一種納米金酶傳感器檢測水中亞硝酸鹽的方法
【專利摘要】一種納米金酶傳感器檢測水中亞硝酸鹽的方法，包括以下步驟：⑴將裸金電極浸入1,6-己二硫醇的乙醇溶液中；⑵再將裸金電極浸入納米金溶液中修飾；⑶將電極浸入辣根過氧化物酶的磷酸鹽緩沖溶液中避光修飾；⑷繪制亞硝酸鹽檢測的標準曲線；⑸檢測，計算出待測溶液中亞硝酸鹽的濃度。本發(fā)明不僅利用納米金粒子對辣根過氧化物酶的強吸附作用，提高了電極上辣根過氧化物酶的負載量，而且納米金粒子能夠活化修飾電極表面，加速修飾電極上電子的轉移，使響應電流增大，拓展線性范圍。采用本發(fā)明的方法，檢測水中亞硝酸鹽，線性范圍寬，水中亞硝酸鹽回收率在96.5％～105％之間。
【專利說明】一種納米金酶傳感器檢測水中亞硝酸鹽的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測水中亞硝酸鹽的方法，尤其是涉及一種納米金酶傳感器檢測 水中亞硝酸鹽的方法。
【背景技術】
[0002] 當攝入的亞硝酸鹽過量時，人體內正常的血紅蛋白在亞硝酸鹽作用下轉化為高鐵 血紅蛋白，失去對氧分子的攜載能力，造成機體內供氧不足，嚴重者會危及生命，當人體亞 硝酸鹽攝入量達到1?3克即可致死。此外，胺類和酰胺類化合物與亞硝酸根反應可生成 致癌性的亞硝胺類物質，人類的食道癌、胃癌、肝癌等均與亞硝胺類物質有關。
[0003] 亞硝酸鹽的測定方法雖多，且各有其優(yōu)點；但各種方法也存在各自缺點：光譜法 所用儀器設備簡單、價廉，實用性和可操作性強，易于在基層單位使用，但其靈敏度相對較 低，檢測下限高；色譜法精確度高，可同時測定多種成分，但所用儀器設備復雜，操作繁瑣； 電化學分析法儀器簡單，操作簡便，分析速度快，但目前存在線性范圍窄，專一性差等問題。
[0004] 王米娜采用構建的辣根過氧化物酶電化學傳感器對水中NaNO2進行檢測，線性范 圍為8.3X10_ 4-L05X10_2mol /L (參見王米娜，劉慧宏.固定化辣根過氧化物酶電化 學測定有機過氧化物和亞硝酸鹽.襄樊學院學報，2009，30(2): 5-9)。馬超越采用納 米二氧化錳殼聚糖復合膜固載辣根過氧化物酶，制備成酶生物傳感器，對水中NaNO2進行 檢測，線性范圍為1.45X10_ 7mol/L-1.45X10_3mol/L (參見馬超越.固定化辣根過氧化 物酶生物傳感器制作及應用研究.河南工業(yè)大學，2011)。鄭冬云等構建了聚溴酚藍修 飾玻碳電極，對水中NaNO 2進行檢測，線性范圍在2. OOXKT8 -1.09 X 10_4mol /L (參見鄭 冬云，劉曉軍，朱珊瑩，等.電化學傳感法測定水中亞硝酸鹽.中國環(huán)境監(jiān)測2014， 30(4) : 140-145)?？梢?，現(xiàn)有方法的線性范圍在2-4個數(shù)量級。
【發(fā)明內容】
[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是，克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種能快速響應，操作簡 單，線性范圍寬，專一性好，靈敏度高的納米金酶傳感器檢測水中亞硝酸鹽的方法。
[0006] 本發(fā)明解決其技術問題采用的技術方案是，一種納米金酶傳感器檢測水中亞硝酸 鹽的方法，包括以下步驟： ⑴將裸金電極浸入1，6-己二硫醇（HDT)的乙醇溶液中10-15小時；1，6-己二硫醇通 過分子自組裝修飾于裸金電極表面；分別用無水乙醇和超純水從側面沖洗掉金電極表面物 理吸附的1，6-己二硫醇； 所述1，6-己二硫醇（HDT)的乙醇溶液中，1，6-己二硫醇濃度優(yōu)選為0. 8 - I. 2 mmol/ L，更優(yōu)選 lmmol/L ; ⑵將經(jīng)步驟（1)修飾上1，6-己二硫醇的裸金電極浸入納米金溶液中，2-6°C避光修飾 10-15小時；用超純水從側面沖洗掉物理吸附的納米金粒子； 所述納米金溶液的濃度優(yōu)選為〇. 1-0. 3mmol/L ; ⑶將經(jīng)步驟（2)納米金修飾的電極浸入辣根過氧化物酶（HRP)的磷酸鹽緩沖溶液 中；2-6°C避光修飾10-15小時；HRP通過靜電吸附作用固定于納米金粒子上，然后將電極 用磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液，濃度為〇· 08 - 0· 12 mol/L (優(yōu)選0· lmol/L)，pH為 6. 8-7. 2,沖洗干凈，得到可用于亞硝酸鹽檢測的辣根過氧化物酶生物傳感器，標記為Au電 極-HDT-納米金-HRP修飾電極； 所述辣根過氧化物酶的磷酸鹽緩沖溶液中，辣根過氧化物酶濃度優(yōu)選為4 一 6 mg/ mL，更優(yōu)選5mg/mL ;所述磷酸鹽緩沖溶液指磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液，濃度優(yōu)選為 0· 08 - 0· 12 mol/L (更優(yōu)選 0· lmol/L)，pH 優(yōu)選為 6. 8-7. 2 ; (4) 以步驟（3)制備的Au電極-HDT-納米金-HRP修飾電極為工作電極，采用循環(huán)伏安 法得到HRP修飾電極在不同濃度亞硝酸鹽溶液中的響應電流，亞硝酸鹽濃度與相應的響應 電流之間的函數(shù)關系即亞硝酸鹽檢測的標準曲線； (5) 以步驟（3)制備的Au電極-HDT-納米金-HRP修飾電極對亞硝酸鹽待測溶液進行檢 測，工作電位選用E= 0. 70-0. 80V，得到的響應電流根據(jù)步驟⑷獲得的標準曲線即可計算出 待測溶液中亞硝酸鹽的濃度。
[0007] 本發(fā)明通過1，6-己二硫醇（HDT)分子自組裝技術將1，6-己二硫醇分子固定于裸 金電極表面，然后通過金硫鍵將納米金粒子固定于1，6-己二硫醇分子上，最后通過靜電吸 附作用將辣根過氧化物酶固定于納米金粒子表面，從而實現(xiàn)辣根過氧化物酶在裸金電極表 面的有效固定。本發(fā)明的生物傳感器靈敏度好、檢測限底、選擇性好，能夠實現(xiàn)對亞硝酸鹽 的快速準確測定。
[0008] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點： 本發(fā)明不僅利用納米金粒子對辣根過氧化物酶的強吸附作用，提高了電極上辣根過氧 化物酶的負載量，而且納米金粒子能夠活化修飾電極表面，加速修飾電極上電子的轉移，使 響應電流增大，從而拓展了線性范圍。采用本發(fā)明的方法，檢測水中亞硝酸鹽，線性范圍寬， 在9.06父1〇- 8!11〇1/1?3.98\1〇-3111〇1/1，達5個數(shù)量級，水中亞硝酸鹽回收率在96.5%? 105 %之間。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009] 圖1表示不同修飾電極在5mmol/L亞硝酸鹽-磷酸鹽緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖， 曲線a、b、c、d分別表示Au電極、Au電極-HDT修飾電極、Au電極-HDT-納米修飾電極、Au 電極-HDT-金納米-HRP修飾電極在亞硝酸鹽濃度為5mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中的循環(huán) 伏安圖； 圖2表示亞硝酸鹽的濃度在9. 06 X 10_8-3. 98 X 10_3mol/L范圍內時，亞硝酸鹽在Au電 極-HDT-納米金-HRP修飾電極上的響應電流和亞硝酸鹽濃度的線性關系圖。
【具體實施方式】
[0010] 以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0011] 實施例1 本實施例包括以下步驟： ⑴將裸金電極浸入濃度為lmmol/L的1，6-己二硫醇（HDT)的乙醇溶液中12小時，再 分別用無水乙醇和超純水從側面沖洗掉金電極表面物理吸附的HDT ; ⑵將經(jīng)步驟（1)修飾上HDT的裸金電極浸入制備好的納米金溶液（所述納米金溶液 的濃度為〇. 25mmol/L)中，于4°C避光條件下修飾12小時，然后再用超純水從側面沖洗掉物 理吸附的納米金粒子； ⑶將經(jīng)步驟（2)納米金修飾的電極浸入5mg/mL的HRP磷酸鹽緩沖溶液(磷酸氫二 鉀-磷酸二氫鉀，濃度為〇. I mol/L，pH為7)中，4°C條件下避光修飾12小時，然后將電極 用緩沖溶液(磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀，〇. lmol/L，pH為7)沖洗干凈，得可用于亞硝酸鹽檢 測的辣根過氧化物酶生物傳感器； (4)通過循環(huán)伏安法檢測5mmol/L亞硝酸鹽在裸金電極、Au電極-HDT修飾電極、Au電 極-HDT-納米修飾電極、Au電極-HDT-納米金-HRP修飾電極上電化學行為的差異，亞硝酸 鹽濃度為5mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7)組成：亞硝酸鹽濃度5mmol/L，磷酸氫二鉀-磷 酸二氫鉀濃度〇· lmol/L，KCl濃度0· lmol/L，循環(huán)伏安法參數(shù)設置：電勢掃描范圍0?8V， 掃描速度〇. lV/s (結果如圖1所示)。圖1表示不同修飾電極在5mmol/L亞硝酸鹽-磷酸 鹽緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖，曲線a、b、c、d分別表示Au電極、Au電極-HDT修飾電極、Au 電極-HDT-納米修飾電極、Au電極-HDT-納米金-HRP修飾電極在亞硝酸鹽濃度為5mmol/ L的磷酸鹽緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖。由圖1分析發(fā)現(xiàn)當Au電極、Au電極-HDT修飾電極、 Au電極-HDT-金納米納米金修飾電極、Au電極-HDT-納米金-HRP修飾電極在亞硝酸鹽溶 液中進行循環(huán)伏安掃描時，亞硝酸鹽在各支電極表面均產生氧化峰電流并且無還原峰電流 出現(xiàn)，說明亞硝酸鹽在各電極表面均發(fā)生不可逆氧化反應。Au電極-HDT-納米金-HRP修 飾電極表面的氧化峰電流最大，裸金電極氧化峰電流次之，Au電極-HDT修飾電極和Au電 極-HDT-納米金修飾電極氧化峰電流最小。
[0012] 以上分析結果證明，引入的金納米粒子不僅在一定程度上增大了亞硝酸鹽發(fā)生氧 化反應的比表面積和電子傳遞比表面積而且有效地保護了 HRP對亞硝酸鹽的催化活性。因 此在金納米粒子和HRP的協(xié)同作用下Au電極-HDT-金納米-HRP修飾電極表現(xiàn)出對亞硝酸 鹽良好的電化學催化活性，從而使得亞硝酸鹽在Au電極-HDT-納米金-HRP修飾電極表面 氧化峰電流最大，并且由于HRP的高效固定使得Au電極-HDT-納米金-HRP修飾電極比裸 金電極在亞硝酸鹽檢測中擁有更好的靈敏度和選擇性。
[0013] 4.以Au電極-HDT-納米金-HRP修飾電極為工作電極，采用電流-時間曲線 法分別得到HRP修飾電極在不同濃度亞硝酸鹽溶液中的響應電流。分析和研究當亞硝 酸鹽濃度分別為 9. 06Xl(T8mol/L、2· 09Xl(T7mol/L、5· 96Xl(T6mol/L、9· 06Xl(T6mol/L、 3. 98Xl(T5mol/L、7· 94Xl(T5mol/L、2.09Xl(T4mol/L、5· 96Xl(T4mol/L、9· 06Xl(T4mol/L、 2. 09X 10_3mol/L、3. 98X 10_3mol/L時與相應的響應電流之間的函數(shù)關系并據(jù)此得到亞硝 酸鹽檢測的標準曲線和線性范圍；根據(jù)最低檢測下限（LOD) = 3〇/k (〇表示空白標準 偏差，k表示標準曲線的斜率)，計算本方法的檢出限(如圖2所示)。圖2表示在最優(yōu)實驗 條件下(工作電位0· 76V，pH=7)，當亞硝酸鹽的濃度在9· 06X l(T8mol/L?3· 98X l(T3mol/ L范圍內時，亞硝酸鹽在Au電極-HDT-納米金-HRP修飾電極上的響應電流和亞硝酸鹽濃 度滿足線性關系：Ι/μΑ = -0.0424 - 2.7791C /mmol/L [N02-]，R2=0.9996,檢測下限為 6.57Xl(T8mol/L (根據(jù) LOD= 3〇/k)。
[0014] 5.工作電位選用E= 0. 76V，根據(jù)需要將不同質量的亞硝酸鹽分別直接加入礦 泉水(不含亞硝酸鹽）中，配制成不同濃度的亞硝酸鹽-磷酸鹽緩沖溶液。然后再用Au電 極-HDT-納米金-HRP修飾電極對亞硝酸鹽待測樣品溶液進行檢測，分析得到的電流-時間 曲線，通過相關實驗數(shù)據(jù)計算樣品中的亞硝酸鹽濃度和樣品的加標回收率，所得結果列于 表1中。
[0015] 表1為礦泉水樣品中亞硝酸鹽的回收率檢測，測得回收率在96. 5%?105%之間， 證明HRP修飾電極選擇性較好，很好克服了礦泉水中相關離子的干擾。
[0016]
【權利要求】
1. 一種納米金酶傳感器檢測水中亞硝酸鹽的方法，其特征在于，包括以下步驟： ⑴將裸金電極浸入1，6-己二硫醇的乙醇溶液中10-15小時；分別用無水乙醇和超純 水從側面沖洗掉金電極表面物理吸附的1，6-己二硫醇； ⑵將經(jīng)步驟（1)修飾上1，6-己二硫醇的裸金電極浸入納米金溶液中，2-6°C避光修飾 10-15小時；用超純水從側面沖洗掉物理吸附的納米金粒子； ⑶將經(jīng)步驟（2)納米金修飾的電極浸入辣根過氧化物酶的磷酸鹽緩沖溶液中；2-6°C 避光修飾10-15小時；HRP通過靜電吸附作用固定于納米金粒子上，然后將電極用濃度為 0. 08 - 0. 12 mol/L，pH為6. 8-7. 2的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖溶液沖洗干凈，得到可 用于亞硝酸鹽檢測的辣根過氧化物酶生物傳感器,標記為Au電極-HDT-納米金-HRP修飾 電極； (4) 以步驟（3)制備的Au電極-HDT-納米金-HRP修飾電極為工作電極，采用循環(huán)伏安 法得到HRP修飾電極在不同濃度亞硝酸鹽溶液中的響應電流，亞硝酸鹽濃度與相應的響應 電流之間的函數(shù)關系即亞硝酸鹽檢測的標準曲線； (5) 以步驟（3)制備的Au電極-HDT-納米金-HRP修飾電極對亞硝酸鹽待測溶液進行檢 測，工作電位選用E= 0. 70-0. 80V，得到的響應電流根據(jù)步驟⑷獲得的標準曲線即可計算出 待測溶液中亞硝酸鹽的濃度。
2. 根據(jù)權利要求1所述的納米金酶傳感器檢測水中亞硝酸鹽的方法，其特征在于，步 驟（1)中，所述1，6-己二硫醇的乙醇溶液中，1，6-己二硫醇濃度為0. 8 - 1. 2 mmol/L。
3. 根據(jù)權利要求2所述的納米金酶傳感器檢測水中亞硝酸鹽的方法，其特征在于，所 述1，6-己二硫醇的乙醇溶液中，1，6-己二硫醇濃度為lmmol/L。
4. 根據(jù)權利要求1或2所述的納米金酶傳感器檢測水中亞硝酸鹽的方法，其特征在于， 步驟（2)中，所述納米金溶液的濃度為0. 1-0. 3mmol/L。
5. 根據(jù)權利要求1或2所述的納米金酶傳感器檢測水中亞硝酸鹽的方法，其特征在于， 步驟（3)中，所述辣根過氧化物酶的磷酸鹽緩沖溶液中，辣根過氧化物酶為4 一 6 mg/mL ; 所述磷酸鹽緩沖溶液為磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀溶液，濃度為〇. 08 - 0. 12 mol/L，pH為 6. 8_7. 2。
6. 根據(jù)權利要求1或2所述的納米金酶傳感器檢測水中亞硝酸鹽的方法，其特征在于， 步驟（3)中，所述辣根過氧化物酶的磷酸鹽緩沖溶液中，pH為6. 8-7. 2。
【文檔編號】G01N27/327GK104316580SQ201410556468
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月20日 優(yōu)先權日:2014年10月20日
【發(fā)明者】李忠海, 付湘晉, 郭筱兵, 黎繼烈 申請人:中南林業(yè)科技大學