污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌熒光定量pcr檢測方法
【專利摘要】一種污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，屬于污水生物處理【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明可以對污水處理廠中兩個屬的亞硝酸鹽氧化菌，即硝化菌屬和硝化螺菌屬進(jìn)行檢測，不僅可以分析總的亞硝酸鹽氧化菌，而且可以分析各個屬的動態(tài)變化。采用通用性好、成本較低的SYBR?Green熒光染料法建立了亞硝酸鹽氧化菌2個屬的實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。2條標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.997，擴(kuò)增效率在100%到110%之間。利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對某污水處理系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌進(jìn)行監(jiān)控和鑒定。本發(fā)明提供了一種經(jīng)濟(jì)、簡便、可靠的污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法。
【專利說明】污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌熒光定量PCR檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，屬于污水生物處理【技術(shù)領(lǐng)域】，用于對污水生物處理系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌的定量檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]污水生物脫氮技術(shù)由于經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于污水處理領(lǐng)域。傳統(tǒng)污水生物脫氮的原理是指氨氮被氨氧化菌氧化成亞硝態(tài)氮(亞硝化階段)，再由亞硝酸鹽氧化菌氧化成硝態(tài)氮(硝化過程);之后硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮被反硝化成氮?dú)?反硝化過程)，從而實(shí)現(xiàn)污水中氮的去除。對于傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)而言，亞硝酸鹽氧化菌作為硝化過程的主要功能微生物之一，在污水生物處理系統(tǒng)內(nèi)的生物活性和菌群分布的穩(wěn)定性，是保證污水生物脫氮系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵因素。污水生物處理系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氧化菌包括硝化菌屬和硝化螺菌屬，有的污水處理系統(tǒng)中只含有其中的一個屬，而有的污水處理系統(tǒng)中含有兩個屬。為了全面了解系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氧化菌的分布情況，需要分別定量檢測這兩個屬的微生物數(shù)量，二者數(shù)量之和是亞硝酸鹽氧化菌的總量。近年來，在傳統(tǒng)生物脫氮理論的基礎(chǔ)上產(chǎn)生了短程脫氮新理論，即將硝化過程控制在亞硝態(tài)氮，然后直接進(jìn)入反硝化，從而使生化反應(yīng)大大縮短，被稱之為短程硝化反硝化。相比于傳統(tǒng)方法，短程脫氮理論上減少25%硝化需氧量、40%反硝化碳源，更具實(shí)用價值。實(shí)現(xiàn)短程脫氮的關(guān)鍵是將硝化產(chǎn)物控制為亞硝酸鹽，即去除亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽的過程。從微生物學(xué)的觀點(diǎn)來看，就是抑制或淘汰亞硝酸鹽氧化菌。對于短程脫氮技術(shù)而言，準(zhǔn)確監(jiān)測并定量亞硝酸鹽氧化菌的動態(tài)變化是實(shí)現(xiàn)短程脫氮并保證其穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵。分子生物技術(shù)的快速發(fā)展為污水生物處理系統(tǒng)內(nèi)微生物研究提供了新的分析方法和手段。因此，采用分子生物技術(shù)對不同工藝、水質(zhì)條件下的亞硝酸鹽氧化菌菌群結(jié)構(gòu)、活性等進(jìn)行研究分析，能夠?yàn)槲鬯锩摰到y(tǒng)的長期穩(wěn)定運(yùn)行提供有力保障。
[0003]實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)作為一種核酸定量的手段，以其高靈敏性、高特異性、高精確度、實(shí)時性、污染少等優(yōu)點(diǎn)，逐漸應(yīng)用于污水生物處理系統(tǒng)中特定菌群的定量分析。已有的實(shí)時定量PCR技術(shù)應(yīng)用于污水短程生物脫氮的研究，主要是對氨氧化菌的定量。但實(shí)現(xiàn)短程脫氮的關(guān)鍵在于亞硝酸鹽氧化菌是否被抑制或淘汰。對于亞硝酸鹽氧化菌，往往通過亞硝酸鹽積累率達(dá)到較高的水平(>80%)逆推出亞硝酸鹽氧化菌被成功淘洗的結(jié)論。這種逆推顯然不夠嚴(yán)謹(jǐn)，因?yàn)樗鼰o法揭示亞硝酸鹽氧化菌是活性受到抑制還是已被徹底淘洗出系統(tǒng)，這兩種情況將會產(chǎn)生兩種不同的運(yùn)行效果。如果是亞硝酸鹽氧化菌的活性受到抑制，當(dāng)環(huán)境條件的變化有利于生長時亞硝酸鹽氧化菌將恢復(fù)活性，導(dǎo)致短程脫氮運(yùn)行不穩(wěn)定甚至完全破壞。如果是亞硝酸鹽氧化菌已被徹底淘洗出系統(tǒng)，則更加有助于短程脫氮的穩(wěn)定運(yùn)行，短期的環(huán)境條件的變化不會對短程脫氮產(chǎn)生影響。由于缺少對污水處理系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌的檢測，對于不同運(yùn)行條件下系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌的群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化不清楚，進(jìn)而無法準(zhǔn)確闡述短程脫氮的形成機(jī)制。
[0004]本發(fā)明采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對污水處理廠中的亞硝酸鹽氧化菌進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明在技術(shù)上不同于現(xiàn)有技術(shù)，主要體現(xiàn)在以下三方面:
[0005](I)標(biāo)準(zhǔn)品DNA的來源?，F(xiàn)有技術(shù)主要是從純培養(yǎng)或人工配水富集的目標(biāo)菌中提取基因組DNA，或是化學(xué)合成DNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)品。目標(biāo)菌的純培養(yǎng)需要較長的時間、費(fèi)用較高。更難以解決的是亞硝酸鹽氧化菌中的硝化螺菌屬目前還無法實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)。人工配水富集的目標(biāo)菌的菌群單一，無法獲得實(shí)際污水處理系統(tǒng)中亞硝酸鹽氧化菌的所有優(yōu)勢屬的標(biāo)準(zhǔn)品。化學(xué)合成DNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)品首先要通過基因測序知道目標(biāo)基因序列，否則無法合成。而本發(fā)明采用的標(biāo)準(zhǔn)品全部來源于處理實(shí)際生活污水的反應(yīng)器，無需目標(biāo)菌的純培養(yǎng)、人工配水富集目標(biāo)菌和目標(biāo)基因序列。
[0006](2 )定量檢測的環(huán)境樣品及目標(biāo)微生物。①目前，實(shí)時熒光定量PCR主要應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?qū)Σ《?、致病菌的檢測分析。而本發(fā)明的待測樣品為污水處理系統(tǒng)中的活性污泥，樣品本身具有極強(qiáng)的特殊性。由于活性污泥受廢水污染，其中含有大量未知的有機(jī)、無機(jī)污染物、顆粒物、雜質(zhì)等，還有其它與亞硝酸鹽氧化菌共存于活性污泥中的菌膠團(tuán)，對DNA的提取純化干擾較大，并進(jìn)而影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增。因此，活性污泥微生物基因組DNA的提取方法、PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件需要特殊確定，難度較大。②本發(fā)明定量檢測的目標(biāo)微生物是亞硝酸鹽氧化菌，已有研究證實(shí)污水生物處理系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氧化菌包括兩個屬，即硝化菌屬和硝化螺菌屬。由于本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)品來自于實(shí)際污水處理系統(tǒng)，運(yùn)行條件和廢水成分的復(fù)雜性使得亞硝酸鹽氧化菌菌群豐富，獲得兩個主要屬的標(biāo)準(zhǔn)品，因此能夠?qū)ξ鬯幚韽S中亞硝酸鹽氧化菌進(jìn)行全面的定量分析。
[0007](3)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。采用實(shí)時熒光定量PCR方法對環(huán)境樣品的特定菌群密度進(jìn)行定量過程中，樣品預(yù)處理方法和參數(shù)的選擇對于測定結(jié)果有較大的影響。將實(shí)時熒光定量PCR應(yīng)用于污水處理廠主要功能微生物亞硝酸鹽氧化菌的檢測，待測樣品為污水處理系統(tǒng)中的活性污泥。由于亞硝酸鹽氧化菌以污水為生存基質(zhì)，污水中含有大量未知的有機(jī)、無機(jī)污染物、顆粒物、雜質(zhì)等，對DNA的提取純化干擾較大，并進(jìn)而影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增。因此本申請對分析難度較大的亞硝酸鹽氧化菌不同屬的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了探索和優(yōu)化，并獲得了較好的擴(kuò)增效果和定量結(jié)果。
[0008]故本發(fā)明提取實(shí)際生活污水處理系統(tǒng)中活性污泥微生物的基因組DNA，采用硝化菌屬和硝化螺菌屬16S rDNA引物，建立檢測亞硝酸鹽氧化菌兩個屬的實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對污水全程脫氮除磷和短程脫氮除磷系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氧化菌進(jìn)行定量檢測，分析運(yùn)行條件變化過程中亞硝酸鹽氧化菌群落的動態(tài)變化與系統(tǒng)運(yùn)行的相關(guān)性，揭示亞硝酸鹽氧化菌被淘洗的過程和形成短程硝化的機(jī)制，未見相關(guān)研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)濟(jì)、可靠的污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，對污水處理廠中兩個屬的亞硝酸鹽氧化菌，即硝化菌屬和硝化螺菌屬進(jìn)行檢測，不僅可以分析總的亞硝酸鹽氧化菌，而且可以分析各個屬的動態(tài)變化。利用SYBRGreen熒光染料法，無需設(shè)計(jì)多個探針即可檢測多個基因，通用性好、成本低，并且可同時進(jìn)行大批量的樣本分析?？捎糜谖鬯幚韽S亞硝酸鹽氧化菌菌群數(shù)量的監(jiān)控和鑒定，具有很好的應(yīng)用前景。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案:[0011]一種污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:亞硝酸鹽氧化菌包括硝化菌屬和硝化螺菌屬，污水生物處理系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氧化菌包括硝化菌屬和硝化螺菌屬，分別定量檢測這兩個屬的微生物數(shù)量，二者數(shù)量之和是亞硝酸鹽氧化菌的總量；提取實(shí)際生活污水處理系統(tǒng)中活性污泥微生物的基因組DNA ;采用硝化菌屬和硝化螺菌屬16S rDNA弓丨物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，切膠純化回收DNA擴(kuò)增片段，獲得硝化菌屬和硝化螺菌屬的擴(kuò)增片段；將兩個屬的純化回收的DNA擴(kuò)增片段與載體連接，連接好的載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)15-18h，挑取白斑進(jìn)行重組菌落PCR驗(yàn)證；提取包含目的片段的質(zhì)粒用作實(shí)時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，在實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對污水處理廠中亞硝酸鹽氧化菌進(jìn)行定量檢測；
[0012]上述常規(guī)PCR擴(kuò)增體系如下:
【權(quán)利要求】
1.一種污水處理廠亞硝酸鹽氧化菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:污水生物處理系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氧化菌包括硝化菌屬和硝化螺菌屬，分別定量檢測這兩個屬的微生物數(shù)量，二者數(shù)量之和是亞硝酸鹽氧化菌的總量；提取實(shí)際生活污水處理系統(tǒng)中活性污泥微生物的基因組DNA ;采用硝化菌屬和硝化螺菌屬16S rDNA引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增；將兩個屬的純化回收的DNA擴(kuò)增片段與載體連接，連接好的載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)15-18h，挑取白斑進(jìn)行重組菌落PCR驗(yàn)證；提取包含目的片段的質(zhì)粒用作實(shí)時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，在實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對污水處理廠中亞硝酸鹽氧化菌進(jìn)行定量檢測； 上述常規(guī)PCR擴(kuò)增體系如下:

【文檔編號】G01N21/64GK103555831SQ201310480376
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】曾薇, 白鑫龍, 張麗敏, 彭永臻 申請人:北京工業(yè)大學(xué)