專利名稱：一種百日咳桿菌CpG-ODNs作為防治哮喘的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利公開了一種百日咳桿菌核苷酸序列(命名seq Α)及其應(yīng)用，該seq A 可通過TOLL信號分子產(chǎn)生防治哮喘作用。
背景技術(shù)：
非甲基化的寡核苷酸單鏈(CpG-ODNs)是一種主要存在于細菌體內(nèi)的DNA序列，可與免疫細胞(樹突狀細胞等)內(nèi)體TOLL樣受體(TLR) 9結(jié)合形成二聚體，經(jīng)調(diào)節(jié)Thl/Th2 平衡抑制變應(yīng)性哮喘。百日咳桿菌為一類致病性微生物，標準化百日咳疫苗的常規(guī)接種可顯著降低百日咳疾病的發(fā)病率，全細胞百日咳疫苗選擇性增強人和動物的Thl型反應(yīng)，這與菌體內(nèi)CpG-ODNs有關(guān)，其可顯著減輕小鼠哮喘模型的氣道炎癥及細胞因子分泌等，維持 Thl/Th2的平衡，減輕哮喘癥狀。已知人工合成CpG-ODNs序列可抑制動物模型的變應(yīng)性哮喘，但對人變應(yīng)性哮喘幾乎無效，這與TLR-9識別CpG-ODNs位點不同有關(guān)，基于全細胞百日咳桿菌無種屬特異性，我們分析其CpG-ODNs序列不同于人工合成CpG-ODNs，對人及動物均有防治變應(yīng)性哮喘活性。Vetor NTI Advance軟件為生物科技公司Invitrogen的產(chǎn)品，是目前整合度最高的多功能桌面序列分析軟件包，通過功能模塊化可實現(xiàn)序列同源性比對、分析等功能。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA )把抗原抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用原理有機地結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)。受檢標本與載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，再加入酶標記的抗原或抗體，最后加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)通過轉(zhuǎn)錄酶作用將目的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過普通PCR擴增目的片段，最后電泳檢測，分析電泳圖條帶從而獲得目的基因相對表達量。蛋白質(zhì)雜交技術(shù)(western blot)通過提取總蛋白，進行電泳后分離出不同分子量的蛋白，電轉(zhuǎn)移至膜載體，抗原抗體反應(yīng)后可通過分析蛋白條帶反映出蛋白相對表達量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提種一種新型的防治哮喘的藥物。本發(fā)明所說的防治哮喘的藥物，是一種百日咳桿菌CpG-0DNS(Seq A)，它的序列如 SEQ ID NO 1 所示。上述所說的百日咳桿菌CpG-ODNs (seq A)在制備防治哮喘藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)實驗表明腹腔注射百日咳桿菌CpG-ODNs (seq Α)可以抑制哮喘的炎癥反應(yīng)，預(yù)防或控制哮喘發(fā)作。這是以TLR-9信號分子產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、“Thl/Th2失衡”為理論基礎(chǔ)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 seq A對哮喘相關(guān)細胞因子的調(diào)整和抑制氣道炎癥的作用。打破了以 “抗炎、舒張氣道平滑肌”為靶點對哮喘的傳統(tǒng)治法，建立了 “哮喘預(yù)防為主”的新途徑，從而為控制發(fā)作及預(yù)防哮喘開辟新途徑。


圖1是.ig百日咳桿菌CpG-ODNs對小鼠BALF中WBC及EOS影響；其中seq A可有效下調(diào)BALF中WBC及E0S，與其他序列比較作用最強。與其他各個序列組比較，差異有顯著性。圖2是ip百日咳桿菌CpG-ODNs對小鼠BALF中WBC及EOS影響；以seq AipT 調(diào)BALF中WBC及E0S，作用最強，與其他各序列組比較，差異有顯著性。
具體實施例方式1.制備百日咳桿菌CpG-ODNs
本實驗根據(jù)Genebank提供的WPI國際標準株基因組序列。Genebank中選擇 Genome選項，搜索并下載百日咳桿菌(Bordetella pertussis)基因組全序列，將全序列文件導(dǎo)入Vector NTI Advancell軟件；查閱文獻，獲取三條具有抗變應(yīng)性哮喘活性的 CpG-ODNs (0DN-1018、0DN-1026、0DN-3234)；應(yīng)用 vector NTI Advance 軟件比對(Blast) 已知效應(yīng)序列0DN-1018、0DN-1026、0DN-3234與百日咳桿菌基因組，獲得9條同源性最高序列，9條序列如下
表1.百日咳桿菌CpG-ODNs
NameSequencesSeqA5，-TCCAAGACGTTCATGGCGAT-3，(SEQIDN0 1)SeqB5，-TGCATGACGATCCTGCCGAT-3，(SEQIDN0 2)SeqC5，-ACCGCGACGTTATAGGCGTT-3，(SEQIDN0 3)SeqD5，-ATGACGGTAACGACCGGATG-3，(SEQIDN0 4)SeqE5’ -AAGAAGCTGACGTTGAGATG-3，(SEQIDN0 5)SeqF5，-CAGTTGTGAACGTCCGCAAGC-3，(SEQIDN0 6)SeqG5，-TGCCAGGCGTCTTCATG-3，(SEQIDN0 7)SeqH5，-ACGAAGGCGTCCTTGTT-3，(SEQIDN0 8)SeqI5，-GCTCAGACGTTTCTGGT-3，(SEQIDN0 9)
2.哮喘模型的建立
取Babl/c雌性小鼠，采用卵白蛋白(OVA)致敏法，分別于實驗的第0和14天致敏小鼠。第16-18天每天霧化吸入1% 0VA，激發(fā)30min，建立急性哮喘模型；連續(xù)激發(fā)8周，建立慢性哮喘模型。對照組小鼠以生理鹽水代替OVA。3.灌胃及腹腔注射
目前，常用的CpG-ODNs灌胃劑量為100 μ g/只，腹腔注射劑量為50 μ g/只。按照上述方法建立小鼠哮喘模型，使用兩種給藥途徑給藥。4.百日咳桿菌CpG-ODNs對氣道炎癥的影響
制備小鼠急性哮喘模型，于末次激發(fā)24h內(nèi)，收集并檢測BALF，計算BALF中白細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)。實驗發(fā)現(xiàn)百日咳桿菌CpG-ODNs普遍具有減少氣道炎癥中白細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞數(shù)的作用，其中作用最強序列為seq A，且腹腔注射組作用優(yōu)于灌胃組 (見表2，表3，圖1及圖2)。表2. ig 給藥組 BALF 中 WBC 及 Eos 計數(shù)()
權(quán)利要求
1.一種防治哮喘的藥物，是百日咳桿菌CpG-ODNs，它的序列如SEQ ID NO :1所示。
2.序列如SEQID NO 1所示的百日咳桿菌CpG-ODNs在制備防治哮喘藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型的防治哮喘的藥物，是序列如SEQIDNO1所示的百日咳桿菌CpG-ODNs。所述的百日咳桿菌CpG-ODNs(seqA)可以抑制哮喘的炎癥反應(yīng)，預(yù)防或控制哮喘發(fā)作。這是以TLR-9信號分子產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、“Th1/Th2失衡”為理論基礎(chǔ)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了seqA對哮喘相關(guān)細胞因子的調(diào)整和抑制氣道炎癥的作用。打破了以“抗炎、舒張氣道平滑肌”為靶點對哮喘的傳統(tǒng)治法，建立了“哮喘預(yù)防為主”的新途徑，從而為控制發(fā)作及預(yù)防哮喘開辟新途徑。
文檔編號A61K31/7105GK102166217SQ20111004447
公開日2011年8月31日 申請日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月24日
發(fā)明者孫云, 張寶袁, 王德俊, 遲深 申請人:揚州大學(xué)