一種高效液相色譜峰保留時間預測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高效液相色譜峰保留時間預測方法。該方法包括：測定各種樣品的各種成分的標準保留時間，在每個樣品的目標成分中選擇兩個成分作為該樣品的雙標對照成分，獲得雙標對照成分在待測樣品的供試品溶液中的實測保留時間，獲得其他目標成分的實測保留時間，進行兩點驗證和多點驗證等步驟。采用本發(fā)明提供的高效液相色譜峰保留時間預測方法能夠準確預測待測樣品的各種成分的色譜峰的保留時間，進而對待測樣品的色譜峰進行定性，進行待測樣品的鑒別。本發(fā)明所提供的方法具有較高的預測精度，適用的色譜柱數(shù)量多，明顯優(yōu)于現(xiàn)有的相對保留時間法。
【專利說明】一種高效液相色譜峰保留時間預測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高效液相色譜峰保留時間預測方法，屬于高效液相色譜檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]中藥多指標成分的含量測定、指紋圖譜分析，化學藥(或抗生素)的有關物質(zhì)檢查等工作中一個核心任務就是對數(shù)量眾多的目標化合物進行定性，如果均使用純的化學對照品，將給標準物質(zhì)的制備和供應帶來極大的困難，也會顯著提高檢測成本。因此使用少量化學對照品通過某種方法來對其他色譜峰進行定性，具有重要的意義和應用價值。
[0003]目前，使用一個化學對照品的相對保留時間法是最常用的色譜峰定性法，在歐美及中國藥典中廣泛用于有關物質(zhì)檢查，替代模式的多指標含量測定研究中也多使用。但由于色譜儀與色譜柱的差異，保留時間的預測值與實測值之間的偏差常常較大，實際應用中需限定色譜柱的型號，或選擇同類型、分離性能相似的色譜柱，多有不便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述技術問題，本發(fā)明的目的在于提供一種高效液相色譜峰保留時間預測方法，通過兩個化學對照品進行色譜峰定性，較之相對保留時間法，該方法能夠顯著減小定性的誤差，增加使用的色譜柱數(shù)量。
[0005]為達到上述目的，本發(fā)明提供了一種高效液相色譜(HPLC)峰保留時間預測方法，可以稱為雙標線性校正法，其包括以下步驟:
[0006](I)利用高效液相色譜儀測定各種樣品的各種成分在多根不同的色譜柱上的實測保留時間，對在不同色譜柱上測定的同一樣品的各種成分的實測保留時間兩組兩組地進行線性擬合，分別繪制標準曲線并計算相關系數(shù)r，剔除(色譜柱測定的)r < 0.995的實測保留時間、(色譜柱測定的)偏離較大的實測保留時間以及(色譜柱測定的)導致色譜峰順序改變的實測保留時間，以剩下的色譜柱測定的實測保留時間的平均值作為各種成分的標準保留時間；
[0007]或者，以在所有色譜柱上測定的同一樣品的同一成分的實測保留時間的平均值為初擬標準保留時間，以所有成分的初擬標準保留時間與所有色譜柱上測定的同一樣品的所有成分的實測保留時間分別進行線性擬合，分別繪制標準曲線并計算相關系數(shù)r，剔除(色譜柱測定的)r < 0.995的實測保留時間、(色譜柱測定的)偏離較大的實測保留時間以及(色譜柱測定的)導致色譜峰順序改變的實測保留時間，以剩下的色譜柱測定的實測保留時間的平均值作為各種成分的標準保留時間；
[0008](2)在每一個樣品的目標成分中選擇兩個成分作為該樣品的雙標對照成分；
[0009](3)在一根色譜柱上運行待測樣品的供試品溶液和雙標對照成分的對照品溶液并利用高效液相色譜儀進行檢測，獲得供試品溶液的色譜圖，通過雙標對照成分的對照品對所獲得的色譜圖中的色譜峰進行定性，獲得雙標對照成分在供試品溶液中的實測保留時間；
[0010](4)以雙標對照成分的標準保留時間為縱坐標、實測保留時間為橫坐標建立線性曲線，并得到兩點線性方程；
[0011](5)將除雙標對照成分之外的待測樣品的目標成分的標準保留時間帶入所述兩點線性方程，獲得相應目標成分的預測保留時間，根據(jù)該預測保留時間對供試品的色譜圖中的其他色譜峰進行定性，得到相應目標成分的實測保留時間；
[0012]如果所有的除雙標對照成分之外的待測樣品的目標成分的標準保留時間和實測保留時間的偏差的絕對值均> t2，則預測失敗，更換步驟(3)中的色譜柱，并重復步驟
(3)- (5)；
[0013]如果除雙標對照成分之外的待測樣品的目標成分之中至少有一個目標成分的標準保留時間和實測保留時間的偏差的絕對值< t2，則進入步驟(6)；
[0014](6)以所有實測保留時間與預測保留時間的偏差的絕對值< t2的目標成分與雙標對照成分的標準保留時間為縱坐標、實測保留時間為橫坐標建立多點關系曲線并得到多點線性方程；
[0015](7)將除雙標對照成分之外的待測樣品的目標成分的標準保留時間帶入多點線性方程，計算得到相應目標成分的新的預測保留時間；
[0016](8)在供試品的色譜圖中找到與新的預測保留時間最接近的色譜峰，得到相應目標成分的新的實測保留時間，并計算各個目標成分的新的實測保留時間與新的預測保留時間的偏差的絕對值，以判斷多點線性方程是否包括了所有目標成分:如果所有的偏差的絕對值< t2，則進入下一步驟，如果有偏差的絕對值> t2，則返回步驟(6)，以步驟(8)中計算的所有偏差的絕對值< t2的目標成分與雙標對照成分的標準保留時間為縱坐標、實測保留時間為橫坐標重新建立多點關系曲線并得到新的多點線性方程，重復步驟(6) - (8)；
[0017](9)檢測所有目標成分的標準保留時間與新的預測保留時間的偏差的絕對值是否(tm，其中tm< t2:如果是，則預測成功；如果不是，則預測失敗；預測失敗時，更換步驟(3)中的色譜柱，重復步驟(3)- (9)。
[0018]本發(fā)明所提供的上述方法的目的是為了獲得待測樣品的各種成分的色譜峰的保留時間，并對色譜峰進行定性，利用兩個化學對照品達到對待測樣品中多個目標成分的定性，所適用的樣品可以為中藥、天然植物藥、化學藥、食品(例如保健食品)或者抗生素等，但不限于此，任何需要通過HPLC進行多成分定性的領域均可以適用。
[0019]在上述方法中，優(yōu)選地，在利用高效液相色譜儀測定各種樣品的各種成分在多根色譜柱上的實測保留時間時，在每一根色譜柱均至少進樣3次，并且所得到的實測保留時間的RSD應≤2%。
[0020]在上述方法中，優(yōu)選地，所選擇的雙標對照品成分的標準保留時間靠近對應的樣品的目標成分的保留時間段的兩端。這里的保留時間段是指各種成分的色譜峰的保留時間范圍。
[0021]在上述方法中，優(yōu)選地，將樣品的目標成分的保留時間段等分為四段，所選擇的雙標對照品成分的標準保留時間位于第一個分界點和第三個分界點附近。
[0022]在上述方法中，優(yōu)選地，選擇雙標對照品成分的標準保留時間時，不選擇在色譜柱擬合過程中偏離較大的成分，并且優(yōu)選廉價易得的成分。[0023]在上述方法中，優(yōu)選地，t2 < lmin, tm < Imin ;更優(yōu)選地，t2為0.7min, tm為0.5min。
[0024]在上述方法中，采用越多的色譜柱進行測定，可以獲得更多的數(shù)據(jù)，而加入的數(shù)據(jù)越多，誤差就越小，但也有一個收益遞減效應，優(yōu)選地，在步驟(I)中，各種成分的標準保留時間時采用的10-20根色譜柱測定的實測保留時間進行計算，由此獲得的標準保留時間具有足夠的代表性，在一開始選擇色譜柱進行實測保留時間測定時應選擇較多的色譜柱，以滿足這里計算時采用10-20根色譜柱測得的數(shù)據(jù)的這一要求。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，上述高效液相色譜峰保留時間預測方法可以按照以下方式進行，其具體流程可以如圖1所示:
[0026]1、色譜柱擬合
[0027](I)利用高效液相色譜儀測定各種樣品的各種成分在多根不同的色譜柱上的實測保留時間(至少保留3位小數(shù))，該檢測可以采用優(yōu)化的色譜條件(包括柱溫、流速和流動相的種類、比例，可以根據(jù)藥典的記載進行選擇)進行，在檢測過程中至少要進樣三次，并且要滿足保留時間的RSD ( 2%，以控制采集數(shù)據(jù)的誤差；
[0028]對在不同色譜柱上測定的同一樣品的各種成分的實測保留時間兩組兩組地進行線性擬合，分別繪制標準曲線并計算相關系數(shù)r，剔除偏離較大的色譜柱甚至導致色譜峰順序改變的色譜柱，一般來說，這些色譜柱與其他色譜柱的擬合效果都不佳，表現(xiàn)為r
<0.995或者某個(或某些)點明顯偏離擬合的直線；剔除這些數(shù)據(jù)可以使獲得的標準保留時間等數(shù)據(jù)更加準確；在剔除的時候，可以對色譜柱進行分類，將相互之間擬合比較好的放在一起，然后進行選擇，盡量選擇數(shù)量較多的一組；
[0029]剔除之后，以未被剔除的色譜柱測定的實測保留時間的平均值作為各種成分的標準保留時間(standard retention time,簡稱SRT),以該標準保留時間作為預測的基準值，計算時應采用10-20根色譜柱測定的數(shù)據(jù)進行。
[0030](2)在每一個樣品的目標成分中選擇兩個成分作為該樣品的雙標對照成分；理論上，目標物中的任意兩個成分作為雙標的效果應該都是一樣的，但實際上由于色譜柱和色譜儀的差異、成分間結構的差異、洗脫條件的復雜程度和色譜分析的偶然誤差，雙標的選擇還是會造成差別的，此外，還要兼顧該對照品獲得的難易程度和價格因素。以下是雙標選擇應該遵循和兼顧的原則:雙標應盡量分布在目標化合物保留時間段的兩端，最優(yōu)位置是將保留時間段均分成4段后，第一和第三兩個分界點附近；雙標成分盡量不要選擇在色譜柱擬合過程中偏離較大的成分；雙標成分盡量選擇價廉易得的成分。
[0031]獲得各種樣品的各種成分的SRT和各種樣品的雙標對照成分之后，可以將其匯總在一起作為標準集或者藥典，當需要對某一樣品的色譜峰的保留時間進行預測時，可以從該標準集或者藥典中查詢其對應的SRT和雙標對照成分，然后按照以下步驟進行預測:
[0032]2、兩點預測:
[0033](3)在一根色譜柱(可以是任意的色譜柱，不一定是建立上述標準集或藥典時采用的色譜柱)上運行待測樣品的供試品溶液和雙標對照成分的對照品溶液并利用高效液相色譜儀進行檢測，獲得供試品溶液的色譜圖，通過雙標對照成分的對照品對所獲得的色譜圖中的色譜峰進行定性，獲得雙標對照成分在供試品溶液中的實測保留時間；
[0034](4)以雙標對照成分的標準保留時間為縱坐標、實測保留時間為橫坐標建立線性曲線，并得到兩點線性方程；
[0035](5)將除雙標對照成分之外的待測樣品的目標成分的標準保留時間帶入所述兩點線性方程，獲得相應目標成分的預測保留時間，根據(jù)該預測保留時間對供試品的色譜圖中的其他色譜峰進行定性，得到相應目標成分的實測保留時間；
[0036]如果除雙標對照成分之外，待測樣品所有的目標成分的標準保留時間和實測保留時間的偏差的絕對值均> t2，則預測失敗，更換步驟(3)中的色譜柱，并重復步驟(3)- (5)；
[0037]如果除雙標對照成分之外，待測樣品的目標成分之中至少有一個目標成分的標準保留時間和實測保留時間的偏差的絕對值< t2，則進入步驟(6)。
[0038]3、多點預測:
[0039](6)以所有實測保留時間與預測保留時間的偏差的絕對值< t2的目標成分與雙標對照成分的標準保留時間為縱坐標、實測保留時間為橫坐標建立多點關系曲線并得到多點線性方程；
[0040](7)將除雙標對照成分之外的待測樣品的目標成分的標準保留時間帶入多點線性方程，計算得到相應目標成分的新的預測保留時間；
[0041](8)在供試品的色譜圖中找到與新的預測保留時間最接近的色譜峰，得到相應目標成分的新的實測保留時間，并計算各個目標成分的新的實測保留時間與新的預測保留時間的偏差的絕對值，以判斷多點線性方程是否包括了所有目標成分:如果所有的偏差的絕對值< t2，則進入下一步驟，如果有偏差的絕對值> t2，則返回步驟(6)，即使只有一個絕對值> t2也要返回步驟(6)，以步驟(8)中計算的所有偏差的絕對值< t2的目標成分與雙標對照成分的標準保留時間為縱坐標、實測保留時間為橫坐標重新建立多點關系曲線并得到新的多點線性方程，重復步驟(6) - (8)，直到建立的多點線性方程能夠包括所有的點；
[0042]在步驟(6)—開始建立多點線性方程時，可能會有部分的目標成分的數(shù)據(jù)因為偏差的絕對值>t2而沒有用到，當在步驟(7)中將其帶入多點線性方程時，所計算得到的新的預測保留時間與標準保留時間的差值的絕對值有可能會變?yōu)?lt; t2，因此，當有偏差的絕對值>t2而返回步驟(6)之后，建立新的多點線性方程時所采用的數(shù)據(jù)會與之前的不同，后續(xù)的過程也會有不同，當所有的數(shù)據(jù)都能夠滿足偏差的絕對值< t2之后，就可以進入后續(xù)的步驟(9)。
[0043](9)檢測所有目標成分的標準保留時間與新的預測保留時間的偏差的絕對值是否(tm，且tm< t2:如果是，則預測成功；如果不是，則預測失??；預測失敗時，更換步驟(3)中的色譜柱，重復步驟(3)- (9)。
[0044]通過后面的多點預測可以提高預測的精度。另外，t2 >乜可以達到寬進嚴出的效果，一方面提高適用柱的數(shù)量，另一方面也保證了預測的準確度，至于上述t2、tm的具體數(shù)值，可以根據(jù)情況進行調(diào)整，一般不大于lmin。
[0045]采用本發(fā)明提供的高效液相色譜峰保留時間預測方法能夠準確預測待測樣品的各種成分的色譜峰的保留時間，進而對待測樣品的色譜峰進行定性，進行待測樣品的鑒別。本發(fā)明所提供的方法具有較高的預測精度，適用的色譜柱數(shù)量多，明顯優(yōu)于現(xiàn)有的相對保留時間法。
【專利附圖】

【附圖說明】[0046]圖1為本發(fā)明提供的高效液相色譜峰保留時間預測方法的流程圖。
[0047]圖2為兩根色譜柱的擬合直線圖。
[0048]圖3a-圖3c為大黃中的5種蒽醌在10根色譜柱上的擬合結果。
[0049]圖4a_圖4c為不同色譜柱上測定的大黃五種成分的保留時間的線性關系圖。
[0050]圖5為供試品溶液的色譜圖。
【具體實施方式】
[0051]為了對本發(fā)明的技術特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對本發(fā)明的技術方案進行以下詳細說明，但不能理解為對本發(fā)明的可實施范圍的限定。
[0052]實施例
[0053]本實施例提供了一種高效液相色譜峰保留時間預測方法，其對大黃進行色譜峰保留時間的預測，包括以下步驟:
[0054]1、色譜柱擬合:
[0055]按照優(yōu)化的色譜條件(根據(jù)《中國藥典》2010年版一部大黃的含量測定項(第22頁)確定，具體參數(shù)為流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(85:15)，檢測波長254nm，柱溫30°C，流速1.0mL.mirT1)，在11根的不同品牌、型號的C18柱上進樣混合對照品或供試品溶液，獲得五種成分(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)在不同色譜柱上的實測保留時間，至少進樣三次并且要保留三位小數(shù)，去除RSD大于2%的色譜柱；所采用的色譜柱有 12 根，分別為=Kromasil C18*，Sunfire C18林，Agilent TC-C18*，Inertsil C18**，Hyperisil C18*, Vensil MP C18**, Shimadzu VP C18**, Phenomen Iuna C18**, AgilentHC-C18*，Agilent Zorbax SB-C18*，Shiseido AQ C18*，Shiseido MG C18*，以上 C18 柱簡稱為 Cl 至 C12 (*.4.6mmX250mmX5ym，**.4.6mmX 150mmX 5 μ m)，其中 Cl 至 Cll 用于色譜柱擬合，C12作為未知柱用于方法驗證(未參與SRT的計算)；
[0056]將Cl至Cll色譜柱測定的上述五種成分的實測保留時間進行線性擬合(兩兩組合)，繪制標準曲線，計算相關系數(shù)r，然后剔除偏離較大甚至導致色譜峰順序改變的色譜柱(例如r < 0.995的色譜柱，以及個別點明顯偏離擬合直線的色譜柱)；例如圖2所示，其為C2、C11兩根色譜柱的擬合直線，可以看出，Cll色譜柱的第二個點(大黃酸)處與C2色譜柱偏離較大，這兩根色譜柱不能夠放在一起，應剔除一個；通過擬合，保留了 Cl至CIO，Cll剔除。
[0057]2、SRT 的確定:
[0058]在2個色譜系統(tǒng)上采用《中國藥典》2010年版大黃項下的含量測定方法，同時測定其中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚5種游離蒽醌成分(以上5種成分按保留時間從小到大排序)，系統(tǒng)1:島津2010A (對應柱1、2);系統(tǒng)2:waters e2695 (對應柱3、4)和4根不同品牌和型號的色譜柱，柱1:kromasilC18 (250mmX 4.6mmX 5 μ m)；柱 2:waters sunf ire C18 (150mmX 4.6mmX 5 μ m)；柱 3:agilent TC-C18 (250mmX4.6mmX 5 μ m);柱 4:1nertsil C18 (150mmX4.6mmX 5 μ m),以驗證該結論的準確性和適用性，結果見圖4a-圖4c，其中，橫、縱坐標分別為5種成分在任意兩根色譜柱上的保留時間。
[0059]圖3a-圖3c為大黃5種蒽醌在10根色譜柱上的擬合結果，橫坐標為5種蒽醌的SRT，縱坐標為各色譜柱上的實測保留時間，各色譜柱的線性方程和相關系數(shù)見表I。
[0060]表I不同色譜柱上保留時間的線性方程及相關系數(shù)
[0061]
【權利要求】
1.一種高效液相色譜峰保留時間預測方法，其包括以下步驟: (1)利用高效液相色譜儀測定各種樣品的各種成分在多根不同的色譜柱上的實測保留時間，對在不同色譜柱上測定的同一樣品的各種成分的實測保留時間兩組兩組地進行線性擬合，分別繪制標準曲線并計算相關系數(shù)r，剔除r< 0.995的色譜柱測定的實測保留時間、偏離較大的色譜柱測定的實測保留時間以及導致色譜峰順序改變的色譜柱測定的實測保留時間，以剩下的色譜柱測定的實測保留時間的平均值作為各種成分的標準保留時間； 或者，以在所有色譜柱上測定的同一樣品的同一成分的實測保留時間的平均值為初擬標準保留時間，以所有成分的初擬標準保留時間與所有色譜柱上測定的同一樣品的所有成分的實測保留時間分別進行線性擬合，分別繪制標準曲線并計算相關系數(shù)r，剔除r<0.995的色譜柱測定的實測保留時間、偏離較大的色譜柱測定的實測保留時間以及導致色譜峰順序改變的色譜柱測定的實測保留時間，以剩下的色譜柱測定的實測保留時間的平均值作為各種成分的標準保留時間； (2)在每一個樣品的目標成分中選擇兩個成分作為該樣品的雙標對照成分； (3)在一根色譜柱上運行待測樣品的供試品溶液和雙標對照成分的對照品溶液并利用高效液相色譜儀 進行檢測，獲得供試品溶液的色譜圖，通過雙標對照成分的對照品對所獲得的色譜圖中的色譜峰進行定性，獲得雙標對照成分在供試品溶液中的實測保留時間； (4)以雙標對照成分的標準保留時間為縱坐標、實測保留時間為橫坐標建立線性曲線，并得到兩點線性方程； (5)將除雙標對照成分之外的待測樣品的目標成分的標準保留時間帶入所述兩點線性方程，獲得相應目標成分的預測保留時間，根據(jù)該預測保留時間對供試品的色譜圖中的其他色譜峰進行定性，得到相應目標成分的實測保留時間； 如果所有的除雙標對照成分之外的待測樣品的目標成分的標準保留時間和實測保留時間的偏差的絕對值均> t2，則預測失敗，更換步驟(3)中的色譜柱，并重復步驟(3)- (5)； 如果除雙標對照成分之外的待測樣品的目標成分之中至少有一個目標成分的標準保留時間和實測保留時間的偏差的絕對值≤t2，則進入步驟(6)； (6)以所有實測保留時間與預測保留時間的偏差的絕對值<t2的目標成分與雙標對照成分的標準保留時間為縱坐標、實測保留時間為橫坐標建立多點關系曲線并得到多點線性方程； (7)將除雙標對照成分之外的待測樣品的目標成分的標準保留時間帶入多點線性方程，計算得到相應目標成分的新的預測保留時間； (8)在供試品的色譜圖中找到與新的預測保留時間最接近的色譜峰，得到相應目標成分的新的實測保留時間，并計算各個目標成分的新的實測保留時間與新的預測保留時間的偏差的絕對值，以判斷多點線性方程是否包括了所有目標成分:如果所有的偏差的絕對值(t2，則進入下一步驟，如果有偏差的絕對值> t2，則返回步驟(6)，以步驟(8)中計算的所有偏差的絕對值< t2的目標成分與雙標對照成分的標準保留時間為縱坐標、實測保留時間為橫坐標重新建立多點關系曲線并得到新的多點線性方程，重復步驟(6) - (8)； (9)檢測所有目標成分的標準保留時間與新的預測保留時間的偏差的絕對值是否(tm，且tm< t2:如果是，則預測成功；如果不是，則預測失?。活A測失敗時，更換步驟(3)中的色譜柱，重復步驟(3)- (9)。
2.根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜峰保留時間預測方法，其中，所述樣品為中藥、天然植物藥、化學藥、食品或者抗生素。
3.根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜峰保留時間預測方法，其中，在利用高效液相色譜儀測定各種樣品的各種成分在多根色譜柱上的實測保留時間時，在每一根色譜柱均至少進樣3次，并且所得到的實測保留時間的RSD ( 2%。
4.根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜峰保留時間預測方法，其中，所選擇的雙標對照品成分的標準保留時間靠近樣品的目標成分的保留時間段的兩端。
5.根據(jù)權利要求1或4所述的高效液相色譜峰保留時間預測方法，其中，將樣品的目標成分的保留時間段等分為四段，所選擇的雙標對照品成分的標準保留時間位于第一個分界點和第三個分界點附近。
6.根據(jù)權利要求4或5所述的高效液相色譜峰保留時間預測方法，其中，選擇雙標對照品成分的標準保留時間時，不選擇在色譜柱擬合過程中偏離較大的成分，優(yōu)選廉價易得的成分。
7.根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜峰保留時間預測方法，其中，所述t2<lmin，tm< lmin。
8.根據(jù)權利要求7所述的高效液相色譜峰保留時間預測方法，其中，所述12為0.7min,所述tm為0.5min。
9.根據(jù)權利要求1所述的高效液相色譜峰保留時間預測方法，其中，在步驟(I)中，各種成分的標準保留時間時采用的10-20根色譜柱測定的實測保留時間進行計算。
【文檔編號】G01N30/91GK103439440SQ201310291229
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月11日 優(yōu)先權日:2013年7月11日
【發(fā)明者】孫磊, 金紅宇, 馬雙成 申請人:中國食品藥品檢定研究院