一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾基因的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾基因的方法,以氫氟酸浸泡除雜后的單晶硅片,在其表面形成硅-氫鍵,加入硝酸銀制得硅表面增強(qiáng)拉曼散射基底;將發(fā)夾DNA末端巰基與銀納米粒子共價(jià)形成Ag-S鍵,使發(fā)夾DNA共價(jià)連接到銀納米粒子修飾的硅片上,老化后,加入待檢測(cè)耳聾致病基因序列充分雜交進(jìn)行SERS檢測(cè);本發(fā)明采用發(fā)夾DNA輔助的SERS硅基底進(jìn)行實(shí)體中耳聾致病基因的檢測(cè),有效提局了拉曼檢測(cè)靈敏度,降低檢測(cè)線,具有高特異性,重現(xiàn)性好。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單,成本低,易于普及和傳播。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物體外診斷【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及一種耳聾基因的檢測(cè)方法,具體涉及一 種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是一種最常見(jiàn)的人類(lèi)感覺(jué)系統(tǒng)缺陷,因其病因復(fù)雜、發(fā)生率高和治療困難 等原因而長(zhǎng)久地困擾著廣大患者及其周?chē)巳?,極大地影響著人們的相互交流和生活質(zhì) 量。據(jù)統(tǒng)計(jì),重度耳聾在新生兒中發(fā)生率高達(dá)l/80(Tl/1000 (參見(jiàn):N. Engl. J. Med. 2006,354,2151-2164),全世界幾乎七千萬(wàn)人罹患55分貝以上的聽(tīng)力減退,70歲以上的 人群中超過(guò)60%具有至少25分貝的聽(tīng)力減退(參見(jiàn):Curr. Opin. Pediatr. 2012,24, 679-686)。
[0003] 醫(yī)學(xué)界和科研界一直努力探求新的治療手段,正如恩格斯所說(shuō):"社會(huì)一旦有技 術(shù)上的需要,這種需要就會(huì)比10所大學(xué)更能把科學(xué)推向前進(jìn)。"耳聾基因治療的研究始于 1996年,近十幾年來(lái)得益于現(xiàn)代分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的進(jìn)步,耳聾基因治療取得了較 為飛速的發(fā)展。傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、DNA測(cè)序、寡核苷酸探針雜交法等, 需要指出的是這些檢測(cè)方式操作過(guò)程繁雜冗長(zhǎng)、檢測(cè)靈敏度較低、儀器設(shè)備昂貴,這對(duì)于耳 聾突變基因的早期診斷和治療是極為不利的(參見(jiàn) :J. Hum. Genet. 1999,44,388-390; J. Hum. Genet. 2005,117,9-15; Biosci. Rep. 2008,28,49-59)。
[0004] 表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-Enhanced Raman Scattering,全文簡(jiǎn)稱(chēng):SERS)是在 拉曼散射的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的無(wú)損分析表征技術(shù)。由于其具有譜帶窄、分辨率高、水干擾 小、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于化學(xué)分析、表面催化、食品安全檢測(cè)、材料科學(xué)和生物醫(yī) 學(xué)診斷等領(lǐng)域。但是,表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)能否發(fā)展成為一種具有實(shí)際應(yīng)用意義的分析 技術(shù),很大程度上取決于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,其中關(guān)鍵之處就是制 備出靈敏度高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高、易制備的表面增強(qiáng)拉曼光譜活性基底并能夠在實(shí)體檢 測(cè)中得到廣泛應(yīng)用(參見(jiàn):Small 2013,9,2493-2499; Nano Today 2011,6,122-130)。
[0005] 目前,現(xiàn)有技術(shù)中,尚無(wú)關(guān)于采用表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)實(shí)際體系中耳聾突變基因 進(jìn)行高靈敏特異檢測(cè)的詳細(xì)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 有鑒于此,本發(fā)明的目的在于開(kāi)創(chuàng)性的提供一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾 基因的方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明以氫氟酸(HF)浸泡除雜后的單晶硅片,在其表面形成 硅-氫(Si-H)鍵,加入硝酸銀(AgN0 3)制得硅表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)基底;將發(fā)夾DNA 末端巰基(SH基)與銀納米粒子(silver nanoparticles,全文簡(jiǎn)稱(chēng)AgNPs),使發(fā)夾DNA共 價(jià)連接到 AgNPs 修飾的 Si 材料(AgNPs-decorated silicon wafers,全文簡(jiǎn)稱(chēng) AgNPsOSi) 上,老化后,加入待檢測(cè)耳聾致病基因序列充分雜交進(jìn)行SERS檢測(cè)。
[0008] 具體的,本發(fā)明提供如下技術(shù)方案: 本發(fā)明的基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾基因的方法,包括下述步驟: (1)硅片的預(yù)處理 將單晶硅片置于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離子水超聲清洗,用濃硫酸(H2S04) 和過(guò)氧化氫(H202)混合溶液清洗,用氫氟酸溶液浸泡硅片,將硅片平鋪于反應(yīng)器中,光面朝 上,向其中迅速加入不同pH值的硝酸銀溶液進(jìn)行反應(yīng),得到表面修飾銀納米顆粒的硅片 SERS基底; 上述技術(shù)方案中,將單晶硅片置于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離子水以60Hz 頻率超聲清洗15分鐘。
[0009] 上述技術(shù)方案中,以體積比=3:1的濃硫酸和30%過(guò)氧化氫混合溶液清洗硅片30 分鐘。
[0010] 優(yōu)選的,所述氫氟酸溶液的濃度為1~30% ; 進(jìn)一步的,所述氫氟酸溶液浸泡硅片的時(shí)間為5~45分鐘。
[0011] 優(yōu)選的,所述硝酸銀溶液濃度為l~5mM,反應(yīng)時(shí)間為5~25分鐘。
[0012] 優(yōu)選的,用1?30%的氫氟酸溶液或0. 001?5M的NaOH溶液調(diào)節(jié)硝酸銀溶液的pH值。
[0013] 優(yōu)選的,用氮?dú)獯蹈杀砻?,得到硅基SERS基底。
[0014] (2)組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA 將步驟(1)制備的硅基SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩 儀上混合孵育,向溶液中分次加入氯化鈉/磷酸鹽溶液,過(guò)夜老化; 優(yōu)選的,所述發(fā)夾DNA的最初濃度為l?5uM,反應(yīng)條件為30(T380rpm,反應(yīng)溫度為 23~28°C,反應(yīng)時(shí)間至少12小時(shí)。
[0015] 優(yōu)選的,所述氯化鈉/磷酸鹽溶液最初濃度為廣3M,分次加入使組裝溶液最終濃 度達(dá)到0. 01?1M。
[0016] (3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底,用PBS溶液洗滌多次,加入系列濃度的待檢測(cè)耳聾致 病基因序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行充分雜交后,用PBS或者無(wú)菌去離子水沖洗表面,空氣中 自然晾干,進(jìn)行SERS檢測(cè)。
[0017] 優(yōu)選的,所述的待檢測(cè)耳聾致病基因序列溶解于雜交緩沖液中,反應(yīng)條件為 30(T380rpm,雜交溫度為30?38°C,雜交時(shí)間2?4小時(shí)。
[0018] 本發(fā)明中,調(diào)節(jié)和優(yōu)化硝酸銀溶液的pH值可使硅片表面原位生長(zhǎng)出的銀納米粒 子尺寸均勻、重現(xiàn)性好且具有很強(qiáng)的SERS效應(yīng),克服了傳統(tǒng)方法中重現(xiàn)性差的問(wèn)題,同時(shí) 避免了銀納米粒子在普通制作工藝中的團(tuán)聚效應(yīng)。本發(fā)明無(wú)需在硅片表面制作硅納米線, 工藝步驟簡(jiǎn)單,適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)及實(shí)體檢測(cè)?;谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)的前提下,本發(fā)明采用發(fā) 夾DNA輔助的SERS硅基底進(jìn)行實(shí)體中耳聾致病基因的檢測(cè),有效提高了拉曼檢測(cè)靈敏度, 降低檢測(cè)線(ΙρΜ),具有高特異性,重現(xiàn)性好。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單,成本低,易于普及和傳 播。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0019] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案,下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹,顯而易見(jiàn)地,下面描述中的有關(guān)本發(fā)明的附圖僅僅是本發(fā)明的一 些實(shí)施例,對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講,在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下,還可以根據(jù)這些 附圖獲得其他的附圖。
[0020] 圖1是基于表面增強(qiáng)拉曼散射光譜對(duì)耳聾致病基因高效檢測(cè)的技術(shù)示意圖; 圖2是硅基SERS基底(AgNPsOSi)的掃描電鏡和原子力顯微鏡表征照片; 圖3是硅基SERS基底(AgNPsOSi)對(duì)實(shí)體中耳聾致病基因的靈敏檢測(cè)SERS光譜圖; 圖4是硅基SERS基底(AgNPsOSi)對(duì)實(shí)體中耳聾致病基因的特異檢測(cè)SERS光譜圖; 圖5是硅基SERS基底(AgNPsOSi)對(duì)實(shí)體中耳聾致病基因的重現(xiàn)性檢測(cè)SERS光譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖,對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描 述。
[0022] 本發(fā)明所用的原料可由市場(chǎng)自由購(gòu)得,均為分析純; 實(shí)施例1 (1)硅片的預(yù)處理工藝 取lcm2大小單硅晶片3~6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離 子水超聲15分鐘,得到表面無(wú)雜質(zhì)無(wú)有機(jī)物的硅片備用。取40mL 98wt%硫酸和30wt%的 過(guò)氧化氫體積比3 :1的混合溶液,邊加邊緩慢搖勻。然后將硅片投入其中浸泡30分鐘后以 去除難溶雜質(zhì),然后去離子水清洗3~5次去除反應(yīng)溶液備用。
[0023] 用10wt%氫氟酸浸泡硅片20分鐘去除硅片表面的二氧化硅氧化層,使硅片表面形 成Si-H鍵,然后將硅片平鋪于培養(yǎng)皿中,光面朝上,向其中迅速加入15mL具有不同pH值的 硝酸銀溶液(2. 5mM)進(jìn)行反應(yīng)20分鐘,根據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理,銀離子被Si-H鍵還原,在硅 片表面原位生長(zhǎng)一層均勻銀納米粒子,從而得到表面修飾銀納米顆粒的硅晶片,最后用氮 氣吹干表面,即可得到硅基SERS基底。
[0024] (2)組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA 將上述過(guò)程制備的硅基SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩儀上 混合孵育,350rpm,25°C恒溫過(guò)夜12小時(shí),使DNA末端SH基與AgNPs共價(jià)形成Ag-S鍵,使 發(fā)夾DNA共價(jià)連接到AgNPs修飾的Si材料上。然后向溶液中分次加入1M氯化鈉/磷酸鹽 溶液,使溶液最終濃度為〇. 1M,過(guò)夜老化。
[0025] (3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底,用PBS溶液洗滌3次。加入一系列濃度的待檢測(cè)耳 聾致病基因序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行雜交,340rpm,37°C,雜交2小時(shí)后,用PBS或者無(wú)菌去 離子水沖洗表面以去除未連接的游離DNA單分子,然后在空氣中自然晾干,進(jìn)行SERS檢測(cè)。
[0026] 實(shí)施例2 (1)硅片的預(yù)處理工藝 取lcm2大小單硅晶片3~6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離 子水超聲15分鐘,得到表面無(wú)雜質(zhì)無(wú)有機(jī)物的硅片備用。取40mL 98wt%硫酸和30wt%的 過(guò)氧化氫體積比3 :1的混合溶液,邊加邊緩慢搖勻。然后將硅片投入其中浸泡30分鐘后以 去除難溶雜質(zhì),然后去離子水清洗3~5次去除反應(yīng)溶液備用。
[0027] 用15wt%氫氟酸浸泡硅片15分鐘去除硅片表面的二氧化硅氧化層,使硅片表面形 成Si-H鍵,然后將硅片平鋪于培養(yǎng)皿中,光面朝上,向其中迅速加入20mL具有不同pH值的 硝酸銀溶液(3mM)進(jìn)行反應(yīng)18分鐘,根據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理,銀離子被Si-H鍵還原,在硅片 表面原位生長(zhǎng)一層均勻銀納米粒子,從而得到表面修飾銀納米顆粒的硅晶片,最后用氮?dú)?吹干表面,即可得到硅基SERS基底。
[0028] (2)組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA 將上述過(guò)程制備的硅基SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩儀上 混合孵育,340rpm,25°C恒溫過(guò)夜14小時(shí),使DNA末端SH基于AgNPs共價(jià)形成Ag-S鍵,使 發(fā)夾DNA共價(jià)連接到AgNPs修飾的Si材料上。然后向溶液中分次加入1M氯化鈉/磷酸鹽 溶液,使鹽溶液最終濃度為〇. 4M,過(guò)夜老化。
[0029] (3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底,用PBS溶液洗滌3次。加入一系列濃度的待檢測(cè)耳 聾致病基因序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行雜交,350rpm,37°C,雜交2. 5小時(shí)后,用PBS或者無(wú)菌 去離子水沖洗表面以去除未連接的游離DNA單分子,然后在空氣中自然晾干,進(jìn)行SERS檢 測(cè)。
[0030] 實(shí)施例3 (1)硅片的預(yù)處理工藝 取lcm2大小單硅晶片3~6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離 子水超聲15分鐘,得到表面無(wú)雜質(zhì)無(wú)有機(jī)物的硅片備用。取40mL 98wt%硫酸和30wt%的 過(guò)氧化氫體積比3 :1的混合溶液,邊加邊緩慢搖勻。然后將硅片投入其中浸泡30分鐘后以 去除難溶雜質(zhì),然后去離子水清洗3~5次去除反應(yīng)溶液備用。
[0031] 用l〇wt%氫氟酸浸泡硅片25分鐘去除硅片表面的二氧化硅氧化層,使硅片表面形 成Si-H鍵,然后將硅片平鋪于培養(yǎng)皿中,光面朝上,向其中迅速加入10mL具有不同pH值的 硝酸銀溶液(2mM)進(jìn)行反應(yīng)25分鐘,根據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理,銀離子被Si-H鍵還原,在硅片 表面原位生長(zhǎng)一層均勻銀納米粒子,從而得到表面修飾銀納米顆粒的硅晶片,最后用氮?dú)?吹干表面,即可得到硅基SERS基底。
[0032] (2)組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA 將上述過(guò)程制備的硅基SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩儀上 混合孵育,350rpm,25°C恒溫過(guò)夜15小時(shí),使DNA末端SH基于AgNPs共價(jià)形成Ag-S鍵,使 發(fā)夾DNA共價(jià)連接到AgNPs修飾的Si材料上。然后向溶液中分次加入2M氯化鈉/磷酸鹽 溶液,使鹽溶液最終濃度為〇. 05M,過(guò)夜老化。
[0033] (3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底,用PBS溶液洗滌4次。加入一系列濃度的待檢測(cè)耳 聾致病基因序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行雜交,360rpm,36°C,雜交2. 5小時(shí)后,用PBS或者無(wú)菌 去離子水沖洗表面以去除未連接的游離DNA單分子,然后在空氣中自然晾干,進(jìn)行SERS檢 測(cè)。
[0034] 實(shí)施例4 (1)硅片的預(yù)處理工藝 取lcm2大小單硅晶片3~6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離 子水超聲15分鐘,得到表面無(wú)雜質(zhì)無(wú)有機(jī)物的硅片備用。取40mL 98wt%硫酸和30wt%的 過(guò)氧化氫體積比3 :1的混合溶液,邊加邊緩慢搖勻。然后將硅片投入其中浸泡30分鐘后以 去除難溶雜質(zhì),然后去離子水清洗3~5次去除反應(yīng)溶液備用。
[0035] 用5wt%氫氟酸浸泡硅片25分鐘去除硅片表面的二氧化硅氧化層,使硅片表面形 成Si-H鍵,然后將硅片平鋪于培養(yǎng)皿中,光面朝上,向其中迅速加入15mL具有不同pH值的 硝酸銀溶液(3. 5mM)進(jìn)行反應(yīng)15分鐘,根據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理,銀離子被Si-H鍵還原,在硅 片表面原位生長(zhǎng)一層均勻銀納米粒子,從而得到表面修飾銀納米顆粒的硅晶片,最后用氮 氣吹干表面,即可得到硅基SERS基底。
[0036] (2)組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA 將上述過(guò)程制備的硅基SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩儀上 混合孵育,360rpm,25°C恒溫過(guò)夜12. 5小時(shí),使DNA末端SH基于AgNPs共價(jià)形成Ag-S鍵, 使發(fā)夾DNA共價(jià)連接到AgNPs修飾的Si材料上。然后向溶液中分次加入3M氯化鈉/磷酸 鹽溶液,使鹽溶液最終濃度為〇. 3M,過(guò)夜老化。
[0037] (3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底,用PBS溶液洗滌4次。加入一系列濃度的待檢測(cè)耳 聾致病基因序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行雜交,350rpm,37°C,雜交2小時(shí)后,用PBS或者無(wú)菌去 離子水沖洗表面以去除未連接的游離DNA單分子,然后在空氣中自然晾干,進(jìn)行SERS檢測(cè)。
[0038] 實(shí)施例5 (1)硅片的預(yù)處理工藝 取lcm2大小單硅晶片3~6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離 子水超聲15分鐘,得到表面無(wú)雜質(zhì)無(wú)有機(jī)物的硅片備用。取40mL 98wt%硫酸和30wt%的 過(guò)氧化氫體積比3 :1的混合溶液,邊加邊緩慢搖勻。然后將硅片投入其中浸泡30分鐘后以 去除難溶雜質(zhì),然后去離子水清洗3~5次去除反應(yīng)溶液質(zhì)備用。
[0039] 用10wt%氫氟酸浸泡硅片25分鐘去除硅片表面的二氧化硅氧化層,使硅片表面形 成Si-H鍵,然后將硅片平鋪于培養(yǎng)皿中,光面朝上,向其中迅速加入10mL具有不同pH值的 硝酸銀溶液(4mM)進(jìn)行反應(yīng)10分鐘,根據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理,銀離子被Si-H鍵還原,在硅片 表面原位生長(zhǎng)一層均勻銀納米粒子,從而得到表面修飾銀納米顆粒的硅晶片,最后用氮?dú)?吹干表面,即可得到硅基SERS基底。
[0040] (2)組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA 將上述過(guò)程制備的硅基SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩儀上 混合孵育,350rpm,25°C恒溫過(guò)夜13小時(shí),使DNA末端SH基于AgNPs共價(jià)形成Ag-S鍵,使 發(fā)夾DNA共價(jià)連接到AgNPs修飾的Si材料上。然后向溶液中分次加入2M氯化鈉/磷酸鹽 溶液,使鹽溶液最終濃度為〇. 2M,過(guò)夜老化。
[0041] (3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底,用PBS溶液洗滌4次。加入一系列濃度的待檢測(cè)的 野生型或突變型耳聾DNA序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行雜交,350rpm,35°C,雜交3小時(shí)后,用 PBS或者無(wú)菌去離子水沖洗表面以去除未連接的游離DNA單分子,然后在空氣中自然晾干, 進(jìn)行SERS檢測(cè)。
[0042] 附圖2飛是硅基SERS基底對(duì)實(shí)體中耳聾致病基因的重現(xiàn)性檢測(cè)SERS光譜圖,是 針對(duì)各實(shí)施例步驟(3)檢測(cè)實(shí)體中耳聾致病基因的重現(xiàn)性結(jié)果。在本發(fā)明中采用發(fā)夾DNA 輔助的SERS硅基底進(jìn)行實(shí)體中耳聾致病基因的檢測(cè),這種檢測(cè)方法相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法 具有更高的靈敏度和特異性,同時(shí)克服重現(xiàn)性差的問(wèn)題,附圖2~5即是該方法重現(xiàn)性的體 現(xiàn)。如圖5所示,在進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼實(shí)驗(yàn)時(shí),任意掃到的40個(gè)點(diǎn)SERS強(qiáng)度相差不大(約 9000左右),且經(jīng)計(jì)算得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)是7. 5%,由此可知這種發(fā)夾DNA輔助的 SERS硅基底檢測(cè)方法具有較好的重現(xiàn)性。
[0043] 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié),而且在 不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下,能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此,無(wú)論 從哪一點(diǎn)來(lái)看,均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本發(fā)明的范圍由所附權(quán) 利要求而不是上述說(shuō)明限定,因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有 變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0044] 此外,應(yīng)當(dāng)理解,雖然本說(shuō)明書(shū)按照實(shí)施方式加以描述,但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包 含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案,說(shuō)明書(shū)的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn),本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體,各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合,形成本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以理解的其他實(shí)施方式。
【權(quán)利要求】
1. 一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)耳聾基因的方法,其特征在于,包括下述步驟: (1) 將單晶硅片置于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、去離子水超聲清洗,用濃硫酸和 過(guò)氧化氫混合溶液清洗,用氫氟酸溶液浸泡硅片,將硅片平鋪于反應(yīng)器中,光面朝上,向其 中迅速加入不同pH值的硝酸銀溶液進(jìn)行反應(yīng),得到表面修飾銀納米顆粒的硅片SERS基 底; (2) 將步驟(1)制備的硅片SERS基底與溶解于磷酸鹽緩沖液的發(fā)夾DNA在恒溫震蕩儀 上混合孵育,向溶液中分次加入氯化鈉/磷酸鹽溶液,過(guò)夜老化; (3) 取出已組裝發(fā)夾DNA的材料基底,用磷酸鹽緩沖液洗滌多次,加入系列濃度的待檢 測(cè)耳聾致病基因序列于恒溫振蕩儀中進(jìn)行充分雜交后,用磷酸鹽緩沖液或者無(wú)菌去離子水 沖洗表面,空氣中自然晾干,進(jìn)行SERS檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟(1)中,將單晶硅片置于超聲儀中依 次用去離子水、丙酮、去離子水以60Hz頻率超聲清洗15分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟(1)中,以體積比=3:1的濃硫酸和 30%過(guò)氧化氫混合溶液清洗硅片30分鐘。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟(1)中,所述氫氟酸溶液的濃度為 1?30%,浸泡娃片的時(shí)間為5?45分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟(1)中,所述硝酸銀溶液濃度為 1飛mM,反應(yīng)時(shí)間為5?25分鐘。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟(1)中,用1~30%的氫氟酸溶液或 0. 001?5M的NaOH溶液調(diào)節(jié)硝酸銀溶液的pH值。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟(1)中,用氮?dú)獯蹈杀砻妫玫焦杵?SERS基底。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟(2)中,所述發(fā)夾DNA的最初濃度為 1?5uM,反應(yīng)條件為30(T380rpm,反應(yīng)溫度為23?28°C,反應(yīng)時(shí)間至少12小時(shí)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟(2)中,所述氯化鈉/磷酸鹽溶液最 初濃度為1~3M,分次加入使組裝溶液最終濃度達(dá)到0. 01~1M。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟(1)中,所述的待檢測(cè)耳聾致病基因 序列溶解于雜交緩沖液中,反應(yīng)條件為30(T380rpm,雜交溫度為3(T38°C,雜交時(shí)間2~4小 時(shí)。
【文檔編號(hào)】G01N21/65GK104215626SQ201410492201
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】何耀, 姜享旭, 王會(huì) 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)