一種采用高效液相色譜測定苯并芘在吸煙后大鼠肺部沉積量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及煙氣化合物生物檢驗技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種采用高效液相色譜測定苯并芘在吸煙后大鼠肺部沉積量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]苯并花(Benzo (a)pyrene, B (a) P)不但廣泛存在于自然環(huán)境中，而且是卷煙煙氣中最重要的有害物質(zhì)。我國是世界上吸煙人數(shù)最多的國家，且出現(xiàn)年輕化的趨勢，男性吸煙率已達63%，盡管我國女性吸煙率只有3.8%，但是一半以上有明顯的被動吸煙史，因此探討卷煙煙氣中苯并芘對人類呼吸系統(tǒng)的影響具有重要的臨床意義。研究顯示多種肺部疾病與苯并芘的毒理作用密切相關(guān)，其毒理作用主要表現(xiàn)在以下兩方面:一方面其終代謝產(chǎn)物二氫二醇環(huán)氧苯并芘(BTOE)能與DNA形成加合物引起DNA損傷:另一方面，B(a)P代謝過程中產(chǎn)生的大量活性氧，造成細(xì)胞的氧化損傷。既往對B(a)P在呼吸系統(tǒng)疾病影響的研究大多集中在BPDE-DNA的形成進而誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的分子機制上，而對B (a) P在呼吸道上皮細(xì)胞造成氧化損傷后細(xì)胞抗氧化酶的變化規(guī)律方面研究較少。建立一種吸煙后B (a) P肺部沉積的檢測方法將為深入研究吸煙與肺部危害提供良好的技術(shù)支持手段，目前尚無報道有關(guān)吸煙后B (a) P肺部沉積的檢測方法的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是在現(xiàn)有技術(shù)狀況下提供一種采用高效液相色譜測定苯并芘在吸煙后大鼠肺部沉積量的方法。本方法提供的檢測方法，具有模擬人吸煙，僅口鼻暴露，苯并芘萃取操作時間短等優(yōu)點。
[0004]為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種采用高效液相色譜測定苯并芘在吸煙后大鼠肺部沉積量的方法，該方法包括以下步驟:
1)大鼠吸煙:SD大鼠置于慧榮和大鼠口鼻暴露系統(tǒng)中，維持載氣流量8L/min，抽氣流量9.5L/min，氧氣濃度20±0.5%，溫度24±2 ° C，相對濕度60-80% ;卷煙采用國際標(biāo)準(zhǔn)模式進行抽吸，連續(xù)吸煙20支，吸煙結(jié)束后I小時內(nèi)處死大鼠，取肺組織凍存于-70 0C ；
2)待測樣品溶液的制備:取Ig肺組織于4mLEP管中，同時加入Ig無水硫酸鈉；加入2mL環(huán)己烷，勻漿；將勻漿轉(zhuǎn)移至1mL離心管中，并用環(huán)己烷洗滌EP管，合并環(huán)己烷至離心管中；，超聲1min ;離心,3500rpm, 2min ;收集上清液于50mL雞心瓶中，殘洛用1mL環(huán)己烷重提2次，合并環(huán)己烷提取液；旋蒸濃縮至lmL，備用；將上述濃縮液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用環(huán)己烷清洗雞心瓶，合并環(huán)己烷，保持總體積5mL ;分別用5、3、2mL DMSO萃取3次，取分液漏斗下層DMSO層，收集合并于另一個分液漏斗中，待進一步純化處理；向上述DMSO萃取液中加入15mL 2.0g/L無水硫酸鈉溶液，然后每次用5mL環(huán)己烷反萃取3次，保留上層的環(huán)己烷層，合并于20mL刻度試管中；氮氣吹干，用甲醇溶解殘渣，定容至lmL，過0.45Mm濾膜，待測；
3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備:準(zhǔn)確稱取2mg苯并花溶于Iml甲醇中，配制成2000ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品母液，待測前24小時內(nèi)直接用甲醇稀釋成濃度為10，5，2，1,0.8,0.4ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，避光保存待用；
4)色譜條件:色譜柱:BP_C18柱,250mm*4.6mm ;流動相:乙腈:水=88:12 ;流速:1.2mL/min ;熒光檢測激發(fā)波長:384nm，發(fā)射波長:406nm，柱溫:30°C，進樣量:50μ? ；
5)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及結(jié)果計算:將配制好的不同濃度的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入高效液相色譜儀，以外標(biāo)法進行定量分析，標(biāo)準(zhǔn)品的苯并芘的色譜峰面積與其相應(yīng)的濃度進行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)需大于等于0.999;對制備的樣品進行測定，測得樣品中苯并芘的峰面積，代入一元線性回歸方程，計算得到待測樣品中苯并芘的含量。
[0005]本發(fā)明建立了一種采用高效液相色譜測定苯并芘在吸煙后大鼠肺部沉積量的的檢測方法，具有以下優(yōu)點:
1.大鼠僅口鼻吸煙，避免卷煙有害物質(zhì)經(jīng)粘膜或大鼠舔毛等方式進入，更加準(zhǔn)確。
[0006]2.由吸煙機吸煙產(chǎn)生卷煙煙氣，能檢測不同卷煙不同抽吸模式下對苯并芘在大鼠肺部沉積，運用靈活。
[0007]3.卷煙煙氣經(jīng)載氣進行暴露，能更好的模擬人吸煙過程中的吸煙和吐煙的實際過程。
[0008]4.本實驗相對傳統(tǒng)的采用索氏提取法，采用環(huán)己烷萃取-二甲基亞砜反萃取-環(huán)己烷萃取的方式使樣品處理時間大大縮短，且操作方便。
[0009]5.本發(fā)明方法的檢測限和定量限分別為0.064ng/g和0.213ng/g，3個加標(biāo)水平的平均回收率在93-103%，RSD為3-7%，這表明該方法靈敏度高，重復(fù)性及回收率好。
【附圖說明】
[0010]圖1為苯并芘標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜圖。
[0011]圖2為吸煙大鼠肺萃取后樣本的色譜圖。
【具體實施方式】
[0012]建立高效液相色譜檢測吸煙后大鼠肺部苯并芘含量的方法。大鼠口鼻吸煙，卷煙樣品為市售某焦油含量為Ilmg卷煙，采用國際標(biāo)準(zhǔn)模式抽吸，分別吸煙10支及20支。吸煙結(jié)束后，處死大鼠，取肺組織勻漿，用二甲基亞砜和環(huán)己烷萃取方式萃取，濃縮，采用C18反向柱，乙腈和水為流動相，熒光檢測器檢測苯并芘含量。
[0013]1.主要儀器與試劑
主要儀器:電子天平:上海天平儀器廠，F(xiàn)A1104型；高效液相色譜儀:島津LC-20 ;色譜柱:BP-C18 柱(250mm*4.6mm);冷凍離心機:Thermo，ST16R ;旋蒸儀:南京科爾，G2100。
[0014]試劑:SUPELC0，批號:LB95135V ;待測卷煙:浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供；環(huán)己烷，二甲基亞砜，甲醇均為Sigma色譜純。
[0015]實驗動物:SD 260g-300g，雌性，購于上海斯萊克，合格證號:2011001613866。
[0016]2.柱子型號及色譜條件色譜柱:BP-C18柱(250mm*4.6mm);流動相:乙腈:水=88:12 ;流速:1.2mL/min ;突光檢測激發(fā)波長:384nm，發(fā)射波長:406nm，柱溫:30° C，進樣量:50μ?
3.標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備
準(zhǔn)確稱取2mg苯并芘溶于Iml甲醇中，配制成2000ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品母液，待測前2