一種抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明的一種豬源嵌合抗體由一條輕鏈和一條重鏈通過(guò)二硫鍵和非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)形成，所述的輕鏈從N端到C端依次包括鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗輕鏈可變區(qū)和豬IgG輕鏈恒定區(qū)，所述的重鏈依次包括鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗重鏈可變區(qū)和豬IgG重鏈恒定區(qū)。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的一種抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體無(wú)論在體內(nèi)還是體外都具有顯著地抑菌效果，因此本發(fā)明的抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體在檢測(cè)或預(yù)防副豬嗜血桿菌感染方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬源嵌合抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，特別涉及ー種能夠抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPS)為非溶血、NAD依賴性的革蘭氏陰性菌，屬于巴斯德桿菌科。副豬嗜血桿菌是豬的ー種重要上呼吸道病原菌，是格拉瑟氏病(Glsser’s Disease)的病原。該病以腦膜炎、關(guān)節(jié)炎以及纖維素性多發(fā)性漿膜炎為主要特征，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)敗血癥和急性肺炎癥狀。近年，隨著豬群養(yǎng)殖方式的改變，如早期斷奶方案和三點(diǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的應(yīng)用，因副豬嗜血桿菌而引起的豬群的發(fā)病率和死亡率逐年増加，并且已成為危害商業(yè)化養(yǎng)豬場(chǎng)，特別是SPF豬場(chǎng)最為嚴(yán)重的細(xì)菌病之一。雖然用抗生素可以有效治療因HPS引起的格拉瑟氏病，但關(guān)于HPS的耐藥性已經(jīng)有很多報(bào)道。疫苗是防治格拉瑟氏病的有效方法，但是由于HPS血清型眾多，単一血清型的疫苗只能保護(hù)豬群免受同型HPS的攻擊，并且關(guān)于HPS疫苗交叉保護(hù)能力較差已經(jīng)有很多研究報(bào)道。因此，尋找新的防治格拉瑟氏病的方法是非常必要的。
[0003]鼠源抗副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)單克隆抗體1D8能與15個(gè)血清型副豬嗜血桿菌反應(yīng)，井能部分保護(hù)小鼠免受同源及異源副豬嗜血桿菌額攻擊，請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn):副豬嗜血桿菌具有保護(hù)效カ單克隆抗體的篩選和免疫原性蛋白的鑒定，田華彬，《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院》，2012年。然而，直接在其他種屬動(dòng)物上應(yīng)用鼠源單克隆抗體可能存在問(wèn)題。來(lái)自不同種屬動(dòng)物的抗體可能不與Fe受體和/或補(bǔ)體反應(yīng)，這會(huì)導(dǎo)致適當(dāng)?shù)南掠喂δ艿娜狈Σ⒃隗w內(nèi)被快速清除。為了克服鼠源單克隆抗體在豬體內(nèi)應(yīng)用的缺陷從而產(chǎn)生了包含豬Fe區(qū)域和鼠源可變區(qū)的嵌合抗體。利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生嵌合抗體用于人類疾病的治療和預(yù)防已被廣泛報(bào)道。產(chǎn)生鼠-豬嵌合抗體的報(bào)道寥寥無(wú)幾。僅有針對(duì)豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體構(gòu)建的鼠-豬嵌合抗體的報(bào)道，但兩篇文章均未提及嵌合抗體在體內(nèi)抵抗病毒攻擊的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種新的可用于副豬嗜血桿菌感染的檢測(cè)和預(yù)防的方法。為此，本發(fā)明提出了一種抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的一種抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體無(wú)論在體內(nèi)還是體外都具有顯著地抑菌效果。
[0005]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段:
[0006]本發(fā)明的一種抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體，其特征在于所述的抗體由一條輕鏈和一條重鏈通過(guò)二硫鍵和非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)而成，所述的輕鏈從N端到C端依次包括鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗輕鏈可變區(qū)和豬IgG輕鏈恒定區(qū)，所述的重鏈依次包括鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗重鏈可變區(qū)和豬IgG重鏈恒定區(qū)。
[0007]在本發(fā)明中，優(yōu)選的， 所述的鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的豬IgG輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述的鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述的豬IgG重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0008]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的輕鏈和重鏈的N端還包括信號(hào)肽序列，更優(yōu)選的，所述的輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示，所述的重鏈的氨基酸序列如SEQ IDN0.6所示。
[0009]本發(fā)明還提出了編碼以上任一項(xiàng)所述豬源嵌合抗體的核苷酸序列。
[0010]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，編碼鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，編碼豬IgG輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示，編碼鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示，編碼豬IgG重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。
[0011]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，編碼輕鏈和重鏈的核苷酸序列的5’端還分別連有編碼信號(hào)肽序列的核苷酸序列，更優(yōu)選的，編碼輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示，編碼重鏈的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示。
[0012]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的信號(hào)肽序列如SEQ ID N0.13所示，編碼該信號(hào)肽的核苷酸序列如SEQ ID N0.14所示。
[0013]更進(jìn)一歩的，本發(fā)明還提出了ー種表達(dá)載體，其特征在于含有以上任一項(xiàng)所述的核苷酸序列。
[0014]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體為桿狀病毒表達(dá)載體，更優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體是在雙向表達(dá)載體pFast-Bac-Dual的基礎(chǔ)上構(gòu)建得到的。
·[0015]再進(jìn)ー步的，本發(fā)明還提出了一種表達(dá)所述的抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0016](I)構(gòu)建用于表達(dá)抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體的桿狀病毒表達(dá)載體，其中編碼豬源嵌合抗體輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示，編碼豬源嵌合抗體重鏈的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示；
[0017](2)將構(gòu)建得到的桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞并進(jìn)行桿狀病毒的組裝；
[0018](3)獲得的桿狀病毒接種昆蟲(chóng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80-90%，收獲桿狀病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物，純化，即得。
[0019]在本發(fā)明中，優(yōu)選的所述的桿狀病毒表達(dá)載體是在雙向表達(dá)載體pFast-Bac-Dual的基礎(chǔ)上構(gòu)建得到的，所述的編碼豬源嵌合抗體輕鏈的核苷酸序列以及編碼豬源嵌合抗體重鏈的核苷酸序列分別各自位于pFast-Bac-Dual上的PPH啟動(dòng)子或p 10啟動(dòng)子的下游,所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞為sf-900 II。
[0020]最后，本發(fā)明還提出了所述的抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體在制備檢測(cè)或預(yù)防副豬嗜血桿菌感染試劑或藥物中的應(yīng)用。及
[0021]所述的表達(dá)載體在制備抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體中的應(yīng)用。
[0022]實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的方法制備得到的嵌合抗體蛋白，在體外能夠抑制副豬嗜血桿菌生長(zhǎng)；在小鼠體內(nèi)能夠小鼠免受致死劑量的副豬嗜血桿菌的攻擊。因此，說(shuō)明本發(fā)明的嵌合抗體蛋白無(wú)論在體內(nèi)還是體外都具有顯著地抑菌效果。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0023]圖1為單抗輕重鏈可變區(qū)與豬源抗體輕重鏈恒定區(qū)的PCR鑒定結(jié)果；
[0024]M:DNA Marker DL2000 ；1:輕鏈可變區(qū)；2:輕鏈恒定區(qū)；3:重鏈可變區(qū)；4:重鏈恒定區(qū)。
[0025]圖2為重組質(zhì)粒輕鏈與重鏈PCR鑒定結(jié)果；
[0026]1、3:輕鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2、4:重鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5:陰性對(duì)照；M:DNAMarkerDL2000 [0027]圖3為雙向表達(dá)載體pFast-Bac-Dual的載體圖譜；
[0028]圖4為輕鏈連接到pFast-Bac-Dual之后的雙酶切鑒定結(jié)果；
[0029]1:輕鏈的雙酶切鑒定圖譜；M:DNA Marker DL2000
[0030]圖5為連接有輕重鏈的pFast-Bac-Dual質(zhì)粒的輕重鏈的雙酶切鑒定結(jié)果；
[0031]1:重鏈的雙酶切鑒定結(jié)果；2:輕鏈雙酶切鑒定結(jié)果；M:DNA Marker DL2000
[0032]圖6為雙向表達(dá)載體pFast-Bac-Dual-H+L的載體圖譜；
[0033]圖7為P2病毒接毒72h之后的昆蟲(chóng)細(xì)胞與對(duì)照組昆蟲(chóng)細(xì)胞的對(duì)比圖片；
[0034]圖8為桿狀病毒表達(dá)之后的SDS-PAGE結(jié)果；
[0035]M:蛋白Markerl:純化后的表達(dá)蛋白
[0036]圖9為桿狀病毒表達(dá)之后的Western Blot檢測(cè)圖譜；
[0037]M:蛋白Markerl:純化后的蛋白的Western Blot圖譜
[0038]圖10為重組蛋白與單抗1D8的ELISA對(duì)比結(jié)果；
[0039]圖11為重組蛋白的體內(nèi)抑菌試驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)ー步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0041]實(shí)施例1單抗輕重鏈可變區(qū)序列與豬抗體輕重鏈恒定區(qū)的擴(kuò)增
[0042]I)鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)序列的擴(kuò)增
[0043]抗副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPS)單克隆抗體1D8的制備及鑒定請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn):副豬嗜血桿菌具有保護(hù)效カ單克隆抗體的篩選和免疫原性蛋白的鑒定，田華彬，《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院》，2012年。由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究哈爾濱獸醫(yī)研究所豬傳染病室豬病分子診斷組分離并保存。
[0044]鑒定抗體的亞型之后，將單抗細(xì)胞進(jìn)行總RNA的提取(根據(jù)Axygen總RNA小量提取試劑盒)，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用設(shè)計(jì)的引物BacVL-F、BacVL-R與BacVH-F、BacVH-R，各引物序列如下表1所示，分別擴(kuò)增鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗輕鏈可變區(qū)序列與單抗重鏈可變區(qū)序列。
[0045]表1
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體，其特征在于所述的抗體由一條輕鏈和一條重鏈通過(guò)二硫鍵和非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)而成，所述的輕鏈從N端到C端依次包括鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗輕鏈可變區(qū)和豬IgG輕鏈恒定區(qū)，所述的重鏈依次包括鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗重鏈可變區(qū)和豬IgG重鏈恒定區(qū)。
2.如權(quán)利要求1所述的豬源嵌合抗體，其特征在于所述的鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的豬IgG輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQID N0.2所示，所述的鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述的豬IgG重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的豬源嵌合抗體，其特征在于在所述的輕鏈和重鏈的N端還包括信號(hào)肽序列，優(yōu)選的，所述的輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示，所述的重鏈的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示。
4.編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述豬源嵌合抗體的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于編碼鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，編碼豬IgG輕鏈恒定區(qū)的核苷酸序列如SEQ IDN0.8所示，編碼鼠源抗副豬嗜血桿菌單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示，編碼豬IgG重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。
6.如權(quán)利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于在編碼輕鏈和重鏈的核苷酸序列的5’端還分別連有編碼信號(hào)肽序列的核苷酸序列，優(yōu)選的，編碼輕鏈的核苷酸序列如SEQ IDN0.11所示，編碼重鏈的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示。
7.—種表達(dá)載體,其特征在于含有權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的核苷酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體為桿狀病毒表達(dá)載體，優(yōu)選的，所述的表達(dá)載體是在雙向表達(dá)載體pFast-Bac-Dual的基礎(chǔ)上構(gòu)建得到的。
9.ー種表達(dá)權(quán)利要求1所述的抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)構(gòu)建用于表達(dá)抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體的桿狀病毒表達(dá)載體，其中編碼豬源嵌合抗體輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示，編碼豬源嵌合抗體重鏈的核苷酸序列如 SEQ ID N0.12 所示； (2)將構(gòu)建得到的桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞并進(jìn)行桿狀病毒的組裝； (3)獲得的桿狀病毒接種昆蟲(chóng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80-90%，收獲桿狀病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物，純化，即得。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述的桿狀病毒表達(dá)載體是在雙向表達(dá)載體pFast-Bac-Dual的基礎(chǔ)上構(gòu)建得到的，所述的編碼豬源嵌合抗體輕鏈的核苷酸序列以及編碼豬源嵌合抗體重鏈的核苷酸序列分別各自位于pFast-Bac-Dual上的PPH啟動(dòng)子或PlO啟動(dòng)子的下游，所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞為sf-900 II。
11.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體在制備檢測(cè)或預(yù)防副豬嗜血桿菌感染試劑或藥物中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)載體在制備抗副豬嗜血桿菌的豬源嵌合抗體中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/40GK103570832SQ201310431967
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】李曦, 符芳, 柴政, 田華彬 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所