一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分指紋圖譜的檢測(cè)方法，包括主要步驟為：供試品溶液及對(duì)照品溶液的制備、測(cè)定，并獲得供試品溶液和對(duì)照品溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較后，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間，確定供試品溶液中2種吲哚類生物堿成分，根據(jù)色譜峰面積，采用外標(biāo)法確定供試品溶液中2種吲哚類生物堿成分的含量。本發(fā)明可以對(duì)蟾酥中2種主要的吲哚類生物堿成分同時(shí)進(jìn)行有效的定性和定量分析，方法簡(jiǎn)便、可行、準(zhǔn)確，測(cè)定方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，能夠有效地控制蟾酥質(zhì)量，并為蟾酥的臨床用藥提供參考。
【專利說明】一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥成分分析檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2010版《中國(guó)藥典(一部)》收載蟾酥作為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍Bufo bufogar gar i z an s Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液經(jīng)加工干燥后制得的藥材。其性狀呈扁圓形團(tuán)塊狀或片狀，團(tuán)塊狀者質(zhì)堅(jiān)，不易折斷，斷面呈棕褐色，角質(zhì)狀，微有光澤；片狀者質(zhì)脆，易碎，斷面紅棕色，半透明。蟾酥味初甜而后有持久的麻辣感，粉末嗅之作嚏。具有解毒，止痛，開竅醒神的功效，主治癰疽疔瘡，咽喉腫痛，中暑神昏，腹痛吐瀉等疾病，具有非常良好的療效。
[0003]蟾酥中化學(xué)成分復(fù)雜，主要成分有蟾蜍留二烯類、強(qiáng)心留烯蟾毒類、吲哚堿類、甾醇類以及腎上腺素、多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸和有機(jī)酸等。其中，吲哚堿類成分，也稱為吲哚類生物堿成分，是蟾酥中非常重要的一類化學(xué)成分，具有非常好的提高機(jī)體免疫力，并具有一定的抗腫瘤能力。目前，蟾酥中所含的吲哚堿類成分主要有5-羥色胺和5-羥色胺衍生物，其中5-羥色胺和蟾毒色胺作為蟾酥中所含的吲哚類生物堿中兩種重要組成成分，非常需要進(jìn)行定性定量分析。
[0004]目前，對(duì)于蟾酥中吲哚類生物堿成分，《中國(guó)藥典》僅通過對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色法進(jìn)行鑒別，現(xiàn)有技術(shù)未收載同時(shí)檢測(cè)5-羥色胺和蟾毒色胺的定量方法及其相關(guān)條件。因此，有必要采用優(yōu)化的前處理及檢測(cè)條件，建立蟾酥中吲哚類生物堿成分:5_羥色胺和蟾毒色胺的的測(cè)定方法，此方法彌補(bǔ)了生物堿類成分依靠顯色反應(yīng)鑒別的專屬性不足的缺點(diǎn)，可更全面、有效的控制蟾酥的質(zhì)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法，采用優(yōu)化條件的前處理和檢測(cè)方法對(duì)2種吲哚類生物堿成分:5_羥色胺和蟾毒色胺的同時(shí)進(jìn)行定性定量分析，進(jìn)而反映蟾酥藥材的內(nèi)在質(zhì)量，為蟾酥藥材判斷真?zhèn)?、評(píng)價(jià)優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性提供依據(jù)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0007]較佳的，所述蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分為5-羥色胺和蟾毒色胺。
[0008]I)供試品溶液的制備:將蟾酥細(xì)粉加入乙醇水溶液，超聲提取后，冷卻、搖勻；離心，吸取上清液加熱蒸干，加入溶劑溶解并定容，過濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0009]較佳的，所述乙醇水溶液為50%乙醇水溶液。具體的，所述50%乙醇水溶液為體積百分?jǐn)?shù)為50%的乙醇。
[0010]進(jìn)一步的，加入的50%乙醇水溶液為蟾酥細(xì)粉的100-800倍量。優(yōu)選的，所述加入的50%乙醇水溶液為蟾酥細(xì)粉的200倍量。
[0011]具體的，所述加入的50%乙醇水溶液為蟾酥細(xì)粉的100-800倍量是指，每0.1g的蟾酥細(xì)粉中加入50%乙醇水溶液1-SOml。優(yōu)選的，當(dāng)所述蟾酥細(xì)粉的重量為0.1g時(shí)，所述50%乙醇水溶液的加入量為20ml。
[0012]較佳的，所述蟾酥細(xì)粉加入乙醇水溶液后，需精密稱重。
[0013]較佳的，所述超聲提取、冷卻后，需再稱重，并用50%乙醇水溶液補(bǔ)足失重。
[0014]較佳的，所述超聲提取時(shí)間為20-60min。優(yōu)選的，所述超聲提取時(shí)間為20min。
[0015]較佳的,所述離心時(shí)間為20min ;所述離心轉(zhuǎn)速為4000rpm。
[0016]較佳的，所述吸取上清液加熱蒸干是指:將精密吸取的一定體積的上清液置于蒸發(fā)皿中，放入恒溫水浴中加熱、蒸至近干。進(jìn)一步的，所述吸取上清液的體積為3ml。
[0017]較佳的，所述溶解并定容時(shí)使用的溶劑為20%乙醇水溶液。具體的，所述20%乙醇水溶液為體積百分?jǐn)?shù)為20%的乙醇。進(jìn)一步的，所述加入20%乙醇水溶液的定容體積為1ml0
[0018]較佳的，所述濾膜為0.45 μ m濾膜。
[0019]所述續(xù)濾液是指:過濾膜時(shí)，初濾液后的溶液即為續(xù)濾液。 [0020]2)對(duì)照品溶液的制備:將5-羥色胺和蟾毒色胺對(duì)照品加入溶劑溶解并定容，搖勻，得到混合對(duì)照品溶液；
[0021]較佳的，所述對(duì)照品溶液中5-羥色胺的CAS號(hào)為50-67-9 ;蟾毒色胺的CAS號(hào)為487-93-4。
[0022]較佳的，所述對(duì)照品溶液中各成分的含量范圍為:5_羥色胺120.0-1800.(^8/ml、蟾毒色胺 14.4-216.0 μ g/ml。
[0023]優(yōu)選的，所述對(duì)照品溶液中各成分的含量范圍為:5_羥色胺120.0 μ g/ml、蟾毒色胺 14.4 μ g/ml ο
[0024]較佳的，所述溶解并定容時(shí)使用的溶劑為20%乙醇水溶液。具體的，所述20%乙醇水溶液為體積百分?jǐn)?shù)為20%的乙醇。
[0025]3)定性檢測(cè):采用高效液相色譜法分別測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液，將獲得的供試品溶液的液相色譜圖，與對(duì)照品溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間，確定供試品溶液中2種吲哚類生物堿成分；
[0026]4)定量檢測(cè):采用高效液相色譜法分別測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液，根據(jù)色譜峰面積，采用外標(biāo)法確定供試品溶液中2種吲哚類生物堿成分的含量。
[0027]較佳的,所述高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱:Alltima C18(250mmX4.6mm,5 μ m)色譜柱；柱溫:25-35 °C，優(yōu)選25 V ;檢測(cè)波長(zhǎng):275nm ;流速:0.7-0.8ml/min,優(yōu)選0.7ml/min ;進(jìn)樣量:10 μ I ;流動(dòng)相:乙腈_0.5%磷酸二氫鉀緩沖溶液(磷酸調(diào)緩沖溶液pH至3.2)，其中，A相為乙腈，B相為0.5%磷酸二氫鉀緩沖溶液；分析時(shí)間:25min;等度洗脫。
[0028]進(jìn)一步的，所述等度洗脫在0_25min，以流動(dòng)相A相:B相體積比為5:95進(jìn)行洗脫。
[0029]進(jìn)一步的，所述0.5%磷酸二氫鉀緩沖溶液為重量百分?jǐn)?shù)為0.5%的磷酸二氫鉀緩沖水溶液。
[0030]較佳的，所述外標(biāo)法是指:分別移取一系列不同體積的步驟B)所述混合對(duì)照品溶液，采用高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，獲得混合對(duì)照品溶液中吲哚類生物堿2種主要活性成分含量與峰面積的線性關(guān)系，以每一種活性成分色譜峰面積對(duì)應(yīng)其相應(yīng)的含量，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算得到各標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程。再將供試品溶液采用高效液相色譜儀檢測(cè)，將獲得的供試品溶液中2種吲哚類生物堿成分的色譜峰面積，分別代入所述各標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程中，可得到相應(yīng)吲哚類生物堿成分的含量。
[0031]優(yōu)選的，所述混合對(duì)照品溶液的移取體積為1μ 1、2μ 1、4μ 1、8μ 1、10μ 1、15μ I。
[0032]如上所述，本發(fā)明的一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法，針對(duì)吲哚類生物堿極性較大，在一般色譜柱上幾乎無保留且分離度差的特點(diǎn)，經(jīng)過對(duì)色譜柱篩選以及流動(dòng)相系統(tǒng)、樣品制備、分析等條件的優(yōu)化考察，采用優(yōu)化反應(yīng)條件的前處理和高效液相分析方法建立了蟾酥中2種吲哚類生物堿成分的同時(shí)、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的定量定性檢測(cè)方法。其中，本發(fā)明采用流動(dòng)相:乙腈一0.5%磷酸二氫鉀緩沖溶液(磷酸調(diào)緩沖溶液pH至3.2)，無需復(fù)雜的梯度洗脫程序，在簡(jiǎn)單的等度洗脫條件下就能使被分離化合物保持較好的分離度和峰形，進(jìn)行同步測(cè)定。本發(fā)明通過對(duì)吲哚類生物堿2種成分的定量分析，定量分析結(jié)果中2種成分的回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.9997，回收率均大于99%，RSD均小于2.0%,測(cè)定方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。本發(fā)明的定性定量分析方法同步、簡(jiǎn)便、可行、準(zhǔn)確，能夠有效地控制蟾酥質(zhì)量，并為蟾酥的臨床用藥提供參考。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1顯示為本發(fā)明的不同提取方法比較液相色譜圖1A、1B、1C
[0034]圖2顯示為本發(fā)明的不同緩沖鹽濃度比較液相色譜圖2A、2B、2C [0035]圖3顯示為本發(fā)明的不同緩沖液pH值比較液相色譜圖3A、3B、3C
[0036]圖4顯示為本發(fā)明的不同色譜柱比較液相色譜圖4A、4B、4C
[0037]圖5顯示為本發(fā)明的不同流速、柱溫比較液相色譜圖5A、5B、5C
[0038]圖6顯示為本發(fā)明的吲哚類生物堿中2種成分的對(duì)照品液相色譜圖，其中，1:5-羥色胺、I1:蟾毒色胺
[0039]圖7顯示為本發(fā)明的吲哚類生物堿中2種成分的混合樣品液相色譜圖，其中，1:5-羥色胺、I1:蟾毒色胺
[0040]圖8顯示為本發(fā)明的吲哚類生物堿中5-羥色胺的回歸方程和線性范圍示意圖
[0041]圖9顯示為本發(fā)明的吲哚類生物堿中蟾毒色胺的回歸方程和線性范圍示意圖
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0043]以下實(shí)施例使用的材料、試劑和儀器如下:
[0044]1、材料、試劑
[0045]蟾酥(上海華宇藥業(yè)有限公司);乙醇(分析純，上海豪申化學(xué)試劑有限公司);磷酸(色譜級(jí)，TEDIA公司)；磷酸二氫鉀(優(yōu)級(jí)純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，TEDIA公司)；5_羥色胺、蟾毒色胺(HPLC純度≥98%、批號(hào)20130630，上?？死锟松镝t(yī)藥科技有限公司)；
[0046]2、儀器[0047]具塞錐形瓶、移液管及其相關(guān)玻璃器皿(上海禾汽玻璃有限公司)；50ml圓底蒸發(fā)皿(上海喜泊達(dá)玻璃儀器有限公司)；HSS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；濾膜(0.45 μ m，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；TDL-40型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；色譜柱:Nucleosil C18(德國(guó)MACHEREY — NAGEL公司)、AllitmaC18 (25OmmX 4.6mm, 5 μ m)(美國(guó) GRACE 公司)、Waters Symmetry C18 (美國(guó)沃特世科技有限公司);SB-5200超聲萃取儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);Agilentl260液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)。
[0048]實(shí)施例1蟾酥藥材中2種吲哚類生物堿成分的測(cè)定
[0049]I實(shí)驗(yàn)部分
[0050]1.1樣品前處理
[0051]供試品溶液的制備:精密稱定0.1g的蟾酥細(xì)粉，精密加入50%乙醇水溶液，稱定重量，超聲提取，冷卻后，再稱定重量，用50%乙醇水溶液補(bǔ)足失重，搖勻。采用離心機(jī)離心，離心時(shí)間為20min、離心轉(zhuǎn)速為4000rpm。再精密吸取3ml的上清液置于蒸發(fā)皿中加熱、蒸至近干。加入20%乙醇水溶液溶解并定容至10ml，過0.45 μ m濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
[0052]對(duì)照品溶液的制備:分別精密稱取5-羥色胺和蟾毒色胺對(duì)照品適量，加20%乙醇水溶液溶解并定容，搖勻，得到混合對(duì)照品溶液；其中，各成分的含量范圍為:5_羥色胺120.0-1800.0 μ g/ml、蟾毒色胺 14.4-216.0 μ g/ml。
[0053]1.2色譜條件
[0054]高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱:Alltima C18 (250mmX 4.6mm, 5 μ m)色譜柱；柱溫:25-35°C，優(yōu)選 25V ;檢測(cè)波長(zhǎng):275nm ;流速:0.7-0.8ml/min，優(yōu)選 0.7ml/min ;進(jìn)樣量:10μ I ;流動(dòng)相:乙腈-0.5%磷酸二氫鉀緩沖溶液(磷酸調(diào)緩沖溶液pH至3.2)，其中，A相為乙腈，B相為0.5%磷酸二氫鉀緩沖溶液；分析時(shí)間:25min ;等度洗脫。
[0055]等度洗脫在0-25min，以流動(dòng)相A相:B相體積比為5:95進(jìn)行洗脫。
[0056]1.3 測(cè)定
[0057]采用外標(biāo)法,分別吸取體積為1μ 1、2μ 1、4μ 1、8μ 1、10 μ 1、15 μ I的混合對(duì)照品溶液，采用高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再吸取體積為10μ I的供試品溶液，采用高效液相色譜儀進(jìn)樣分析。將獲得的供試品溶液的液相色譜圖，與對(duì)照品溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間，確定供試品溶液中2種吲哚類生物堿成分；根據(jù)色譜峰面積，計(jì)算獲得供試品溶液中2種吲哚類生物堿成分的含量。
[0058]2結(jié)果與討論
[0059]2.1前處理?xiàng)l件的優(yōu)化
[0060]2.1.1提取方法的選擇
[0061]分別比較了熱回流、超聲和冷浸提取法，其中，采用熱回流提取方法提取I小時(shí)；采用超聲提取方法超聲20min ;采用冷浸提取法冷浸過夜提取。蟾酥藥材在不同提取方法下采用相同的HPLC檢測(cè)條件測(cè)定結(jié)果見圖1、表I。
[0062]表I三種提取方法對(duì)2種成分的色譜峰面積的影響結(jié)果
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法，包括以下步驟: 1)供試品溶液的制備:將蟾酥細(xì)粉加入乙醇水溶液，超聲提取后，冷卻、搖勻；離心，吸取上清液加熱蒸干，加入溶劑溶解并定容，過濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液； 2)對(duì)照品溶液的制備:將5-羥色胺和蟾毒色胺對(duì)照品加入溶劑溶解并定容，搖勻，得到混合對(duì)照品溶液； 3)定性檢測(cè):采用高效液相色譜法分別測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液，將獲得的供試品溶液的液相色譜圖，與對(duì)照品溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間，確定供試品溶液中2種吲哚類生物堿成分； 4)定量檢測(cè):采用高效液相色譜法分別測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液，根據(jù)色譜峰面積，采用外標(biāo)法確定供試品溶液中2種吲哚類生物堿成分的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟I)中，所述加入的乙醇水溶液為50%乙醇水溶液，為蟾酥細(xì)粉的100-800倍量；所述超聲提取時(shí)間為20-60min。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟I)中，所述加入的50%乙醇為蟾酥細(xì)粉的200倍量；所述超聲提取時(shí)間為20mino
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟I)中，所述離心時(shí)間為20min ;所述離心轉(zhuǎn)速為4000rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟I)中，所述蟾酥細(xì)粉加入乙醇水溶液后，需精密稱重；所述超聲提取、冷卻后，需再稱重，并用50%乙醇水溶液補(bǔ)足失重。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟2)中，所述對(duì)照品溶液中各成分的含量范圍為:5_羥色胺120.0-1800.0yg/ml、蟾毒色胺 14.4-216.0 μ g/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟I)或2)中，所述溶解并定容時(shí)使用的溶劑為20%乙醇水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法，其特征在于，所述高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱=Alltima C18色譜柱；柱溫:25_35°C ;檢測(cè)波長(zhǎng):275nm;流速:0.7-0.8ml/min ;進(jìn)樣量:10μ I ;流動(dòng)相:乙腈-0.5 %磷酸二氫鉀緩沖溶液、磷酸調(diào)緩沖溶液PH至3.2，其中，A相為乙腈，B相為0.5%磷酸二氫鉀水溶液；分析時(shí)間:25min ;等度洗脫。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種蟾酥藥材中吲哚類生物堿成分的檢測(cè)方法，其特征在于，所述等度洗脫在0-25min，以流動(dòng)相A相:B相體積比為5:95進(jìn)行洗脫。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104034823SQ201410307184
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】顧佳敏, 姜鵬, 陳忠樑, 詹常森, 向陽, 朱佳嫻, 許雯雯 申請(qǐng)人:上海和黃藥業(yè)有限公司, 菏澤和黃生物資源技術(shù)有限公司