一種基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測方法，包括步驟為：將低分子量肝素降解得到完全酶解產(chǎn)物，經(jīng)過離子對反相色譜進行分離，再進行柱后熒光衍生反應(yīng)，隨之進行熒光檢測，分析得到完全酶解產(chǎn)物的組成。通過上述方式，本發(fā)明采用離子對反向色譜與柱后熒光衍生聯(lián)用的方法，既為無紫外吸收的低分子量肝素提供可檢測的熒光基團，又可以實現(xiàn)高靈敏度的熒光檢測，對低分子量肝素仿制藥的研發(fā)、生產(chǎn)控制和保障藥品安全具有極大的實用價值。
【專利說明】一種基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種低分子量肝素完全酶解產(chǎn)物的離子對反相色譜與柱后衍生結(jié)合的檢測方法，屬于藥物、原料藥、原料檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素是一種高度硫酸化的線性糖胺聚糖，廣泛存在于動物器官和組織中，通過與眾多蛋白結(jié)合而在生物活性和生理過程中發(fā)揮著重要作用。肝素具有抗凝、抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌等生物學(xué)功能，并作為一種天然的抗凝血和抗血栓藥物，廣泛應(yīng)用于臨床疾病治療，但在長期使用過程中，會引發(fā)諸如骨質(zhì)疏松、血小板減少等副作用。低分子量肝素是肝素分級或由化學(xué)法、酶法降解而得到的分子量較小的片段，具有與普通肝素相同的二糖組成單元以及與抗凝血活性相關(guān)的五糖序列。低分子量肝素作為近年來國內(nèi)外研究開發(fā)的新型抗血栓藥物，與肝素相比，具有體內(nèi)生物利用度高、半衰期長、副反應(yīng)少、抗血栓作用強、使用方便和安全等優(yōu)點，同時又可減輕或避免肝素的不良作用。
[0003]高效液相色譜是肝素分析的重要手段，具有分離效率高、分析時間短、樣品需要量少、檢測限低等特點。目前上市的三種主要低分子量肝素為依諾肝素鈉、那屈肝素鈣和達肝素鈉，其中的依諾肝素鈉因其特殊的非還原端結(jié)構(gòu)在232nm下有特征性紫外吸收，而另外兩種低分子量肝素既無強紫外吸收，又無熒光基團，故在其色譜檢測前通常需要先進行衍生化，使之具有紫外吸收、熒光特性或其它一些可測定的物理化學(xué)性質(zhì)。
[0004]熒光衍生與液相色譜結(jié)合具有高靈敏度、低檢測限、簡便可靠等特點，在糖類物質(zhì)的研究中應(yīng)用廣泛。在肝素寡糖的分離過程中，由于硫酸基團的存在和寡糖本身不帶有發(fā)色基團，使寡糖的分離和檢測較為困難，需要對其進行衍生使其帶上紫外或熒光基團，不僅可以提高檢測的靈敏度，而且使寡糖帶上的疏水基團能降低寡糖的極性，有利于其在反相色譜柱上分離。高效液相色譜中熒光檢測器的靈敏度要比紫外檢測器高出幾個數(shù)量級，更適合痕量分析。
[0005]柱前熒光衍生是在樣品分離之前進行熒光衍生，再根據(jù)衍生物性質(zhì)進行色譜分離和檢測。此種方法的缺點是操作過程比較繁瑣，容易影響分析的準確性和重復(fù)性，衍生反應(yīng)的副產(chǎn)物可能會對色譜分離造成較大干擾，影響分析結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測方法，該方法操作簡單、重復(fù)性好、分析結(jié)果準確。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是:提供一種基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測方法，步驟為:將低分子量肝素降解得到完全酶解產(chǎn)物；將所述完全酶解產(chǎn)物經(jīng)過離子對反相色譜進行分離，再進行柱后熒光衍生反應(yīng)，最后進行熒光檢測,分析完全酶解產(chǎn)物組成。
[0008]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述降解過程為用肝素酶1、11和III在20?30°C下降解46?50 h，降解產(chǎn)物經(jīng)超濾膜過濾后真空減壓干燥得到完全酶解產(chǎn)物。
[0009]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述離子對反相色譜法的過程為在流速為I?5mL/min下用第一流動相和第二流動相洗脫,在流速為0.1?0.8mL/min下用第三流動相和第四流動相進行柱后熒光衍生反應(yīng)。
[0010]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述第一流動相的配制過程為將烷基銨類試劑和氯化鈉溶于乙腈或甲醇中得到烷基銨類試劑濃度為2?10禮、氯化鈉濃度為0.1?0.5M的第一流動相，所述第一流動相的pH值為5.0?6.5。
[0011]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述第二流動相的配制過程為將烷基銨類試劑和氯化鈉溶于乙腈或甲醇中得到烷基銨類試劑濃度為2?10禮、氯化鈉濃度為0.4?1.5M的第一流動相，所述第二流動相的pH值為5.0?6.5。
[0012]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述第三流動相的配制過程為將2-氰基乙酰胺溶解于去離子水中，得到2-氰基乙酰胺質(zhì)量百分比為1%?5%的第三流動相。
[0013]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述第四流動相的配制過程為將氫氧化鈉溶解于去離子水中，得到氫氧化鈉濃度為0.2?1.0M的第四流動相。
[0014]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述熒光檢測的條件為激發(fā)波長為346nm，發(fā)射波長為 410nm。
[0015]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述分析過程是以8種肝素二糖標準品為對照，對低分子量肝素標準品完全酶解產(chǎn)物和樣品完全酶解產(chǎn)物的色譜峰進行歸屬，以低分子量肝素標準品為參照，比較標準品和樣品之間的異同點，分析樣品完全酶解產(chǎn)物組成，其中 8 種二糖標準品分別為 ΛUA-GIcNAc、ΔUA-GlcNS, ΛUA_GlcNAc6S、ΛUA2S_GlcNAc、ΔUA-GlcNS6S, AUA2S_GlcNS、 ΛUA2S_GlcNAc6S、 ΛUA2S_GlcNS6S。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測方法，采用離子對反向色譜與柱后熒光衍生聯(lián)用的方法，既為無紫外吸收的低分子量肝素提供可檢測的熒光基團，又可以實現(xiàn)高靈敏度的熒光檢測，譜圖中樣品響應(yīng)值更高，具有樣品前處理簡單、重復(fù)性好、分析自動化程度高等優(yōu)點，對低分子量肝素仿制藥的研發(fā)、生產(chǎn)控制和保障藥品安全具有極大的實用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1是本發(fā)明中的8個肝素二糖標準品混合物的熒光檢測圖；
圖2是本發(fā)明中的依諾肝素鈉標準品完全酶解產(chǎn)物的熒光檢測圖；
圖3是本發(fā)明中的依諾肝素鈉樣品完全酶解產(chǎn)物的熒光檢測圖；
圖4是本發(fā)明中的8個肝素二糖標準品混合物、依諾肝素鈉標準品完全酶解產(chǎn)物和依諾肝素鈉樣品完全酶解產(chǎn)物的熒光檢測對比圖；
圖5是本發(fā)明中的達肝素鈉標準品完全酶解產(chǎn)物的熒光檢測圖；
圖6是本發(fā)明中的達肝素鈉樣品完全酶解產(chǎn)物的熒光檢測圖； 圖7是本發(fā)明中的8個肝素二糖標準品混合物、達肝素鈉標準品完全酶解產(chǎn)物和達肝素鈉樣品完全酶解產(chǎn)物的熒光檢測對比圖。
【具體實施方式】
[0018]下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0019]提供一種低分子量肝素完全酶解產(chǎn)物的檢測方法，包括步驟為:
(I)將低分子量肝素鈉用肝素酶1、II和III在25°C下降解48 h，降解產(chǎn)物經(jīng)超濾膜過濾后真空減壓干燥，然后用去離子水配制成lmg/mL的待測溶液。
[0020](2)第一流動相的配制:將四丁基硫酸氫銨、氯化鈉溶解于體積百分比為8%的乙腈溶液中，制得四丁基硫酸氫銨濃度為5mM、氯化鈉濃度為0.1M的第一流動相，并將pH調(diào)至
5.5o
[0021]第二流動相的配制:將四丁基硫酸氫銨、氯化鈉溶解于體積百分比為8%的乙腈溶液中，制得四丁基硫酸氫銨濃度為5mM、氯化鈉濃度為0.5M的第二流動相，并將pH調(diào)至
5.5o
[0022]第三流動相的配制:將2-氰基乙酰胺溶解于去離子水中，制得2-氰基乙酰胺質(zhì)量百分比為2%的第三流動相。
[0023]第四流動相的配制:將氫氧化鈉溶解于去離子水中，制得氫氧化鈉濃度為0.65M的第四流動相。
[0024]反相色譜條件:采用填料粒徑為5 μ m、色譜柱內(nèi)徑為4.6mm、色譜柱長度為250mm的Supelco Discovery C18反相色譜柱；在流速為lmL/min,洗脫梯度為0_30min, 100-20%第一流動相，0_80%第二流動相；30_60 min, 20-0%第一流動相，80-100%第二流動相；在流速為0.lmL/min，用第三流動相和第四流動相對樣品進行柱后熒光衍生反應(yīng)；所述熒光檢測的條件為激發(fā)波長為346nm,發(fā)射波長為410nm。
[0025]系統(tǒng)適用性:二糖標準品各色譜峰的拖尾因子不大于1.5 ;標準品重復(fù)進樣5次，峰面積的相對標準偏差不大于2.0% ;二糖標準品的理論塔板數(shù)應(yīng)不小于3000。
[0026]進樣:8種肝素二糖標準品進樣5次，其中8種二糖標準品分別為AUA-GlcNAc、Δ UA-GlcNS, Λ UA-GlcNAc6S、Λ UA2S_GlcNAc、AUA_GlcNS6S、AUA2S_GlcNS、AUA2S-GlcNAc6S、Δ UA2S-GlcNS6S ;依諾肝素鈉標準品完全酶解產(chǎn)物連續(xù)進樣3次，依諾肝素鈉樣品完全酶解產(chǎn)物進樣3次；達肝素鈉標準品完全酶解產(chǎn)物連續(xù)進樣3次，達肝素鈉樣品完全酶解產(chǎn)物分別進樣3次。
[0027](3 )采用柱后熒光衍生方法，所述柱后衍生反應(yīng)是在色譜系統(tǒng)內(nèi)部進行的，反應(yīng)原理為2-氰基乙酰胺與寡糖的醛基在弱堿環(huán)境下共熱，產(chǎn)生具有強熒光的產(chǎn)物，流經(jīng)帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀，檢測器在激發(fā)波長為346nm、發(fā)射波長為410nm的條件下進行檢測。
[0028]請參閱圖1?7，以8種肝素二糖標準品為對照，對低分子量肝素標準品完全酶解產(chǎn)物以及樣品完全酶解產(chǎn)物的色譜峰進行歸屬，以低分子量肝素標準品完全酶解產(chǎn)物為參照，比較標準品和樣品之間的異同點，分析樣品完全酶解產(chǎn)物組成。
[0029]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測方法，其特征在于，步驟為:將低分子量肝素降解得到完全酶解產(chǎn)物；將所述完全酶解產(chǎn)物經(jīng)過離子對反相色譜進行分離，再進行柱后熒光衍生反應(yīng)，最后進行熒光檢測，分析完全酶解產(chǎn)物組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述降解過程為用肝素酶1、II和III在20?30°C下降解46?50 h，降解產(chǎn)物經(jīng)超濾膜過濾后真空減壓干燥得到完全酶解產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述離子對反相色譜法的過程為在流速為I?5mL/min下用第一流動相和第二流動相洗脫,在流速為0.1?0.8mL/min下用第三流動相和第四流動相進行柱后熒光衍生反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述第一流動相的配制過程為將烷基銨類試劑和氯化鈉溶于乙腈或甲醇中得到烷基銨類試劑濃度為2?10mM、氯化鈉濃度為0.1?0.5M的第一流動相，所述第一流動相的pH值為5.0?6.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述第二流動相的配制過程為將烷基銨類試劑和氯化鈉溶于乙腈或甲醇中得到烷基銨類試劑濃度為2?10mM、氯化鈉濃度為0.4?1.5M的第一流動相，所述第二流動相的pH值為5.0?6.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述第三流動相的配制過程為將2-氰基乙酰胺溶解于去離子水中，得到2-氰基乙酰胺質(zhì)量百分比為1%?5%的第三流動相。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述第四流動相的配制過程為將氫氧化鈉溶解于去離子水中，得到氫氧化鈉濃度為0.2?1.0M的第四流動相。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述熒光檢測的條件為激發(fā)波長為346nm,發(fā)射波長為410nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述分析過程是以8種肝素二糖標準品為對照，對低分子量肝素標準品完全酶解產(chǎn)物和樣品完全酶解產(chǎn)物的色譜峰進行歸屬，以低分子量肝素標準品為參照，比較標準品和樣品之間的異同點，分析樣品完全酶解產(chǎn)物組成，其中8種二糖標準品分別為Λ UA-GIcNAc、Δ UA-GlcNS、Δ UA-G1 cNAc6S、AUA2S-GlcNAc、 ΔUA-GlcNS6S, AUA2S_GlcNS、 ΛUA2S_GlcNAc6S、 ΛUA2S_GlcNS6S。
【文檔編號】G01N30/02GK103852542SQ201410123609
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】白樺 申請人:蘇州英諾凱生物醫(yī)藥科技有限公司