一種蜂蜜中雷公藤次堿的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及蜂蜜中雷公藤生物堿檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種蜂蜜中雷公藤次堿的檢測(cè)方法。該方法包括以下的步驟：1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，2）試樣制備，3）提取，4）凈化，5）色譜條件，6）質(zhì)譜條件；本發(fā)明建立了一種固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)蜂蜜中雷公藤次堿的分析方法。樣品用水溶解后經(jīng)固相凈化小柱，經(jīng)HypersilGOLDC18柱（50mm×2.1mm,1.9um）分離，電噴霧離子源正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量?？疾觳?yōu)化了試樣溶解溶劑、凈化方法、色譜和質(zhì)譜條件等。本方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，適用于蜂蜜中雷公藤相關(guān)物質(zhì)殘留的定性、定量檢測(cè)。
【專利說明】一種蜂蜜中雷公藤次堿的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蜂蜜中雷公藤生物堿檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種蜂蜜中雷公藤次堿的檢 測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 蜂蜜作為一種傳統(tǒng)的天然保健食品，主要是由蜜蜂采集植物花蜜、植物活體分泌 物或在植物活體上吮吸養(yǎng)分的昆蟲分泌物貯存在巢脾內(nèi)，并經(jīng)蜜蜂體內(nèi)特有物質(zhì)結(jié)合充分 釀造、轉(zhuǎn)化、脫水、儲(chǔ)藏，留待成熟后的天然甜性物質(zhì)。蜜蜂如果采集有毒植物的花粉釀成 蜜，蜂蜜就會(huì)混進(jìn)有毒物質(zhì)。
[0003] 《GB 14963-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)蜂蜜》3. 1蜜源要求：蜜蜂采集植物的花蜜、 分泌物或蜜露應(yīng)安全無毒，不得來源于雷公藤（Tripterygium wilfordi Hook. F.)、博落回 [Macleaya cordata(Willd.) R. Br]、狼毒（Stelera chamaejasme L.)等有毒蜜源植物。
[0004] 有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook. f.)主要?dú)⑾x活性成分為 雷公藤生物堿，該類生物堿對(duì)多種害蟲有較強(qiáng)的拒食和毒殺作用，對(duì)小菜蛾、菜青蟲及二化 螟等鱗翅目害蟲尤為明顯，其中以雷公藤次堿的活性最為突出。
[0005] 目前對(duì)雷公藤次堿的分析方法由《農(nóng)藥》第44卷第4期2005年4月公開的雷公 藤次堿的高效液相色譜分析方法，該方法采用高效液相色譜法，乙腈+〇. 〇2mol/L磷酸二氫 鉀水溶液（50+50)作為流動(dòng)相，流速為lml/min，C18反相色譜柱，紫外檢測(cè)波長為195nm， 用外標(biāo)法對(duì)提取物中的雷公藤次堿進(jìn)行了定性定量分析，方法的變異系數(shù)為0. 24%，線性 相關(guān)系數(shù)為〇. 9995,平均回收率為99. 8%。
[0006] 但是在蜂蜜中進(jìn)行雷公藤次堿的檢測(cè)方法還沒有公開報(bào)道過，本發(fā)明固相萃取凈 化-超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法雷公藤次的檢測(cè)方法，為蜂蜜的質(zhì)量 控制提供了檢測(cè)手段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供固相萃取凈化-超高效液相色 譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定蜂蜜中雷公藤次堿的分析方法，本方法快速、靈敏、準(zhǔn) 確，適用于蜂蜜中雷公藤相關(guān)物質(zhì)殘留的定性、定量檢測(cè)。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0009] -種蜂蜜中雷公藤次堿的檢測(cè)方法，該方法包括以下的步驟：
[0010] 1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
[0011] 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取雷公藤次堿標(biāo)準(zhǔn)品IOmg (精確至0. Img)置于IOOmL棕色容量瓶 中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻配制成l〇〇mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；
[0012] 標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確移取ImL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于IOOmL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻 度，配成I. 〇mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；
[0013] 標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)需要移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲醇一水（1:1 ;v/v)稀釋成 0? 01ng/mL、0. 02ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、 20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
[0014] 各種標(biāo)準(zhǔn)溶液避光保存于4°C冰箱中；
[0015] 2)試樣制備
[0016] 對(duì)未結(jié)晶的蜂蜜將其用力攪拌均勻，對(duì)有結(jié)晶析出的蜂蜜可將樣品瓶蓋塞緊后， 置于不超過60°C的水浴中溫?zé)幔龢悠啡咳诨髷嚢?，迅速冷卻至室溫，在融化時(shí)必須防 止水分揮發(fā)；
[0017] 3)提取
[0018] 稱取試樣2. Og,精確至0? Olg,于15mL具蓋離心管中，加入IOmL水，采用超聲、力口 熱或漩渦方式使其溶解，待凈化；
[0019] 4)凈化
[0020] 移取試樣提取液于固相凈化小柱中，使用前依次用5mL甲醇，5mL水活化，棄去流 出液，然后用5mL體積比為1:1的甲醇/水溶液淋洗小柱，棄去流出液，最后用5mL乙腈洗 脫，收集洗脫液于帶刻度離心管中，氮吹濃縮至近干，最后用體積比為1:1的甲醇/水溶液 定容至2mL，混勻后經(jīng)0. 22 y m有機(jī)相濾膜過濾后用于上機(jī)分析；
[0021] 5)色譜條件
[0022] 色譜柱：Hypersil GOLD C18 柱，50mmX 2. lmm, I. 9um ;柱溫：35°C;進(jìn)樣量：2uL ;流 速：0. 25mL/min ;流動(dòng)相：A為水溶液，B為含0. 15%甲酸的甲醇溶液；梯度洗脫程序：0? 2. Omin, 70 % A ;2. 0 ?5. Omin, 70 % A ?5 % A ;5. 0 ?10. Omin, 5 % A ;10. 1 ?14. Omin， 70% A ；
[0023] 6)質(zhì)譜條件
[0024] 掃描方式：正模式掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電噴霧電壓：+3500V ;鞘氣： 30arb ;輔助氣：10arb ;毛細(xì)管溫度：350°C ;蒸發(fā)溫度：30(TC ;碰撞氣：氬氣；SRM監(jiān)測(cè)離子 對(duì)：868. 468/206. 022、868. 468/178. 028 ;S-Lens 電壓：155V ;碰撞電壓：41V:54V ;保留時(shí) 間為 6. 17min。
[0025] 本發(fā)明建立了一種固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)蜂蜜中 雷公藤次堿的分析方法。樣品用水溶解后經(jīng)固相凈化小柱，經(jīng)Hypersil GOLD C18柱 (50mmX2. lmm, I. 9um)分離，電噴霧離子源正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM)模式串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢 測(cè)，外標(biāo)法定量?？疾觳?yōu)化了試樣溶解溶劑、凈化方法、色譜和質(zhì)譜條件等。結(jié)果表明：雷 公藤次堿在0.01ng/mL-20 ng/mL范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.998。該方 法檢出限（S/N>10)為0? 01ng/kg，在0? 01ug/kg、0. 05ug/kg和0? 5ug/kg添加水平的回收率 為76% -96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n = 6)小于10%。本方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，適用于蜂 蜜中雷公藤相關(guān)物質(zhì)殘留的定性、定量檢測(cè)。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 1實(shí)驗(yàn)部分
[0027] I. 1儀器與試劑
[0028] Ultimate 3000超高效液相色譜一TSQ Vantage三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美 國Thermo Scientific公司）；MS 3 digital漩潤混合器（德國IKA公司）；MD 200氮吹儀 (杭州奧盛儀器有限公司）。
[0029] 雷公藤次堿（彡98%)購自南通飛宇生物科技有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均為色 譜純，氯化鈉、無水硫酸鎂均為分析純；HLB固相萃取小柱：500mg，6mL (美國Waters公司）。
[0030] 1. 2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
[0031] 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取雷公藤次堿標(biāo)準(zhǔn)品IOmg (精確至0. Img)置于IOOmL棕色容量瓶 中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻配制成l〇〇mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；
[0032] 標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確移取ImL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于IOOmL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻 度，配成I. 〇mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；
[0033] 標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)需要移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲醇一水（1:1 ;v/v)稀釋成 0? 01ng/mL、0. 02ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、 20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
[0034] 各種標(biāo)準(zhǔn)溶液避光保存于4°C冰箱中。
[0035] 1. 3試樣制備
[0036] 對(duì)未結(jié)晶的蜂蜜將其用力攪拌均勻，對(duì)有結(jié)晶析出的蜂蜜可將樣品瓶蓋塞緊后， 置于不超過60°C的水浴中溫?zé)幔龢悠啡咳诨髷嚢?，迅速冷卻至室溫。在融化時(shí)必須防 止水分揮發(fā)。
[0037] 1. 4 提取
[0038] 稱取試樣2. Og (精確至0. Olg)于15mL具蓋離心管中，加入IOmL水，采用超聲、力口 熱及漩渦等方式使其溶解，待凈化。
[0039] 1. 5 凈化
[0040] 移取試樣提取液于固相凈化小柱（使用前依次用5mL甲醇，5mL水活化）中，棄去 流出液，然后用5mL甲醇/水（1/1 :V/V)溶液淋洗小柱，棄去流出液，最后用5mL乙腈洗脫， 收集洗脫液于帶刻度離心管中，氮吹濃縮至近干，最后用甲醇/水（1/1 :V/V)定容至2mL， 混勻后經(jīng)0. 22 y m有機(jī)相濾膜過濾后用于上機(jī)分析。
[0041] 1.6色譜條件
[0042] 色譜柱：Hypersil GOLD C18 柱（50mmX2. lmm, I. 9um);柱溫：35°C ;進(jìn)樣量：2uL ; 流速：0. 25mL/min。流動(dòng)相：A為水溶液，B為含0. 15%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脫程序： 0 ?2. Omin, 70% A ;2. 0 ?5. Omin, 70% A ?5% A ;5. 0 ?10. Omin，5% A ; 10. 1 ?14. Omin， 70% A0
[0043] 1. 7質(zhì)譜條件
[0044] 掃描方式：正模式掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM);電噴霧電壓（Spray voltage) :+35〇OV ;鞘氣（Sheath gas pressure) :3〇arb ;輔助氣（Auxiliary gas flow) :IOarb ;毛細(xì)管溫度（Capillary Temperature) :350 °C ;蒸發(fā)溫度（Vaporizer Temperature) :300°C ;碰撞氣：気氣（I. 5mtorr)。SRM 監(jiān)測(cè)離子對(duì)：868. 468/206. 022(定 量）、868. 468/178. 028 ;S-Lens 電壓：155V ;碰撞電壓 41V:54V ;保留時(shí)間為 6. 17min。
[0045] 2結(jié)果與討論
[0046] 2. 1前處理?xiàng)l件的優(yōu)化
[0047] 采用各取IOmL水、水-甲醇（9:1，V/V)、水-甲醇（8:2, V/V)、水-甲醇（7:3, V/ V)、水-甲醇（6:4, V/V)、水-甲醇（5:5, V/V)溶解樣品。結(jié)果表明上述溶液均能較好的溶 解試樣，水的比例越高，過固相凈化小柱的阻力越小，同時(shí)考慮環(huán)境因素，因此采用水作為 試樣溶解液。根據(jù)試樣和測(cè)定目標(biāo)物的性質(zhì)，考察了 HLB、PSA、C18、NH4、MAX等5種固相萃 取凈化小柱的凈化效果和回收效率。試驗(yàn)表明：HLB固相萃取凈化小柱對(duì)目標(biāo)物的凈化效 果和回收率達(dá)到滿意結(jié)果。采用5mL甲醇-水（1:1，V/V)混合溶液作為淋洗液，能較好的 除去保留在小柱中的色素。試驗(yàn)比較了甲醇和乙腈洗脫目標(biāo)物的能力，結(jié)果表明乙腈能力 優(yōu)于甲醇。
[0048] 綜上所述，本文采用水溶解試樣后上HLB固相萃取小柱，甲醇-水（1:1，V/V)淋 洗，最后用乙腈洗脫。
[0049] 2. 2色譜條件的優(yōu)化
[0050] 分別考察了甲醇-水、乙腈-水、酸化甲醇-水、酸化乙腈-水等流動(dòng)相對(duì)雷公藤 次堿目標(biāo)分析物的分離效果。結(jié)果表明，以酸化甲醇-水溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，目 標(biāo)物的分離度和峰形較好。
[0051] 2.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化
[0052] 將雷公藤次堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用流動(dòng)注射直接進(jìn)樣，通過全掃描確定化合物母離 子，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到碎片離子，通過優(yōu)化S-Lens、碰撞能量（Collision Energy)等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到二級(jí)質(zhì)譜圖。
[0053] 分別考察電噴霧電離源（ESI)的正離子和負(fù)離子模式和大氣壓力化學(xué)電離源 (APCI)的正離子和負(fù)離子模式四種電離方式，試驗(yàn)表明，目標(biāo)物在電噴霧電離源（ESI)的 正離子模式下最佳。
[0054] 通過多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（SRM)選擇相對(duì)豐度較高的離子對(duì)，確定為定量和定性離子 對(duì)。同時(shí)，優(yōu)化S-Iens電壓、碰撞電壓等參數(shù)。
[0055] 2. 4基質(zhì)效應(yīng)
[0056] 取空白蜂蜜樣品按本文1. 4和1. 5節(jié)進(jìn)行前處理得到的上機(jī)分析液為標(biāo)準(zhǔn)溶液的 稀釋液，以各組分的峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將其斜率與標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn) 曲線的斜率相比，斜率為80% -120%。結(jié)果表明經(jīng)過凈化處理后對(duì)各目標(biāo)測(cè)定物的基質(zhì)效 應(yīng)影響不明顯。
[0057] 2. 5方法的線性范圍和檢出限
[0058] 配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0? 01、0. 02、0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1、2、5、10、 20ng/mL)，并依次進(jìn)樣，分別以雷公藤次堿的峰面積Y為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度值為橫坐 標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，目標(biāo)物在〇.〇1?20ng/mL范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的 線性關(guān)系，線性關(guān)系方程為Y = -166. 356+14146. 4*X，相關(guān)系數(shù)r大于0. 998。以實(shí)際檢 測(cè)時(shí)的信噪比（S/N>10)確定方法檢出限為0.01ug/kg。
[0059] 2.6方法的回收率和精密度
[0060] 在〇? 01ug/kg、0. 05ug/kg和0? 5ug/kg三個(gè)添加水平下進(jìn)行空白加標(biāo)回收率試驗(yàn)， 每個(gè)水平重復(fù)6次，結(jié)果見表1。0. 01ug/kg添加水平時(shí)目標(biāo)物的回收率為76% -92%，RSD 為9% ;0. 05mg/kg添加水平時(shí)目標(biāo)物的回收率為82% -96%，RSD為7% ;0. 5mg/kg添加水 平時(shí)目標(biāo)物的回收率為77% -85%，RSD為5%，均符合殘留檢測(cè)的要求。
[0061] 表1方法的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n = 6)
[0062]

【權(quán)利要求】
1. 一種蜂蜜中雷公藤次堿的檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括以下的步驟： 1) 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取雷公藤次堿標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,精確至0.1 mg,置于100 mL棕色容量瓶 中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液； 標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻 度，配成1. 〇mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液； 標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)需要移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲醇一水，體積比為1:1，稀釋成 0. 01 ng/mL、0. 02 ng/mL、0. 1 ng/mL、0. 2 ng/mL、0. 5 ng/mL、l ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液； 各種標(biāo)準(zhǔn)溶液避光保存于4 °C冰箱中； 2) 試樣制備 對(duì)未結(jié)晶的蜂蜜將其用力攪拌均勻，對(duì)有結(jié)晶析出的蜂蜜可將樣品瓶蓋塞緊后，置于 不超過60°C的水浴中溫?zé)幔龢悠啡咳诨髷嚢?，迅速冷卻至室溫，在融化時(shí)必須防止水 分揮發(fā)； 3) 提取 稱取試樣2.0 g，精確至0.01 g，于15 mL具蓋離心管中，加入10 mL水，采用震蕩、超 聲、加熱或漩渦方式使其溶解，待凈化； 4) 凈化 移取試樣提取液于固相凈化小柱中，使用前依次用5 mL甲醇，5 mL水活化，棄去流出 液，然后用5 mL體積比為1:1的甲醇/水溶液淋洗小柱，棄去流出液，最后用5 mL乙腈洗 脫，收集洗脫液于帶刻度離心管中，氮吹濃縮至近干，最后用體積比為1:1的甲醇/水溶液 定容至2 mL，混勻后經(jīng)0. 22Mm有機(jī)相濾膜過濾后用于上機(jī)分析； 5) 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C18 柱，50_X2. lmm, 1. 9um ;柱溫：35°C ;進(jìn)樣量：2uL ;流速： 0. 25 mL/min ;流動(dòng)相：A為水溶液，B為含0. 15%甲酸的甲醇溶液；梯度洗脫程序：0? 2. Omin，70%A ;2. 0 ?5. 0 min，70%A ?5%A ;5. 0 ?10. 0 min，5% A ;10. 1 ?14. Omin，70%A ; 6) 質(zhì)譜條件 掃描方式：正模式掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電噴霧電壓：+3500 V;鞘氣：30 arb; 輔助氣：10 arb ;毛細(xì)管溫度：350°C ;蒸發(fā)溫度：30(TC ;碰撞氣：氬氣；SRM監(jiān)測(cè)離子對(duì)： 868. 468/206. 022、868. 468/178. 028 ;S-Lens 電壓：155 V ;碰撞電壓：41V:54V;保留時(shí)間為 6. 17 min〇
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104407081SQ201410402202
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】雷美康, 彭芳, 吳曉勤, 祝子銅, 徐佳文 申請(qǐng)人:衢州出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心