一種脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法，屬于藥品技術(shù)領(lǐng)域。其制備方法為：中藥蟾酥粉碎，乙醇加熱提取，提取液減壓干燥，得提取物，提取物水中分散，加入乙酸乙酯萃取，收集上部萃取液，減壓干燥得萃取物，運(yùn)用硅膠柱色譜技術(shù)，可以獲得脂蟾毒配基和華蟾酥毒基高純度混合物，也可以獲得兩者單體，單體純度均大于98％。本發(fā)明可以同時分離提取脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體，可以提高治療的精確性，對不良反應(yīng)的成分源及時定位，本方法生成的單體純度高，無有機(jī)溶劑殘留，操作簡便，能耗低，產(chǎn)品質(zhì)量易于控制，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】
一種脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種華蟾酥毒基和脂蟾毒配基單體的分離方法，屬于藥品技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蟾醉(Venenumbufonis)是蟾餘科動物中華大蟾餘(Bufobufo gargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(B.melanostictus Schneider)的耳后腺及皮膚腺分泌的白色楽液干燥而成，最早記錄于《本草衍義》，“有消積殺蟲、溫暖通行之功，能發(fā)散一切風(fēng)火抑郁、大熱癰腫之候，為拔疔散毒之神藥”?，F(xiàn)代中醫(yī)配方中多用此藥，具有解毒、消腫、強(qiáng)心和止痛之效，現(xiàn)代藥理實驗證明，其活性成分具有抗腫瘤、促進(jìn)癌細(xì)胞凋零和防止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等作用，因此被廣泛地應(yīng)用于心腦血管疾病和癌癥治療當(dāng)中。
[0003]蟾酥中的藥用成分主要是華蟾酥毒基和脂蟾毒配基，《中國藥典》也將兩種化合物的總含量列為蟾酥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一。兩種化合物同屬于蟾毒配基類成分，結(jié)構(gòu)相似，無法通過簡單的分離手法將兩者分開，所以目前蟾酥多采用兩種成分混合，以粗提物的形式入藥，包含雜質(zhì)較多，藥理作用不穩(wěn)定，無法廣泛應(yīng)用于注射等西藥治療手段，且一旦發(fā)生不良反應(yīng)，無法及時定位成分源，造成病情延誤，阻礙了蟾酥這一傳統(tǒng)中藥在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用。本發(fā)明運(yùn)用色譜柱分析法將華蟾酥毒基和脂蟾毒配基分開，分別得到兩種單體，流程精簡，可重復(fù)性和可操作性極高，可廣泛應(yīng)用于工廠化生產(chǎn)。
[0004]現(xiàn)有專利CN103191132A公開了一種從蟾酥中提取脂蟾毒配基的方法，該方法中僅用乙醇對樣品進(jìn)行處理，無法將兩種單體華蟾酥毒基和脂蟾毒配基單體同時分離獲取。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]
1、本發(fā)明的目的。
[0006]本發(fā)明為了提高治療的精確性，對不良反應(yīng)的成分源及時定位，而提出了一種華蟾酥毒基和脂蟾毒配基單體的分離方法。
[0007]2、本發(fā)明所采用的技術(shù)方案。
[0008]本發(fā)明是提供一種操作簡單，保留原有有效成份，不含有機(jī)溶劑的華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的制備方法。其具體步驟如下:
(1)取蟾酥樣品粉碎后，乙醇加熱回流提取，過濾液減壓回收乙醇，得粗提物；
(2)將(I)中粗提物在水中分散，形成懸濁液，加入乙酸乙酯，靜置萃取，收集上部萃取液，減壓回收溶劑，得萃取物；
(3)連續(xù)運(yùn)用硅膠柱色譜技術(shù)對萃取物進(jìn)行分離，流動相包括石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲醇各比例混合溶劑，通過TLC薄層層析檢測，得到華蟾酥毒基和脂蟾毒配基單體。
[0009](4)用冷凍干燥器或者真空干燥器除去有機(jī)溶劑殘留。
[0010]更進(jìn)一步的具體實施例中，所述的步驟(3)，連續(xù)兩次使用硅膠柱色譜技術(shù)，在第一次使用，獲得脂蟾毒配基和華蟾酥毒基的高純度混合品，第二次時獲得脂蟾毒配基和華蟾酥毒基的單體。
[0011]更進(jìn)一步的具體實施例中，所述的步驟(I)，乙醇濃度80-95%，體積70-80ml/g。
[0012]更進(jìn)一步的具體實施例中，所述的步驟(I)，加熱溫度80°C，提取時間1.5-2小時，提取次數(shù)3-4次。
[0013]更進(jìn)一步的具體實施例中，所述的步驟(2)中，乙酸乙酯與水體積比3:1-1:1。
[0014]更進(jìn)一步的具體實施例中，所述的步驟(2)中，靜置30分鐘，萃取次數(shù)4-5次。
[0015]更進(jìn)一步的具體實施例中，所述的步驟(2)可以獲得脂蟾毒配基和華蟾酥毒基高純度的混合物。
[0016]更進(jìn)一步的具體實施例中，所述的步驟(3)中，色譜柱硅膠為200-300目。
[0017]更進(jìn)一步的具體實施例中，所述的步驟(3)中，流動相包括:石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和甲醇各比例的混合溶劑。
[0018]更進(jìn)一步的具體實施例中，所述的步驟(4)中，除去有機(jī)溶劑的儀器可以是冷凍干燥器和真空干燥器。
[0019]3、本發(fā)明的有益效果。
[0020](I)本發(fā)明在乙醇處理除去蟾酥中部分大分子蛋白之后，用乙酸乙酯對樣品進(jìn)行再處理，進(jìn)一步除去大極性雜質(zhì)，富集目標(biāo)化合物，同時用色譜柱進(jìn)行預(yù)分離，除去色素，因此得到的脂蟾毒配基和華蟾酥毒基的混合品濃度較高，且可以同時得到兩種單體成分，減少了樣品損耗，精簡了分離工藝，提高了單體得率，其純度均在98%以上。
[0021 ] (2 )脂蟾毒配基和華蟾酥毒基兩種化合物同屬于蟾毒配基類成分，結(jié)構(gòu)相似，傳統(tǒng)兩相系統(tǒng)分離度差，得率低，本發(fā)明采用三相系統(tǒng)(石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯，石油醚-二氯甲烷-甲醇)，通過TLC檢測，分離度高，減少分離過程中樣品吸附。
[0022](3)本發(fā)明中蟾酥樣品，采用《中國藥典》2005版蟾酥質(zhì)量檢測目錄下所述流程，運(yùn)用HPLC進(jìn)行檢測，脂蟾毒配基含量為27%，華蟾酥毒基含量37%，符合國家要求。在本發(fā)明所述流程結(jié)果中，脂蟾毒配基單體獲得量22-26mg/g，華蟾酥毒基單體獲得量31-35mg/g，得率均在80%以上。
[0023](4)本發(fā)明得到脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體，滿足載藥量小的劑型的制劑要求，防止在臨床應(yīng)用中，多種成分之間相互拮抗，從而降低藥效，也為兩種化合物進(jìn)一步生物活性測試，發(fā)掘更多更優(yōu)秀的藥理作用奠定基礎(chǔ)。進(jìn)行整個實驗流程操作簡單，重復(fù)性高，質(zhì)量易于控制，打破了傳統(tǒng)意義上的蟾酥混合物入藥的局限性，同時也可大規(guī)模運(yùn)用于工廠生產(chǎn)。
[0024](5)傳統(tǒng)除去樣品溶劑的方法主要是采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，雖會除去大部分溶劑，但仍然會有殘留，這會影響后續(xù)生物活性測試以及臨床應(yīng)用，所以本發(fā)明在利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分溶劑之后，采用冷凍干燥器和真空干燥器對樣品中的有機(jī)溶劑進(jìn)行處理，消除殘由ο
【具體實施方式】
[0025]實施例1
取蟾穌樣品Ig，加入70倍80%乙醇，800C加熱回流提取3次，每次90分鐘，過濾液減壓濃縮，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入I倍乙酸乙酯進(jìn)行萃取，靜置30分鐘，萃取3次，取上部萃取液，減壓濃縮，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色譜硅膠，流動相二氯甲烷-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(5:1:1)梯度沖洗，得脂蟾毒配基25mg，華蟾酥毒基32mg。
[0026]實施例2
取蟾穌樣品Ig，加入70倍90%乙醇，800C加熱回流提取4次，每次90分鐘，過濾液減壓濃縮，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入2倍乙酸乙酯進(jìn)行萃取，靜置30分鐘，萃取4次，取上部萃取液，減壓濃縮，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色譜硅膠，流動相石油醚-丙酮以及石油醚-二氯甲烷-甲醇(5:2:1)沖洗，得脂蟾毒配基24mg，華蟾酥毒基31mg。
[0027]實施例3
取蟾穌樣品I g，加入70倍95%乙醇，80 °C加熱回流提取3次，每次100分鐘，過濾液減壓濃縮，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入3倍乙酸乙酯進(jìn)行萃取，靜置30分鐘，萃取3次，取上部萃取液，減壓濃縮，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色譜硅膠，流動相石油醚-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-甲醇(6:3:1)沖洗，得脂蟾毒配基26mg，華蟾酥毒基33mg0
[0028]實施例4
取蟾穌樣品I g，加入75倍80%乙醇，80 0C加熱回流提取4次，每次120分鐘，過濾液減壓濃縮，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入3倍乙酸乙酯進(jìn)行萃取，靜置30分鐘，萃取4次，取上部萃取液，減壓濃縮，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色譜硅膠，流動相二氯甲烷-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(3:1:1)沖洗，得脂蟾毒配基23mg，華蟾酥毒基34mg。
[0029]實施例5
取蟾穌樣品I g，加入75倍95%乙醇，80 0C加熱回流提取4次，每次120分鐘，過濾液減壓濃縮，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入I倍乙酸乙酯進(jìn)行萃取，靜置30分鐘，萃取4次，取上部萃取液，減壓濃縮，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色譜硅膠，流動相石油醚-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(4:1:1)沖洗，得脂蟾毒配基25mg，華蟾酥毒基35mg0
[0030]實施例6
取蟾穌樣品Ig，加入75倍90%乙醇，800C加熱回流提取3次，每次90分鐘，過濾液減壓濃縮，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入I倍乙酸乙酯進(jìn)行萃取，靜置30分鐘，萃取3次，取上部萃取液，減壓濃縮，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色譜硅膠，流動相石油醚-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(5:1:1)沖洗，得脂蟾毒配基23mg，華蟾酥毒基34mg。
[0031 ] 實施例7
取蟾穌樣品I g，加入80倍80%乙醇，80 0C加熱回流提取3次，每次100分鐘，過濾液減壓濃縮，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入2倍乙酸乙酯進(jìn)行萃取，靜置30分鐘，萃取4次，取上部萃取液，減壓濃縮，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色譜硅膠，流動相石油醚-丙酮以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(6:3:2)梯度沖洗，得脂蟾毒配基25mg，華蟾酥毒基33mg0
[0032]實施例8
取蟾穌樣品I g，加入80倍90%乙醇，80 0C加熱回流提取4次，每次100分鐘，過濾液減壓濃縮，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入I倍乙酸乙酯進(jìn)行萃取，靜置30分鐘，萃取4次，取上部萃取液，減壓濃縮，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色譜硅膠，流動相石油醚-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-甲醇(6:1:1)梯度沖洗，得脂蟾毒配基22mg，華蟾酥毒基34mg。
[0033]實施例9
取蟾穌樣品I g，加入80倍95%乙醇，80 0C加熱回流提取4次，每次120分鐘，過濾液減壓濃縮，乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入I倍乙酸乙酯進(jìn)行萃取，靜置30分鐘，萃取4次，取上部萃取液，減壓濃縮，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色譜硅膠，流動相石油醚-乙酸乙酯和石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(4:1:1)梯度沖洗，得脂蟾毒配基23mg，華蟾酥毒基33mg。
[0034]結(jié)果與分析
根據(jù)多次試驗結(jié)果分析，本發(fā)明涉及的實驗流程中，提取過程中乙醇最優(yōu)濃度為90-95%，乙酸乙酯萃取體積最佳為I倍，此時脂蟾毒配基和華蟾酥毒基均分布在萃取液中，流動相最佳選擇為石油醚-乙酸乙酯和石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯，此時兩種單體得率最高，分別是均在92%以上。
【主權(quán)項】
1.一種脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法，其特征在于按照如下步驟進(jìn)行: (1)取蟾酥樣品粉碎后，用乙醇加熱回流提取，過濾液減壓回收乙醇，得粗提物； (2)將所述的步驟(I)中粗提物在水中分散，成懸濁液，加入的乙酸乙酯，靜置萃取，收集上部萃取液，減壓回收溶劑，得萃取物； (3)連續(xù)運(yùn)用硅膠柱色譜技術(shù)對萃取物進(jìn)行分離，流動相包含:石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和乙酸乙酯比例混合溶劑，分別得到脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體； (4)除去單體中痕量有機(jī)溶劑殘留。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法，其特征在于:所述的步驟(3)中，連續(xù)兩次使用硅膠柱色譜技術(shù)，在第一次使用，獲得脂蟾毒配基和華蟾酥毒基的高純度混合品，第二次時獲得脂蟾毒配基和華蟾酥毒基的單體。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法，其特征在于:所述的步驟(I)中，乙醇濃度80-95%，體積70-80ml/g。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法，其特征在于:所述的步驟(I)中，加熱溫度80°C，提取時間1.5-2小時，提取次數(shù)3-4次。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法，其特征在于:所述的步驟(2)中，乙酸乙酯與水體積比3:1-1:1。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法，其特征在于:所述的步驟(2)中，靜置30分鐘，萃取次數(shù)4-5次。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法，其特征在于:所述的步驟(2)可以獲得脂蟾毒配基和華蟾酥毒基高純度的混合物。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法，其特征在于:所述的步驟(3)中，色譜柱硅膠為200-300目。9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法，其特征在于:所述的步驟(3)中，流動相包括:石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和甲醇各比例的混合溶劑。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂蟾毒配基和華蟾酥毒基單體的分離方法，其特征在于:所述的步驟(4)中，除去有機(jī)溶劑的儀器可以是冷凍干燥器和真空干燥器。
【文檔編號】C07J71/00GK105859824SQ201610209316
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月6日
【發(fā)明人】楊智鈞, 張友源, 呂愛平, 卞兆祥
【申請人】常熟浸大科技有限公司