一種測定生物樣品中游離分析物的方法及測定藥物蛋白結合率的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定生物樣品中游離分析物的方法，采用溶劑棒中空纖維液相微萃取技術，通過利用反萃過程中濃度曲線法來測得溶劑棒中空纖維液相微萃取的時間常數(shù)，進而通過測定預平衡溶劑棒中空纖維液相微萃取所獲得的分析物的預平衡濃度來計算實際樣品中游離分析物的濃度。在含有蛋白的生物樣品中，根據(jù)游離藥物濃度可以進而計算出藥物蛋白結合率。本方法樣品前處理裝置簡單、操作方便，無須使用氘代物，不改變生物樣品的性質，可實現(xiàn)簡單、快速、準確地測定生物樣品中游離分析物的含量。
【專利說明】一種測定生物樣品中游離分析物的方法及測定藥物蛋白結合率的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及化學分析方法，特別涉及一種測定生物樣品中游離分析物的方法及測定藥物蛋白結合率的方法。
【背景技術】
[0002]近年來游離型藥物受到越來越多的關注和重視，并已成為藥動學和治療藥物監(jiān)測的研究熱點之一。藥物進入機體血液后有兩種存在形式。一種是結合型藥物；弱酸性藥物與白蛋白結合，弱堿性藥物與1-酸性糖蛋白(AGP)結合。另一種為游離型藥物。血漿中的游離型藥物是產(chǎn)生藥理效應的部分，游離藥物濃度與受體部位藥物平衡，因而其與藥效或藥物不良反應密切相關，也只有游離型藥物才能被機體轉化和排泄。
[0003]中空纖維液相微萃取對復雜樣品中微量組分的提取、分離、富集和濃縮起重要作用。中空纖維具有能使藥物分子通過，生物大分子或結合藥物的生物大分子不能通過的特殊結構。利用中空纖維的結構特性測定游離藥物濃度及藥物蛋白結合率的研究已有報道，上述所有工作都是采用平衡萃取法。而相對較長的平衡萃取時間正是中空纖維液相微萃取最主要的方法缺陷。對于藥物分析而言，過長的萃取時間會影響游離藥物和結合藥物的平衡，進而會在生物樣品的分析中產(chǎn)生一些假象而影響結果的準確度和精密度。此外，過長的分析時間可能導致萃取溶劑的損失；而生物樣品如血漿等也會由于酶的代謝等因素而導致基質的改變。
[0004]對樣品進行振蕩或攪拌，對血漿等粘度高的樣品進行稀釋，在萃取相上施加電壓等均可以縮短中空纖維液相微萃取的萃取時間。這些處理方法一方面對萃取速率的影響有限，另一方面增加了儀器的難度和操作參數(shù)。此外，這些方法都是為了提高傳質速率，但對于分配系數(shù)低的分析物，傳質并不是中空纖維液相微萃取的限速步驟。
[0005]微萃取中的動力學校正最早由Chen等在固相微萃取中提出，是一種利用內(nèi)標物脫附來校正分析物吸附的微萃取定量技術，在環(huán)境分析、動植物活體檢測和藥物分析等方面有著廣闊的應用前景?；陬A平衡的動力學校正對如下樣品的分析具有突出的優(yōu)點:1.平衡時間非常長的樣品；2.樣品濃度過聞；3.基質組成不穩(wěn)定，如生物樣品等。Ouyang等曾經(jīng)把動力學校正的概念引進到液相微萃取中。上述建立的動力學校正方法都需要氘代物作為反萃過程的內(nèi)標物。氘代物價格昂貴，分析儀器需要質譜這類高分離效率的儀器(能夠分離分析待測分析物及其氘代物)。這些因素限制了預平衡動力學校正方法在微萃取技術中的應用，也限制了預平衡動力學校正中空纖維液相微萃取方法在游離藥物快速分析方面的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明解決的技術問題在于提供一種測定生物樣品中游離分析物的方法，以克服現(xiàn)有游離分析物樣品前處理的難點，提供一種簡單、快速、準確測定生物樣品中游離分析物的方法。
[0007]本發(fā)明解決的另一技術問題在于提供一種測定藥物蛋白結合率的方法，以提供一種簡單、快速、準確的測定方法。
[0008]為了解決上述技術問題，本發(fā)明實施例提出了一種測定生物樣品中游離分析物的方法，是利用預平衡溶劑棒中空纖維液相微萃取技術，包括以下步驟:
步驟一:制作溶劑棒中空纖維膜微萃取裝置；
步驟二:以不同濃度分析物標準品的利用步驟一的萃取裝置進行反萃過程，通過濃度曲線法獲得溶劑棒中空纖維液相微萃取的時間常數(shù)；所述濃度曲線法使用公式(I):
【權利要求】
1.一種測定生物樣品中游離分析物的方法，是利用預平衡溶劑棒中空纖維液相微萃取技術，包括以下步驟: 步驟一:制作溶劑棒中空纖維膜微萃取裝置； 步驟二:以不同濃度分析物標準品的利用步驟一的萃取裝置進行反萃過程，通過濃度曲線法獲得溶劑棒中空纖維液相微萃取的時間常數(shù)；所述濃度曲線法使用公式(I):
2.根據(jù)權利要求1所述的測定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述步驟三中游離分析物濃度計算公式如下公式(2):
3.根據(jù)權利要求1所述的測定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述步驟一是把聚偏氟乙烯中空纖維膜剪成合適的小段，清洗后晾干，并封閉中空纖維膜的一端口。
4.根據(jù)權利要求1所述的測定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述步驟二中，將含有分析物標準品質量為qO且體積為Ve的萃取劑注入溶劑棒并將溶劑棒兩端封口 ；再將溶劑棒完全浸沒于體積為Vs的空白生物樣品溶液；振蕩萃取一段時間t后；取出溶劑棒，靜置后剪開溶劑棒的一端，抽取萃取溶劑進行儀器分析獲得Q值；根據(jù)公式(I )，以Q為縱坐標，qO為橫坐標，進行線性回歸，曲線的斜率即:
5.根據(jù)權利要求4所述的測定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述步驟二進一步包括以下步驟: (A)把50-80μ L的含有不同濃度分析物標準品的萃取溶劑加到一端已封閉的溶劑棒中空纖維膜的內(nèi)腔中，靜置； (B)封閉溶劑棒的另一端； (C)把所述中空纖維膜放到樣品瓶中，樣品瓶中加有1.8-3.8 mL的空白生物樣品溶液，渦旋振蕩，進行萃取，在萃取過程中，分析物標準品會反萃到樣品溶液中，萃取時間t根據(jù)濃度曲線的相關系數(shù)和儀器分析的靈敏度來決定；(D)萃取完成后，取出中空纖維膜溶劑棒，取纖維膜內(nèi)腔中的萃取溶劑25-40 μ L，注入儀器進行含量測定，獲取公式(I)中的Q值，Q是反萃取時間為t時目標分析物在溶劑棒中的剩余量，根據(jù)公式(I)進行線性回歸并計算出時間常數(shù)a。
6.根據(jù)權利要求2所述的測定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述步驟三進一步包括以下步驟: (A)把50-80μ L的空白萃取溶劑加到一端已封閉的溶劑棒中空纖維膜的內(nèi)腔中，靜置； (B)封閉溶劑棒的另一端； (C)把上述中空纖維膜放到樣品瓶中，樣品瓶中加有1.8-3.8 ml的含有待測分析物的生物樣品，渦旋振蕩，進行萃取，萃取時間根據(jù)儀器分析的靈敏度來決定； (D)萃取完成后，取出中空纖維膜溶劑棒，取纖維膜內(nèi)腔中的萃取溶劑25-40μ L進行含量測定，獲取公式(2)中的η值，根據(jù)公式(2)，即可以求出實際生物樣品中游離分析物的濃度。
7.根據(jù)權利要求1所述的測定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述萃取溶劑是選自正辛醇、對二甲苯、正己醚中的至少一種。
8.根據(jù)權利要求1所述的測定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述步驟二或步驟三中所述預平衡萃取的分析物或分析物標準品的量是由色譜儀進行含量測定；Kes是指分析物在萃取溶劑和樣品溶液間的分配系數(shù)，查閱文獻或搖瓶法測定獲得。`
9.一種測定測定藥物蛋白結合率的方法，包括根據(jù)下述公式(3)計算藥物血漿蛋白結合率: PB(%) =X 100 (3) 其中，ΡΒ(%)是藥物蛋白結合率；Ct是加入血漿樣品中的藥物總濃度；Cf是樣品溶液中游離藥物的濃度，是按權利要求1至8中任一項所述的測定生物樣品中游離分析物的方法所計算出來的游離分析物的含量。
10.根據(jù)權利要求9所述的測定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述游離物是選自鹽酸利多卡因、鹽酸布比卡因或鹽酸丁卡因中的至少一種；所述生物樣品溶液為磷酸鹽緩沖溶液或牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖溶液。
【文檔編號】G01N30/00GK103512961SQ201310414492
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權日:2013年9月12日
【發(fā)明者】崔淑芬, 張英雪, 陳敏, 侯金星 申請人:深圳職業(yè)技術學院