專利名稱：合成肽及其用于預(yù)防和治療癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表現(xiàn)出對(duì)癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制活性的合成肽。本發(fā)明的肽包含相應(yīng)于基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的85-92氨基酸的PRKPKWDK(SEQ ID2)肽，以及SEQ ID2的片段、類似物和同源物。本發(fā)明還涉及這種肽作為人癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制物的用途以及在預(yù)防和治療癌癥及其它與MMP降解胞外基質(zhì)相關(guān)的病理狀況中的治療應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多種病理狀況包括腫瘤性疾病與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性增加相關(guān)。MMP是一組絲氨酸蛋白酶，其能降解胞外基質(zhì)(ECM)。MMP以其酶原形式被分泌在胞外基質(zhì)中。經(jīng)活化，MMP酶變成有活性并消化ECM，該過程被顯示出在癌癥轉(zhuǎn)移中起主要作用。
它們是MMP家族中的至少一些蛋白酶成員，并且包括MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-8，MMP-9和MMP-13。在癌癥中，MMP-2參與原發(fā)腫瘤生長以及腫瘤轉(zhuǎn)移。這種特定的MMP能消化膠原和其它胞外基質(zhì)(ECM)蛋白，作為癌癥擴(kuò)散以發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的先決條件。
盡管針對(duì)設(shè)計(jì)和測試抗癌劑進(jìn)行了大量努力，持續(xù)需要一種可有效阻斷MMP介導(dǎo)的對(duì)ECM的消化的無毒治療劑，從而減少癌癥和其它疾病的擴(kuò)散。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可有效阻斷癌細(xì)胞侵襲的合成肽。這些物質(zhì)及其抗體的益處是在用于阻斷癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的臨床應(yīng)用中的效用。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供有效阻斷癌癥侵襲和癌癥轉(zhuǎn)移的合成寡肽，其具有與基質(zhì)金屬蛋白酶2序列的特定氨基酸序列(85-92)類似的氨基酸序列。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于阻斷癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的合成肽，其具有氨基酸序列PRKPKWEDK。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是采用如本申請(qǐng)所公開的合成肽來預(yù)防和治療癌癥疾病的方法。該實(shí)施方案的另一方面是將有效量的合成肽用于實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的阻斷。
本發(fā)明的另一目的提供了具有PRKPKWDK(SEQ.ID.No.2)的寡肽。
優(yōu)選地，該寡肽為大約6-大約20個(gè)殘基。最優(yōu)選地，該寡肽為大約8-大約10個(gè)殘基。
優(yōu)選地，合成肽的濃度范圍從1μM至500μM。最優(yōu)選地，合成肽的濃度范圍從50μM至200μM。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是包括在藥物組合物中的免疫原性寡肽，所述藥物組合物包含可藥用載體和所述寡肽。該寡肽可用作疫苗。包含寡肽的藥物組合物可用于誘導(dǎo)針對(duì)包含具有寡肽序列(例如SEQ.ID.2)的表位的蛋白的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是所述組合物和方法在體內(nèi)和體外實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明提供了具有與人MMP-2類似的氨基酸序列的合成寡肽。
本發(fā)明還提供了通過省略N-末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基對(duì)阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽進(jìn)行的修飾。
本發(fā)明提供了通過省略C-末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基對(duì)阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽進(jìn)行的修飾。
本發(fā)明提供了通過省略N-末端和C-末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基對(duì)阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽進(jìn)行的修飾。
本發(fā)明提供了通過置換在給定的序列之中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而不考慮置換殘基的電荷和極性，對(duì)阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽進(jìn)行的修飾。
本發(fā)明提供了通過用具有相似的電荷和/或極性的氨基酸殘基置換在給定的序列之中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，對(duì)阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽進(jìn)行的修飾。
本發(fā)明提供了通過省略在給定的序列之中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基對(duì)阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽進(jìn)行的修飾。
本發(fā)明提供了通過兩種或多種所述修飾，對(duì)阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽進(jìn)行的修飾。
本發(fā)明提供了通過重復(fù)寡肽序列一次或多次，它們中的每一個(gè)共價(jià)結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)寡肽重復(fù)，而對(duì)阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽進(jìn)行的修飾。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用合成肽作為免疫原來生成抗體，從而使得這種生成的抗體可有效阻斷癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明提供了一種或多種所述寡肽通過靜脈內(nèi)應(yīng)用或以另一種治療上可接受的方式直接地和競爭性地減弱或阻斷MMP-2的代謝作用或相互作用的預(yù)防或治療用途。
本發(fā)明提供了一種或多種所述寡肽間接地減弱或阻斷MMP的代謝作用或相互作用的預(yù)防或治療用途，通過皮下應(yīng)用或以另一種可接受的方式將它們作為疫苗施用以刺激特異性的免疫應(yīng)答，其可部分或完全阻斷MMP5的代謝相互作用。優(yōu)選的實(shí)施方案包括MMP-2。
本發(fā)明提供了一種或多種所述寡肽的預(yù)防和治療用途，其中寡肽偶聯(lián)至半抗原以增強(qiáng)免疫應(yīng)答從而增加治療效力。
本發(fā)明提供了一種或多種所述寡肽的預(yù)防或治療用途，其功能作為反饋調(diào)節(jié)物來特異性地阻止或降低MMP-2蛋白在細(xì)胞水平的合成率。
本發(fā)明提供了一種或多種可阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽，作為疫苗以產(chǎn)生特異性抗體，用于診斷涉及MMP-2的疾病，或臨床監(jiān)測該疾病的進(jìn)展或消退。
本發(fā)明提供了一種或多種阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽用于預(yù)防或治療癌癥的用途。
本發(fā)明提供了一種或多種阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽的用途，其中這些寡肽可作為疫苗，作為注射劑、輸液、吸入劑、栓劑或其它可藥用載體和/或遞送方式施用于患者。
附圖簡述

圖1描述了MMP2酶的氨基酸序列。所選擇用于抑制活性研究的氨基酸序列被框起來以易于識(shí)別。由其他人(Loitta和同事)顯示出抑制MMP2活性的氨基酸序列TMRKPRCGNPDVAN(也被框起來)用作參照。
圖2描述了測試的多種寡肽的對(duì)比抑制作用。使用Matrigel試驗(yàn)，對(duì)于人黑素瘤癌細(xì)胞A2058，寡肽PRKPKWDK高度有效地阻斷癌細(xì)胞侵襲。
圖3描述了使用Matrigel試驗(yàn)，對(duì)于人黑素瘤癌細(xì)胞A2058，寡肽PRKPKWDK在阻斷癌細(xì)胞侵襲方面的抑制作用。
圖4描述了使用Matrigel試驗(yàn)，對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞MCF7，寡肽PRKPKWDK在阻斷癌細(xì)胞侵襲方面的抑制作用。
發(fā)明詳述定義如本文所用，術(shù)語“肽”指包含兩個(gè)或多個(gè)通過肽鍵共價(jià)連接的氨基酸的有機(jī)化合物；肽可以是二肽(其含有兩個(gè)氨基酸殘基)、三肽(三個(gè)氨基酸等)。
如本文所用，術(shù)語“寡肽”指含有通常少于30個(gè)殘基長度的肽。寡肽的長度對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵性的，只要維持了正確的表位。期望地，寡肽可以盡可能得小而仍然保持大寡肽的實(shí)質(zhì)上所有的生物活性，并且其有效阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。
“寡肽”與“合成肽”在本申請(qǐng)中可互換使用。在本發(fā)明中所用的寡肽是“分離的”但“生物學(xué)純”的合成肽。
如本文所用，氨基酸殘基的單字母符號(hào)為A(丙氨酸)；R(精氨酸)；N(天冬酰胺)；D(天冬氨酸)；C(半胱氨酸)；Q(谷氨酰胺)；E(谷氨酸)；G(甘氨酸)；H(組氨酸)；I(異亮氨酸)；L(亮氨酸)；K(賴氨酸)；M(甲硫氨酸)；F(苯丙氨酸)；P(脯氨酸)；S(絲氨酸)；T(蘇氨酸)；W(色氨酸)；和Y(酪氨酸)。
氨基酸置換通常是單一殘基的。置換、缺失、插入或其任意組合可聯(lián)合起來以得到寡肽。保守的氨基酸置換包括用具有相似的電荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，例如谷氨酸(E)-天冬氨酸(D)氨基酸置換。非保守的置換包括用具有相異的電荷、大小和/或疏水性的氨基酸替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，例如谷氨酸(E)-纈氨酸(V)置換。本發(fā)明旨在包括寡肽的保守性改變(置換、缺失、插入或其任意組合)，只要阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的有效性實(shí)質(zhì)上未改變。
Rath等人(J Applied Nutr.4462-69，1992；J Orthomolecular Med.811-20，1993)假定具有高親水性最大限度(high hydrophilicitymaxima)和構(gòu)象及電荷的寡肽序列介導(dǎo)多種疾病的發(fā)病機(jī)制。根據(jù)該假定，MMP酶中選擇的氨基酸序列可通過其自身附著于底物中的互補(bǔ)序列而阻斷該酶的作用。這一構(gòu)思完全不同于Liotta及同事所詳細(xì)描述的(U.S.Pat.No.5,372,809)，在后其中寡肽阻斷酶中的鋅分子。試驗(yàn)證據(jù)表明細(xì)胞中不同類型的蛋白的復(fù)合物可改變蛋白在細(xì)胞中的活性(Gavin和同事，Nature 415141-147，2002)，這在本質(zhì)上證實(shí)了以上假定。在此引用的參考文獻(xiàn)以其整體引入作為參考。
在本發(fā)明中，我們鑒定了在MMP-2氨基酸序列中的可能的寡肽序列，并發(fā)現(xiàn)這些寡肽序列有效地干擾MMP-2的功能活性，使用癌細(xì)胞在體外侵襲ECM作為測試模型。
不受任何理論或作用機(jī)制所限，本發(fā)明提供了可有效阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽。
一種作用機(jī)制可能是MMP-2通過特異性結(jié)合位點(diǎn)與靶ECM分子結(jié)合。因此阻斷這些結(jié)合位點(diǎn)可阻止MMP-2結(jié)合其ECM底物分子，抑制對(duì)ECM的破壞，從而防止癌癥和其它疾病擴(kuò)散遍及全身。
已鑒定了MMP-2蛋白中的幾個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)，本發(fā)明提供了這些寡肽序列的合成類似物有效防止ECM破壞。一種治療性寡肽是PRKPKWDK，其顯示出抑制癌細(xì)胞侵襲達(dá)約90％。
本發(fā)明還提供了寡肽在其它MMP相關(guān)疾病中的治療用途。因?yàn)镸MP-2可能使用相同的位點(diǎn)來結(jié)合ECM中的其靶分子，在本發(fā)明中公開的寡肽可類似地干擾其它疾病。因此，在此所要求保護(hù)的合成寡肽的預(yù)防和治療用途并不限于癌癥，而還可用于心血管疾病和其它與MMP破壞ECM相關(guān)的病理狀況。這些寡肽可作為疫苗，作為注射劑、輸液、吸入劑、栓劑或其它可藥用載體和/或遞送方式施用于患者。
施用本發(fā)明的肽和制劑的方法采用多種已知的給藥途徑中的任何途徑，諸如口服、IV、皮下、透皮和局部給藥。本發(fā)明的優(yōu)選方法采用胃腸外給藥的藥物組合物。
本發(fā)明提供了寡肽，其還可用作疫苗以產(chǎn)生抗體，用于測試以診斷涉及MMP(特別是MMP-2)的疾病，以及通過血液測定或其它合適的診斷測定，臨床監(jiān)測該疾病的進(jìn)展或消退。
本發(fā)明涉及有效阻斷癌細(xì)胞侵襲的合成肽。這些物質(zhì)及其抗體的益處是在用于預(yù)防和治療癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的臨床應(yīng)用中的效用。優(yōu)選地，具有SEQ ID.2的氨基酸的合成寡肽用于阻斷癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移。更優(yōu)選地，合成肽包括在藥物制劑中以阻斷癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移。
所述寡肽可以是大約6-大約20個(gè)殘基。最優(yōu)選地，所述寡肽是大約8-大約10個(gè)殘基。最優(yōu)選地，所述合成寡肽含有8個(gè)氨基酸殘基的長度。
優(yōu)選地，合成肽的濃度范圍從1μM至500μM。最優(yōu)選地，合成肽的濃度范圍從50μM至200μM。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用所述合成肽作為免疫原以生成抗體，從而這種生成的抗體可有效阻斷癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移。
優(yōu)選地，所述合成肽含有8個(gè)氨基酸殘基的長度。本發(fā)明的另一個(gè)目的是包括在藥物組合物中的免疫原性寡肽，所述藥物組合物包含可藥用載體和所述寡肽。該寡肽可用作疫苗。包含寡肽的藥物組合物可用于誘導(dǎo)針對(duì)包含具有寡肽序列(例如SEQ.ID.2)的表位的蛋白的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是所述組合物和方法在體內(nèi)和體外實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明提供了具有與人MMP-2蛋白內(nèi)的氨基酸序列類似的氨基酸序列的合成寡肽。
所述合成寡肽的氨基-和/或羧基-末端可分別包含氨基基團(tuán)(--NH2)或羧基(--COOH)基團(tuán)。或者，所述寡肽氨基末端可例如呈現(xiàn)疏水基團(tuán)，包括但不限于羰芐基(carbobenzyl)、丹酰、叔丁氧羰基、癸酰基、萘酰(napthoyl)或其它糖基團(tuán)；乙?；?-芴基甲氧基-羰基(FMOC)基團(tuán)；或經(jīng)修飾的、非天然存在的氨基酸殘基?；蛘撸龊铣晒央聂然┒丝衫绯尸F(xiàn)酰氨基基團(tuán)；叔丁氧羰基；或經(jīng)修飾的、非天然存在的氨基酸殘基?；蛘?，本發(fā)明包括阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的合成寡肽，通過省略在N末端或C末端的氨基酸殘基。本發(fā)明還提供通過置換給定序列之中的氨基酸殘基而不考慮置換殘基的電荷和極性而對(duì)阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽的修飾。
應(yīng)理解本發(fā)明還構(gòu)想肽類似物，其中一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵任選被除酰胺以外的鍵替換，優(yōu)選取代的酰胺或酰胺的等排物。因此，盡管肽中的氨基酸殘基一般描述為氨基酸，并且本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案由肽例示，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在含有非酰胺鍵的實(shí)施方案中，本文所用的術(shù)語“氨基酸”或“殘基”指在結(jié)構(gòu)上與氨基酸側(cè)鏈相類似的其它攜帶雙功能部分的基團(tuán)。此外，氨基酸殘基還可以被封閉或未封閉。
本發(fā)明提供了對(duì)阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽的修飾，通過重復(fù)寡肽序列一或多次，它們中每一個(gè)均共價(jià)結(jié)合到一個(gè)或多個(gè)寡肽重復(fù)。
本發(fā)明提供了通過靜脈內(nèi)應(yīng)用或以另一種治療上可接受的途徑預(yù)防性或治療性應(yīng)用一種或多種所述寡肽直接地和競爭性地減弱或阻斷MMP-2的代謝作用或相互作用。
本發(fā)明提供了預(yù)防性或治療性應(yīng)用一種或多種所述寡肽間接地減弱或阻斷MMP-2的代謝作用或相互作用，通過皮下應(yīng)用或以另一種可接受的方式將其用作為疫苗來刺激可部分或完全阻斷MMP的代謝相互作用的特異性免疫應(yīng)答。優(yōu)選的實(shí)施方案包括MMP-2。
本發(fā)明提供了一種或多種所述寡肽的預(yù)防性或治療性應(yīng)用，其中所述寡肽偶聯(lián)到半抗原以增強(qiáng)免疫應(yīng)答，從而增加治療效力。
本發(fā)明提供了一種或多種所述寡肽的預(yù)防性或治療性應(yīng)用，其功能作為反饋調(diào)節(jié)物以特異性阻止或降低細(xì)胞水平的MMP-2蛋白的合成率。
本發(fā)明提供了一種或多種可阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽作為疫苗以產(chǎn)生特異性抗體用于診斷涉及MMP-2的疾病或臨床監(jiān)測該疾病的進(jìn)展或消退。
本發(fā)明提供了一種或多種阻斷人類疾病的寡肽的用途，所述疾病包括但不限于癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，用于預(yù)防或治療癌癥；例如，預(yù)防或治療感染性疾病、心血管疾病和變性疾病。
本發(fā)明提供了一種或多種阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽用于預(yù)防或治療涉及MMP-2的疾病的用途。
本發(fā)明提供了一種或多種阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的寡肽的用途，其中這些寡肽可作為疫苗，作為注射劑、輸液、吸入劑、栓劑或其它可藥用載體和/或遞送方式施用于患者。
本發(fā)明的組合物可為肽的形式聯(lián)合至少一種其它物質(zhì)，如穩(wěn)定化合物，其可以在任何無菌生物相容性藥學(xué)載體中施用，所述載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖和水。所述組合物可以單獨(dú)或與其它物質(zhì)、藥物或激素聯(lián)合施用于患者。藥學(xué)上可接受的載體還可包括賦形劑和輔劑，其促進(jìn)活性化合物加工成為可藥用的制劑。有關(guān)制劑和給藥技術(shù)的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可見于最新版的“Remington’sPharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，其內(nèi)容全部引入作為參考。藥物組合物可作為鹽提供，并可與許多酸形成，包括但不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。鹽傾向于比相應(yīng)的游離堿形式更易溶于含水溶劑或其它質(zhì)子溶劑。
本發(fā)明提供了寡肽，其還可用作疫苗以生成抗體用于測定，用于診斷涉及MMP(特別是MMP-2)的疾病以及通過血液測定或其它合適的診斷測試臨床監(jiān)測該疾病的進(jìn)展或消退。
以下實(shí)施例旨在例示本發(fā)明的實(shí)施，而不意在限定本發(fā)明的范圍。
寡肽序列用軟件程序識(shí)別鑒定有關(guān)富集帶電荷氨基酸的高親水性最大限度區(qū)域的MMP-2的氨基酸序列。本發(fā)明的寡肽可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)合成或制備。(參見例如Creighton，1983，ProteinsStructures andMolecular Principles，W.H.Freeman and Co.，N.Y.，)，其全部引入本文作為參考。制備并用于本發(fā)明的寡肽列于表1。
這些寡肽對(duì)多種癌細(xì)胞侵襲Matrigel和遷移通過Matrigel膜的抑制作用使用“改良的Matrigel侵襲盒”(Becton Dickinson，USA)來評(píng)價(jià)。由Liotta和同事顯示出具有抗MMP-2活性的寡肽TMRKPRCGNPDVAN用作為寡肽的標(biāo)準(zhǔn)參照。
表1鑒定和用于研究中的多種寡肽序列
一般試驗(yàn)條件所鑒定的寡肽定制合成。然后將它們用于Matrigel侵襲研究。
(a)Matrigel侵襲研究使用“改良的Matrigel侵襲盒”(Becton Dickinson，USA)進(jìn)行該研究。
在對(duì)人黑素瘤細(xì)胞的研究中，將人成纖維細(xì)胞-NHDF(Clonetics)接種于“Matrigel”插入物上并使其達(dá)到匯合。這樣做是為了接近模擬在體內(nèi)圍繞癌細(xì)胞周圍的體內(nèi)條件。然后將人黑素瘤細(xì)胞A2058接種到插入物上。將補(bǔ)充多種水平的所選寡肽的來自成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基加入盒中。將該體系溫育約24小時(shí)。在溫育期結(jié)束時(shí)，擦去插入物上表面上的細(xì)胞。將已侵入Matrigel膜和已遷移至插入物下表面的細(xì)胞用“快速染料”染色并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。通過與對(duì)照(“0”水平的寡肽)相比未遷移通過膜的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算抑制百分比。對(duì)照的抑制活性被認(rèn)為是“0”。保留來自侵襲試驗(yàn)的培養(yǎng)基用于酶譜研究。
在采用人乳腺癌細(xì)胞MCF7的研究中，操作步驟基本上類似于對(duì)黑素瘤細(xì)胞所用的，除了采用MRC5(ATCC)成纖維細(xì)胞代替NHDF。
在采用人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB 231的研究中，將成纖維細(xì)胞-MRC5(ATCC)細(xì)胞接種于孔中。其余操作保持與對(duì)MCF7細(xì)胞的研究相同。
(b)酶譜研究將來自侵襲研究中各孔的培養(yǎng)基(25-30μl)施加于“Novex”酶譜凝膠(Invitrogen)。按制造商所推薦的對(duì)凝膠進(jìn)行展開顯影和染色?；谄湟阎姆肿恿孔R(shí)別鑒定基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)。
實(shí)施例1多種寡肽序列對(duì)黑素瘤細(xì)胞A2058侵襲Matrigel和遷移的抑制作用測試七(7)種寡肽(其氨基酸序列參見表1)對(duì)人黑素瘤癌細(xì)胞侵襲的抑制。具有氨基酸序列PRKPKWDK的寡肽顯示出阻斷活性。具有TMRKPRCGNPDVAN的寡肽顯示出約11％抑制，相比之下，PRKPKWDK顯示出73％抑制(圖1)。
具有氨基酸序列LPPDVQRVD的寡肽VI也具有某些阻斷活性(即約20％)。具有氨基酸序列GDVAPKTDKE的寡肽“I”直至100μM濃度也未顯示出任何活性(未顯示于圖2)，相對(duì)于相同濃度的PRKPKVVDK顯示的63％。
實(shí)施例2寡肽PRKPKWDK對(duì)黑素瘤細(xì)胞A2058侵襲Matrigel和遷移的抑制作用在這些研究中，PRKPKWDK在培養(yǎng)基中的濃度在0-150μM之間變化。觀察到該寡肽進(jìn)行性地抑制黑素瘤細(xì)胞的侵襲(圖3)，從50μM濃度的大約37％，到150μM的73％。
Matrigel膜類似于ECM，癌細(xì)胞突破穿透并遷移至膜的另一側(cè)的能力代表了癌細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移的能力。所述寡肽能顯著降低3種不同類型的癌細(xì)胞的侵襲。在這個(gè)測試體系中，活性是針對(duì)ECM。我們得出結(jié)論，我們的研究由此清楚表明了所述寡肽可干擾體內(nèi)ECM的降解，由此對(duì)其中ECM的崩解是基礎(chǔ)病損的疾病的進(jìn)展產(chǎn)生不利影響。
實(shí)施例3在這些研究中，我們測定了PRKPKWDK對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF7(ATCC)侵襲Matrigel和遷移的抑制作用。如同對(duì)黑素瘤細(xì)胞一樣，該寡肽抑制癌細(xì)胞侵襲。在150μM濃度的抑制為大約70％。在200μM濃度其增加至大約90％(圖4)。
實(shí)施例4在這些研究中，我們研究了PRKPKWDK對(duì)另一種人乳腺癌細(xì)胞-MDA-MB 231的抑制活性。在150μM濃度的抑制為大約94％。
實(shí)施例5我們接下來評(píng)價(jià)了所述寡肽是否能干擾酶在分泌后的作用。酶譜研究未顯示PRKPKWDK對(duì)由多種癌細(xì)胞分泌的MMP-2的量的任何抑制作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
已描述了本發(fā)明的數(shù)種實(shí)施方案。然而，應(yīng)理解可以作出多種修改而不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。因此，其它實(shí)施方案在本申請(qǐng)所要求保護(hù)的發(fā)明的范圍之內(nèi)。
盡管上文已進(jìn)行了相當(dāng)詳細(xì)的闡述，所述序列是為了說明而非限定。在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)的對(duì)以上公開的技術(shù)的修改和改進(jìn)，包括等同方案，包括在所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，關(guān)于以上描述的細(xì)節(jié)，可以作出眾多修改、改變和變化，而不偏離在此描述的發(fā)明構(gòu)思。例如，對(duì)在此描述的基本序列的修飾(化學(xué)的或酶的)也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。例如，所公開的序列可以是二肽或三肽。而且，所公開的序列可以經(jīng)修飾，在肽的氨基或羧基末端包括該殘基。所述序列還可以被化學(xué)修飾以增加其活性(例如對(duì)序列的羧基末端部分的酰胺化)。所述肽可以被化學(xué)修飾以增加其活性(例如對(duì)序列的羧基末端部分的酰胺化或在任一末端包括甘氨酸或丙氨酸殘基)。因此，應(yīng)理解可以作出多種修飾而不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍，并且這種變化應(yīng)視為在如以下權(quán)利要求所述的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.用于阻斷癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的合成寡肽序列，其類似于金屬蛋白酶-2(MMP-2)序列的特異性寡肽序列。
2.權(quán)利要求1的合成寡肽，具有PRKPKWDK的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的合成寡肽，其為約6-約20個(gè)殘基。
4.權(quán)利要求2的合成寡肽，其為約8-約10個(gè)殘基。
5.權(quán)利要求2-4的合成寡肽，其中濃度范圍從1μM-500μM。
6.權(quán)利要求5的合成寡肽，其中濃度范圍從50μM-200μM。
7.前述權(quán)利要求的合成寡肽，具有類似于人MMP-2的氨基酸序列。
8.前述權(quán)利要求的合成寡肽，在N-末端被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基修飾。
9.前述權(quán)利要求1-7的合成寡肽，在C-末端被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基修飾。
10.前述權(quán)利要求1-7的合成寡肽，在N-末端和C-末端被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基修飾。
11.權(quán)利要求1-6的合成寡肽，其中給定序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被置換而不考慮置換殘基的電荷和極性。
12.權(quán)利要求1-6的合成寡肽，其中給定序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被具有相似電荷和/或極性的殘基置換。
13.權(quán)利要求7-12的合成寡肽，經(jīng)兩種或多種所述修飾的修飾。
14.前述權(quán)利要求的合成寡肽，重復(fù)寡肽序列一或多次，它們中每一個(gè)共價(jià)結(jié)合到一個(gè)或多個(gè)寡肽重復(fù)。
15.前述權(quán)利要求1-14的合成寡肽作為免疫原以生成抗體的用途。
16.權(quán)利要求1-14的合成寡肽通過靜脈內(nèi)應(yīng)用或以治療上可接受的方式直接地和競爭性地減弱或阻斷MMP-2的代謝作用或相互作用的用途。
17.權(quán)利要求1-14的合成寡肽間接地減弱或阻斷MMP的代謝作用或相互作用的用途，通過皮下應(yīng)用或以任何其它可接受的方式將其用作為疫苗以刺激可部分或完全阻斷MMP-2的代謝相互作用的特異性免疫應(yīng)答。
18.權(quán)利要求1-17的合成寡肽的用途，其中所述寡肽偶聯(lián)至半抗原以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
19.權(quán)利要求1-18的合成寡肽的用途，其功能作為反饋調(diào)節(jié)物以特異性阻止或降低MMP-2蛋白在細(xì)胞水平的合成率。
20.權(quán)利要求1-19的合成寡肽的用途，作為疫苗以產(chǎn)生特異性抗體用于診斷涉及MMP-2的疾病或臨床監(jiān)測該疾病的進(jìn)展或消退。
21.權(quán)利要求1-20的一種或多種合成寡肽的用途，所述寡肽可阻斷癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，其中這些寡肽可作為疫苗，作為注射劑、輸液、吸入劑、栓劑或其它可藥用載體和/或遞送方式施用于患者。
全文摘要
本發(fā)明涉及本發(fā)明的合成肽，包含相應(yīng)于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP－2)的85－92氨基酸的PRKPKWDK(SEQ ID2)肽，及SEQ ID2的片段、類似物和同源物。本發(fā)明還涉及這種肽作為人癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制物的用途，并進(jìn)一步涉及在預(yù)防和治療癌癥和其它與MMP降解胞外基質(zhì)有關(guān)的病理狀況中的治療應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K9/02GK1622992SQ03802689
公開日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2003年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月23日
發(fā)明者馬蒂亞斯·拉特, 施朗·奈克, 阿萊克斯圣德拉·尼德茲維克 申請(qǐng)人:馬蒂亞斯·拉特