加入1M氯化鈉/磷酸鹽 溶液，使溶液最終濃度為〇. 1M，過(guò)夜老化。
[0025] (3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底，用PBS溶液洗滌3次。加入一系列濃度的待檢測(cè)耳 聾致病基因序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行雜交，340rpm，37°C，雜交2小時(shí)后，用PBS或者無(wú)菌去 離子水沖洗表面以去除未連接的游離DNA單分子，然后在空氣中自然晾干，進(jìn)行SERS檢測(cè)。
[0026] 實(shí)施例2 (1)硅片的預(yù)處理工藝 取lcm2大小單硅晶片3~6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離 子水超聲15分鐘，得到表面無(wú)雜質(zhì)無(wú)有機(jī)物的硅片備用。取40mL 98wt%硫酸和30wt%的 過(guò)氧化氫體積比3 :1的混合溶液，邊加邊緩慢搖勻。然后將硅片投入其中浸泡30分鐘后以 去除難溶雜質(zhì)，然后去離子水清洗3~5次去除反應(yīng)溶液備用。
[0027] 用15wt%氫氟酸浸泡硅片15分鐘去除硅片表面的二氧化硅氧化層，使硅片表面形 成Si-H鍵，然后將硅片平鋪于培養(yǎng)皿中，光面朝上，向其中迅速加入20mL具有不同pH值的 硝酸銀溶液（3mM)進(jìn)行反應(yīng)18分鐘，根據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅片 表面原位生長(zhǎng)一層均勻銀納米粒子，從而得到表面修飾銀納米顆粒的硅晶片，最后用氮?dú)?吹干表面，即可得到硅基SERS基底。
[0028] (2)組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA 將上述過(guò)程制備的硅基SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩儀上 混合孵育，340rpm，25°C恒溫過(guò)夜14小時(shí)，使DNA末端SH基于AgNPs共價(jià)形成Ag-S鍵，使 發(fā)夾DNA共價(jià)連接到AgNPs修飾的Si材料上。然后向溶液中分次加入1M氯化鈉/磷酸鹽 溶液，使鹽溶液最終濃度為〇. 4M，過(guò)夜老化。
[0029] (3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底，用PBS溶液洗滌3次。加入一系列濃度的待檢測(cè)耳 聾致病基因序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行雜交，350rpm，37°C，雜交2. 5小時(shí)后，用PBS或者無(wú)菌 去離子水沖洗表面以去除未連接的游離DNA單分子，然后在空氣中自然晾干，進(jìn)行SERS檢 測(cè)。
[0030] 實(shí)施例3 (1)硅片的預(yù)處理工藝 取lcm2大小單硅晶片3~6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離 子水超聲15分鐘，得到表面無(wú)雜質(zhì)無(wú)有機(jī)物的硅片備用。取40mL 98wt%硫酸和30wt%的 過(guò)氧化氫體積比3 :1的混合溶液，邊加邊緩慢搖勻。然后將硅片投入其中浸泡30分鐘后以 去除難溶雜質(zhì)，然后去離子水清洗3~5次去除反應(yīng)溶液備用。
[0031] 用l〇wt%氫氟酸浸泡硅片25分鐘去除硅片表面的二氧化硅氧化層，使硅片表面形 成Si-H鍵，然后將硅片平鋪于培養(yǎng)皿中，光面朝上，向其中迅速加入10mL具有不同pH值的 硝酸銀溶液（2mM)進(jìn)行反應(yīng)25分鐘，根據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅片 表面原位生長(zhǎng)一層均勻銀納米粒子，從而得到表面修飾銀納米顆粒的硅晶片，最后用氮?dú)?吹干表面，即可得到硅基SERS基底。
[0032] (2)組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA 將上述過(guò)程制備的硅基SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩儀上 混合孵育，350rpm，25°C恒溫過(guò)夜15小時(shí)，使DNA末端SH基于AgNPs共價(jià)形成Ag-S鍵，使 發(fā)夾DNA共價(jià)連接到AgNPs修飾的Si材料上。然后向溶液中分次加入2M氯化鈉/磷酸鹽 溶液，使鹽溶液最終濃度為〇. 05M，過(guò)夜老化。
[0033] (3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底，用PBS溶液洗滌4次。加入一系列濃度的待檢測(cè)耳 聾致病基因序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行雜交，360rpm，36°C，雜交2. 5小時(shí)后，用PBS或者無(wú)菌 去離子水沖洗表面以去除未連接的游離DNA單分子，然后在空氣中自然晾干，進(jìn)行SERS檢 測(cè)。
[0034] 實(shí)施例4 (1)硅片的預(yù)處理工藝 取lcm2大小單硅晶片3~6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離 子水超聲15分鐘，得到表面無(wú)雜質(zhì)無(wú)有機(jī)物的硅片備用。取40mL 98wt%硫酸和30wt%的 過(guò)氧化氫體積比3 :1的混合溶液，邊加邊緩慢搖勻。然后將硅片投入其中浸泡30分鐘后以 去除難溶雜質(zhì)，然后去離子水清洗3~5次去除反應(yīng)溶液備用。
[0035] 用5wt%氫氟酸浸泡硅片25分鐘去除硅片表面的二氧化硅氧化層，使硅片表面形 成Si-H鍵，然后將硅片平鋪于培養(yǎng)皿中，光面朝上，向其中迅速加入15mL具有不同pH值的 硝酸銀溶液（3. 5mM)進(jìn)行反應(yīng)15分鐘，根據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅 片表面原位生長(zhǎng)一層均勻銀納米粒子，從而得到表面修飾銀納米顆粒的硅晶片，最后用氮 氣吹干表面，即可得到硅基SERS基底。
[0036] (2)組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA 將上述過(guò)程制備的硅基SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩儀上 混合孵育，360rpm，25°C恒溫過(guò)夜12. 5小時(shí)，使DNA末端SH基于AgNPs共價(jià)形成Ag-S鍵， 使發(fā)夾DNA共價(jià)連接到AgNPs修飾的Si材料上。然后向溶液中分次加入3M氯化鈉/磷酸 鹽溶液，使鹽溶液最終濃度為〇. 3M，過(guò)夜老化。
[0037] (3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底，用PBS溶液洗滌4次。加入一系列濃度的待檢測(cè)耳 聾致病基因序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行雜交，350rpm，37°C，雜交2小時(shí)后，用PBS或者無(wú)菌去 離子水沖洗表面以去除未連接的游離DNA單分子，然后在空氣中自然晾干，進(jìn)行SERS檢測(cè)。
[0038] 實(shí)施例5 (1)硅片的預(yù)處理工藝 取lcm2大小單硅晶片3~6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離 子水超聲15分鐘，得到表面無(wú)雜質(zhì)無(wú)有機(jī)物的硅片備用。取40mL 98wt%硫酸和30wt%的 過(guò)氧化氫體積比3 :1的混合溶液，邊加邊緩慢搖勻。然后將硅片投入其中浸泡30分鐘后以 去除難溶雜質(zhì)，然后去離子水清洗3~5次去除反應(yīng)溶液質(zhì)備用。
[0039] 用10wt%氫氟酸浸泡硅片25分鐘去除硅片表面的二氧化硅氧化層，使硅片表面形 成Si-H鍵，然后將硅片平鋪于培養(yǎng)皿中，光面朝上，向其中迅速加入10mL具有不同pH值的 硝酸銀溶液（4mM)進(jìn)行反應(yīng)10分鐘，根據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅片 表面原位生長(zhǎng)一層均勻銀納米粒子，從而得到表面修飾銀納米顆粒的硅晶片，最后用氮?dú)?吹干表面，即可得到硅基SERS基底。
[0040] (2)組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA 將上述過(guò)程制備的硅基SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩儀上 混合孵育，350rpm，25°C恒溫過(guò)夜13小時(shí)，使DNA末端SH基于AgNPs共價(jià)形成Ag-S鍵，使 發(fā)夾DNA共價(jià)連接到AgNPs修飾的Si材料上。然后向溶液中分次加入2M氯化鈉/磷酸鹽 溶液，使鹽溶液最終濃度為〇. 2M，過(guò)夜老化。
[0041] (3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底，用PBS溶液洗滌4次。加入一系列濃度的待檢測(cè)的 野生型或突變型耳聾DNA序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行雜交，350rpm，35°C，雜交3小時(shí)后，用 PBS或者無(wú)菌去離子水沖洗表面以去除未連接的游離DNA單分子，然后在空氣中自然晾干， 進(jìn)行SERS檢測(cè)。
[0042] 附圖2飛是硅基SERS基底對(duì)實(shí)體中耳聾致病基因的重現(xiàn)性檢測(cè)SERS光譜圖，是 針對(duì)各實(shí)施例步驟（3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因的重現(xiàn)性結(jié)果。在本發(fā)明中采用發(fā)夾DNA 輔助的SERS硅基底進(jìn)行實(shí)體中耳聾致病基因的檢測(cè)，這種檢測(cè)方法相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法 具有更高的靈敏度和特異性，同時(shí)克服重現(xiàn)性差的問(wèn)題，附圖2~5即是該方法重現(xiàn)性的體 現(xiàn)。如圖5所示，在進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼實(shí)驗(yàn)時(shí)，任意掃到的40個(gè)點(diǎn)SERS強(qiáng)度相差不大（約 9000左右)，且經(jīng)計(jì)算得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)是7. 5%，由此可知這種發(fā)夾DNA輔助的 SERS硅基底檢測(cè)方法具有較好的重現(xiàn)性。
[0043] 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在 不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論 從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán) 利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有 變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0044] 此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書(shū)按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包 含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書(shū)的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以理解的其他實(shí)施方式。
【權(quán)利要求】
1. 一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾基因的方法，其特征在于，包括下述步驟： (1) 將單晶硅片置于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離子水超聲清洗，用濃硫酸和 過(guò)氧化氫混合溶液清洗，用氫氟酸溶液浸泡硅片，將硅片平鋪于反應(yīng)器中，光面朝上，向其 中迅速加入不同pH值的硝酸銀溶液進(jìn)行反應(yīng)，得到表面修飾銀納米顆粒的硅片SERS基 底； (2) 將步驟（1)制備的硅片SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩儀 上混合孵育，向溶液中分次加入氯化鈉/磷酸鹽溶液，過(guò)夜老化； (3) 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底，用磷酸鹽緩沖液洗滌多次，加入系列濃度的待檢 測(cè)耳聾致病基因序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行充分雜交后，用磷酸鹽緩沖液或者無(wú)菌去離子水 沖洗表面，空氣中自然晾干，進(jìn)行SERS檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，將單晶硅片置于超聲儀中依 次用去離子水、丙酮、去離子水以60Hz頻率超聲清洗15分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，以體積比=3:1的濃硫酸和 30%過(guò)氧化氫混合溶液清洗硅片30分鐘。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所述氫氟酸溶液的濃度為 1?30%，浸泡娃片的時(shí)間為5?45分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所述硝酸銀溶液濃度為 1飛mM,反應(yīng)時(shí)間為5?25分鐘。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，用1~30%的氫氟酸溶液或 0. 001?5M的NaOH溶液調(diào)節(jié)硝酸銀溶液的pH值。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，用氮?dú)獯蹈杀砻妫玫焦杵?SERS基底。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述發(fā)夾DNA的最初濃度為 1?5uM，反應(yīng)條件為30(T380rpm，反應(yīng)溫度為23?28°C，反應(yīng)時(shí)間至少12小時(shí)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述氯化鈉/磷酸鹽溶液最 初濃度為1~3M，分次加入使組裝溶液最終濃度達(dá)到0. 01~1M。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所述的待檢測(cè)耳聾致病基因 序列溶解于雜交緩沖液中，反應(yīng)條件為30(T380rpm，雜交溫度為3(T38°C，雜交時(shí)間2~4小 時(shí)。
【文檔編號(hào)】G01N21/65GK104215626SQ201410492201
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】何耀, 姜享旭, 王會(huì) 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)