標(biāo)記的hsp90抑制劑的用途
【專利摘要】本發(fā)明證明了不僅僅是由HSP90表達(dá)決定的此具體“致癌HSP90”物質(zhì)的豐度預(yù)測(cè)對(duì)HSP90抑制療法的敏感性并且因此是HSP90療法的生物標(biāo)記物。本發(fā)明還證明了鑒別和測(cè)量腫瘤內(nèi)此致癌HSP90物質(zhì)的豐度預(yù)測(cè)對(duì)HSP90療法的反應(yīng)?！爸掳〩SP90”在本文中定義為代表伴隨蛋白復(fù)合物的細(xì)胞應(yīng)激特定形式的HSP90部分，其在腫瘤細(xì)胞環(huán)境下擴(kuò)增并且組成性維持，并且可以執(zhí)行維持惡性表型所需的功能。所述作用不僅調(diào)節(jié)過(guò)度表達(dá)（即HER2）、突變（即mB-Raf）或嵌合蛋白（即Bcr-Abl）的折疊，而且還促進(jìn)與異常活化信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物（即STAT5、BCL6）相關(guān)的分子的架構(gòu)和復(fù)合物形成。
【專利說(shuō)明】標(biāo)記的HSP90抑制劑的用途
[0001]相關(guān)申請(qǐng)案的交叉引用
[0002]根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)，本申請(qǐng)案要求于2011年7月8日提出的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/506,010號(hào)的權(quán)益，所述臨時(shí)申請(qǐng)案的所有內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。

【背景技術(shù)】
[0003]為了維持穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞采用復(fù)雜的分子機(jī)器，這些分子機(jī)器由數(shù)以千計(jì)的被程序化以執(zhí)行明確的功能的蛋白質(zhì)構(gòu)成。通過(guò)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤表達(dá)或突變的這些通路調(diào)節(jié)異常會(huì)產(chǎn)生賦予惡性表型的生物優(yōu)勢(shì)。雖然在細(xì)胞水平下，所述調(diào)節(jié)異?？赡苁怯幸娴?即有利于提高存活率)，但在分子水平下，此需要細(xì)胞投入能量來(lái)維持這些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能。相信為了將這些蛋白質(zhì)維持在假穩(wěn)定狀態(tài)，癌細(xì)胞指派分子伴隨蛋白，包括HSP9032’33。
[0004]支持此假設(shè)，HSP90被公認(rèn)為在維持轉(zhuǎn)化的表型中起到重要的作用32’33。HSP90和其相關(guān)輔助伴隨蛋白幫助統(tǒng)稱為“客戶蛋白”的細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的構(gòu)象折疊，許多這些蛋白是控制細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、DNA破壞反應(yīng)和細(xì)胞存活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的效應(yīng)物。因此，腫瘤細(xì)胞對(duì)失調(diào)蛋白質(zhì)的依賴(即通過(guò)突變、異常表達(dá)、不當(dāng)?shù)募?xì)胞移位等)可能變得決定性地依賴于HSP9033。
[0005]在各種形式的癌癥中HSP90療法的基本原理目前由包括在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)療法具有抗性的疾病內(nèi)的臨床前和臨床研究很好地支持9卜97。舉例來(lái)說(shuō)，研究已經(jīng)證明某些HER2+腫瘤對(duì)HSP90抑制劑的顯著敏感性98’99。在這些腫瘤中，17-AAG (又稱為坦螺旋霉素(Tanespimycin))和17- DMAG (阿螺旋霉素(Alvespimycin))甚至引起反應(yīng),并且特別是在曲妥珠單抗療法(trastuzumab therapy)后的進(jìn)行性疾病患者中98。例如PU-H71等其它HSP90抑制劑，在許多三陰性乳癌小鼠模型中進(jìn)行臨床前測(cè)試時(shí)，提供了至今在此難以治療的癌癥亞型中所報(bào)導(dǎo)的最有效的靶向單一藥劑抗腫瘤作用1Q°。
[0006]雖然這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈地支持HSP90抑制劑用于癌癥中，但此刻關(guān)于如何鑒別最可能受益于HSP90療法的那些患者沒(méi)有清晰的一致意見(jiàn)皿’1(12。此尤其成問(wèn)題，眾所周知對(duì)于靶向藥劑的成功開(kāi)發(fā)來(lái)說(shuō)，最基本的是確定應(yīng)接收藥物的患者亞群(即，具有EGFR突變的腫瘤對(duì)它賽瓦(tarceva))。所述選擇可以減少接收低效治療的患者數(shù)目并且減少在晚期臨床試驗(yàn)中無(wú)效的靶向腫瘤學(xué)藥劑的交錯(cuò)數(shù)目。
[0007]此外，沒(méi)有臨床分析可以非侵入性地確定HSP90標(biāo)靶抑制。雖然外周血淋巴細(xì)胞的藥效監(jiān)測(cè)已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中提供了 HSP90抑制劑的體內(nèi)生物活性的易得且可再現(xiàn)指標(biāo)，但在正常組織中的藥效并不預(yù)測(cè)腫瘤比活性97’1(11’1(12。明智地使用活組織檢查來(lái)測(cè)量藥效變化仍然是一種分析標(biāo)靶調(diào)節(jié)的重要方式，但此種方法由于與侵入性分析有關(guān)的邏輯和倫理問(wèn)題而仍然是受限制的。作為一種替代方案，目前使用鋯89標(biāo)記的抗體研究腫瘤HER2水平和VEGF水平的變化1(13’1(14，以及通過(guò)ELISA研究患者血清中可溶性HER2胞外域水平的變化1(15，但這些研究限于表達(dá)這些生物標(biāo)記物的乳房腫瘤的子集。
[0008]因此，在HSP90靶向療法中對(duì)生物標(biāo)記物有強(qiáng)烈的需要:大部分癌癥患者用新穎的實(shí)驗(yàn)性療法治療，在很多情況下幾乎不了解特定藥劑的作用機(jī)制、不同疾病子集的具體治療的適合性并且?guī)缀醪恢啦煌瑦盒员尘跋轮委焺┑淖罴褎┝亢蜁r(shí)程安排。最終結(jié)果是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)的臨床研究，其中難治性惡性疾病患者在不知道哪一種治療方法對(duì)不同的臨床背景為最佳的情況下用一連串的新穎藥劑治療。
[0009]HSP90是一種在癌癥中備受追捧的標(biāo)靶，此是因?yàn)樗诜€(wěn)定和折疊與致癌性轉(zhuǎn)化有關(guān)的蛋白質(zhì)中起到關(guān)鍵作用。鑒于其可能降解許多不同的癌蛋白和影響多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，已經(jīng)假設(shè)HSP90抑制劑(HSP90i)在多種癌癥中是有效的。雖然早期臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)此方法在腫瘤子集中的治療可能性，但找到生物標(biāo)記物來(lái)預(yù)測(cè)哪些癌癥和患者群體將對(duì)所述治療最敏感已經(jīng)證明是挑戰(zhàn)性的。所述對(duì)充足的患者群體的了解缺乏和選擇已經(jīng)導(dǎo)致大量新興的HSP90癌癥治療劑進(jìn)展緩慢或無(wú)法繼續(xù)開(kāi)發(fā)。因此迫切需要立即嘗試針對(duì)HSP90療法鑒別反應(yīng)群體和開(kāi)發(fā)伴隨診斷性分析。
[0010]在HSP90療法中對(duì)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤功效所需要的適當(dāng)劑量和時(shí)程的設(shè)計(jì)也缺乏了解。血漿藥物動(dòng)力學(xué)一般提供有益于治療劑給藥設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)，其中血漿曲線下面積(AUC)通常作為全身性藥物暴露的量度。然而，對(duì)于HSP90抑制劑，腫瘤組織中而不是血液中藥物滯留的濃度和持續(xù)時(shí)間決定它們的抗腫瘤作用1(16-1(19。確切地說(shuō)，大部分HSP90抑制劑特征是從血漿和正常組織迅速清除，但在腫瘤內(nèi)相對(duì)長(zhǎng)時(shí)間藥物滯留(即投藥后12-48小時(shí)內(nèi))的非典型的藥物動(dòng)力學(xué)型態(tài)。因而，如果反應(yīng)與注入劑量而不是腫瘤劑量相關(guān)，那么對(duì)HSP90療法的腫瘤反應(yīng)的臨床了解嚴(yán)重地受到限制。血漿藥物動(dòng)力學(xué)有限的價(jià)值和腫瘤劑量對(duì)腫瘤反應(yīng)的重要性表明需要臨床開(kāi)發(fā)一種對(duì)HSP90抑制劑的腫瘤藥物動(dòng)力學(xué)的分析。腫瘤HSP90的驗(yàn)證的臨床上實(shí)踐的非侵入性分析將能夠?qū)⒅委焺┙o藥集中于實(shí)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)的腫瘤藥物濃度，而不是替代的穩(wěn)態(tài)血漿濃度。所述分析可以指示在等于或低于最高許可劑量下，是否可以實(shí)現(xiàn)治療有效腫瘤濃度。在相反情況下，患者可以實(shí)行一種替代治療，使他們?cè)跓o(wú)臨床益處下無(wú)需暴露于可能的藥物毒性。
[0011]為了克服與HSP90療法有關(guān)的這些限制，這里設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)了一種所提出的非侵入性分析，它將推動(dòng)HSP90抑制劑在癌癥中的最佳臨床實(shí)施、開(kāi)發(fā)和使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明提供了使用標(biāo)記的HSP90抑制劑改善使用HSP90抑制劑治療癌癥患者的方法。
[0013]本發(fā)明證明了不僅僅是由HSP90表達(dá)決定的此具體“致癌HSP90”物質(zhì)的豐度預(yù)測(cè)對(duì)HSP90抑制療法的敏感性并且因此是HSP90療法的生物標(biāo)記物。本發(fā)明還證明了鑒別和測(cè)量腫瘤內(nèi)此致癌HSP90物質(zhì)的豐度預(yù)測(cè)對(duì)HSP90療法的反應(yīng)。“致癌HSP90”在本文中定義為代表伴隨蛋白復(fù)合物的細(xì)胞應(yīng)激特定形式的HSP90部分，其在腫瘤細(xì)胞環(huán)境下擴(kuò)增并且組成性維持，并且可以執(zhí)行維持惡性表型所需的功能。所述作用不僅調(diào)節(jié)過(guò)度表達(dá)(即HER2)、突變(即mB-Raf)或嵌合蛋白(即Bcr-Abl)的折疊，而且還促進(jìn)與異?；罨盘?hào)傳導(dǎo)復(fù)合物(即STAT5、BCL6)相關(guān)的分子的架構(gòu)和復(fù)合物形成。雖然腫瘤存活變得依賴于HSP90-癌蛋白的網(wǎng)絡(luò)，但這些蛋白質(zhì)在功能和穩(wěn)定性上變得依賴于“致癌HSP90”。此共生性互相依賴表明腫瘤對(duì)HSP90癌蛋白的依賴等同于對(duì)“致癌HSP90”的依賴。測(cè)量后者的豐度是第一讀數(shù)，因此，根據(jù)本發(fā)明，是HSP90療法富集的生物標(biāo)記物。
[0014]此外，展示HSP90在惡性細(xì)胞中形成生物化學(xué)不同的復(fù)合物。癌細(xì)胞HSP90的主要部分保留類似于正常細(xì)胞的“管家”伴侶功能，而癌細(xì)胞中富集或擴(kuò)增的功能上不同的HSP90池(B卩，“致癌HSP90”)特異性地與維持腫瘤細(xì)胞存活、異常增生特征以及侵入和轉(zhuǎn)移行為所需的癌蛋白相互作用。
[0015]為了以逐腫瘤的方式測(cè)量“致癌HSP90”的豐度，本發(fā)明還提供了化學(xué)工具。所述工具包括熒光標(biāo)記和ANCA標(biāo)記的HSP90抑制劑、生物素標(biāo)記的HSP90抑制劑和放射性標(biāo)記的抑制劑，它們特異性地鑒別此腫瘤“致癌HSP90”物質(zhì)并且與其相互作用，這使得可以測(cè)量不同類型的腫瘤、腫瘤細(xì)胞、腫瘤支持細(xì)胞和腫瘤相關(guān)生物形式中(例如血液科惡性疾病、實(shí)體腫瘤和液體腫瘤中)“致癌HSP90”物質(zhì)的豐度，并且因此測(cè)量和預(yù)測(cè)對(duì)HSP90抑制療法的敏感性。這些可以呈但不限于實(shí)體或液體腫瘤中的癌細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、腫瘤支持免疫細(xì)胞、外來(lái)體和腫瘤支持祖細(xì)胞的形式。
[0016]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于確定腫瘤是否將可能對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含以下步驟:
[0017](a)使所述腫瘤或含有來(lái)自所述腫瘤的細(xì)胞的樣品與優(yōu)先結(jié)合于腫瘤或腫瘤細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的可檢測(cè)地標(biāo)記的HSP90抑制劑接觸；
[0018](b)測(cè)量結(jié)合于所述腫瘤或所述樣品中所述腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記的HSP90抑制劑的量；以及
[0019](c)將步驟(b)中測(cè)量的結(jié)合于所述腫瘤或所述樣品中所述腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記的HSP90抑制劑的量與結(jié)合于參考的標(biāo)記的HSP90抑制劑的量比較；
[0020]其中步驟(b)中測(cè)量的結(jié)合于所述腫瘤或所述腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記的HSP90抑制劑的量比參考量大表明所述腫瘤將可能對(duì)所述HSP90抑制劑起反應(yīng)。
[0021]在一個(gè)實(shí)施例中，參考細(xì)胞來(lái)自患有腫瘤的相同患者的細(xì)胞。參考細(xì)胞可以是來(lái)自癌癥患者的正常細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，正常細(xì)胞可以是來(lái)自患有血液腫瘤的患者的淋巴細(xì)胞、來(lái)自具有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的患者或?qū)嶓w腫瘤周圍的正常組織的白血球。在另一實(shí)施例中，參考細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞或來(lái)自癌癥患者的幾乎不表達(dá)致癌HSP90的另一細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，參考細(xì)胞來(lái)自與患有腫瘤的患者不同的患者的細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，參考細(xì)胞可以來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞或來(lái)自除待測(cè)量的患有腫瘤的患者以外的癌癥患者的幾乎不表達(dá)致癌HSP90的細(xì)胞。
[0022]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于確定腫瘤是否將可能對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含以下步驟:
[0023](a)使所述腫瘤或含有來(lái)自所述腫瘤的細(xì)胞的樣品與優(yōu)先結(jié)合于腫瘤或腫瘤細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的第一可檢測(cè)地標(biāo)記的HSP90抑制劑和最低程度或不結(jié)合于所述HSP90的腫瘤特異性形式的第二可檢測(cè)地標(biāo)記的抑制劑接觸；
[0024](b)測(cè)量結(jié)合于所述腫瘤或所述樣品中所述腫瘤細(xì)胞的第一標(biāo)記的抑制劑和第二標(biāo)記的抑制劑的量；以及
[0025](C)將結(jié)合于所述腫瘤或所述腫瘤細(xì)胞的第一標(biāo)記的抑制劑的量與結(jié)合于所述腫瘤或腫瘤細(xì)胞的第二標(biāo)記的抑制劑的量比較，
[0026]其中結(jié)合于所述腫瘤或腫瘤細(xì)胞的第一標(biāo)記的抑制劑的量比結(jié)合于所述腫瘤或腫瘤細(xì)胞的第二標(biāo)記的抑制劑大表明所述腫瘤將可能對(duì)所述HSP90抑制劑起反應(yīng)。
[0027]在一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)記的HSP90抑制劑是可滲透細(xì)胞并且選擇性地結(jié)合于“致癌HSP90”的熒光標(biāo)記或ANCA標(biāo)記的抑制劑。舉例來(lái)說(shuō)，提供HSP90抑制劑PU-H71的不同的熒光標(biāo)記和ANCA標(biāo)記型式，其已經(jīng)針對(duì)用于流式細(xì)胞術(shù)，以及用于分析在實(shí)體或液體腫瘤中發(fā)現(xiàn)或從中分離的癌細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、腫瘤支持免疫細(xì)胞、外來(lái)體和腫瘤支持祖細(xì)胞，以及用于通過(guò)例如活組織檢查、手術(shù)和細(xì)針吸取等若干介入方法獲得的樣品的組織染色而最佳化。
[0028]在一種所述實(shí)施例中，展示例如TO-H71-FITC2 (部分5.2.1.1.)等熒光標(biāo)記的抑制劑可以用于測(cè)量從例如活組織檢查和手術(shù)樣品等來(lái)源中獲得的組織中“致癌HSP90”的豐度。在另一實(shí)施例中，展示例如TO-H71-FITC2等熒光標(biāo)記的抑制劑可以用于測(cè)量建立的癌細(xì)胞系或原代癌細(xì)胞中“致癌HSP90”的豐度。在另一實(shí)施例中，展示熒光標(biāo)記的抑制劑可以用于測(cè)量從例如來(lái)自腫瘤等癌癥樣品中分離的細(xì)胞中、癌癥干細(xì)胞中、循環(huán)腫瘤細(xì)胞中和從細(xì)針吸取中獲得的癌細(xì)胞中“致癌HSP90”的豐度。在其它實(shí)施例中，展示也適用于進(jìn)行以上提及的測(cè)量的其它熒光標(biāo)記、ANCA標(biāo)記和生物素標(biāo)記的HSP90抑制劑。
[0029]在另一實(shí)施例中，標(biāo)記的HSP90抑制劑是選擇性地結(jié)合于“致癌HSP90”的放射性標(biāo)記的抑制劑。舉例來(lái)說(shuō)，放射性標(biāo)記的PU-H71的不同型式已經(jīng)針對(duì)PET成像而最佳化。在一特定實(shí)施例中，PU-H71的碘124放射性標(biāo)記的型式用于實(shí)體和液體腫瘤的PET成像。放射性標(biāo)記的抑制劑可用于使許多類型的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥成像，包括(但不限于)結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、甲狀腺癌、基底細(xì)胞癌、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、前列腺癌、包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的肺癌、乳癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、包括胃腸道基質(zhì)腫瘤在內(nèi)的胃腸道癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、肛門癌、包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤在內(nèi)的腦腫瘤、包括濾泡性淋巴瘤和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤在內(nèi)的淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、骨髓增生性贅生物以及包括卵巢癌、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌在內(nèi)的婦科癌癥。
[0030]本發(fā)明進(jìn)一步提供了以逐腫瘤的方式測(cè)量例如(但不限于)上列的那些腫瘤等實(shí)體腫瘤中和例如(但不限于)與淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和骨髓增生性贅生物有關(guān)的液體腫瘤等液體腫瘤中“致癌HSP90”的豐度的方式。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明展示通過(guò)使用特異性地與“致癌HSP90”相互作用的碘124標(biāo)記的HSP90抑制劑，可使用非侵入性PET成像并且定量患者中、實(shí)體腫瘤和液體腫瘤中的“致癌HSP90”。
[0031]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于確定患有例如血液癌癥(例如白血病)等血液科惡性疾病的患者是否將可能對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含:使含有來(lái)自所述患者的癌細(xì)胞的樣品和參考非癌細(xì)胞與優(yōu)先結(jié)合于患者癌細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的可滲透細(xì)胞的熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑接觸，測(cè)量結(jié)合于所述樣品中所述癌細(xì)胞和非癌癥的熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量，并且將結(jié)合于所述癌細(xì)胞的所述熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量與結(jié)合于所述非癌細(xì)胞的所述熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量比較，其中結(jié)合于所述癌細(xì)胞的熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量大于所述非癌細(xì)胞表明所述腫瘤將可能對(duì)所述HSP90抑制劑起反應(yīng)。
[0032]在一種所述實(shí)施例中，參考正常細(xì)胞是來(lái)自與癌細(xì)胞相同的患者的正常細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞)。在另一實(shí)施例中，參考非癌細(xì)胞是從與癌癥患者不同的患者中獲得。
[0033]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于確定患有實(shí)體腫瘤的患者是否將可能對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含:使含有來(lái)自患者的癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞(例如周圍基質(zhì)、良性細(xì)胞或樣品中的其它類型正常細(xì)胞)的樣品(例如從活組織檢查、手術(shù)、細(xì)針吸取或其它介入程序中獲得)與優(yōu)先結(jié)合于所述患者的癌細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的可滲透細(xì)胞的熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑接觸，測(cè)量結(jié)合于所述樣品中所述癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞的熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量，并且將結(jié)合于所述癌細(xì)胞的所述熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量與結(jié)合于所述非癌細(xì)胞的所述熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量比較，其中結(jié)合于所述癌細(xì)胞的熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量大于所述非癌細(xì)胞表明所述腫瘤將可能對(duì)所述HSP90抑制劑起反應(yīng)。
[0034]本發(fā)明還提供了一種用于確定患有實(shí)體腫瘤的患者是否將可能對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含:使含有來(lái)自所述患者的循環(huán)癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞(例如白血球)的樣品與優(yōu)先結(jié)合于所述患者的癌細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的可滲透細(xì)胞的突光標(biāo)記的HSP90抑制劑接觸,測(cè)量結(jié)合于所述樣品中所述癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞的突光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量，并且將結(jié)合于所述癌細(xì)胞的所述熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量與結(jié)合于所述非癌細(xì)胞的所述熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量比較，其中結(jié)合于所述癌細(xì)胞的熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量大于所述非癌細(xì)胞表明所述腫瘤將可能對(duì)所述HSP90抑制劑起反應(yīng)。
[0035]在一替代性實(shí)施例中，參考非癌細(xì)胞是從除患有腫瘤的患者以外的患者中獲得。
[0036]在另一方面，本發(fā)明提供了使用放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑確定將對(duì)HSP90抑制療法敏感的患者的方法。
[0037]在一個(gè)所述實(shí)施例中，本發(fā)明提供了用于確定患有可成像腫瘤的癌癥患者是否將可能對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含以下步驟:
[0038](a)向所述患者投予優(yōu)先結(jié)合于所述腫瘤中或所述腫瘤的腫瘤細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑；
[0039](b)在步驟(a)中所述投予后一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)量所述患者的腫瘤對(duì)所述放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑的吸收；
[0040](c)在步驟(a)中所述投予后所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)量所述患者的預(yù)定健康組織或血液對(duì)所述放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑的吸收；
[0041](d)計(jì)算步驟(b)中在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的吸收與步驟(C)中相同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的吸收的比率；以及
[0042](e)確定所述癌癥患者將對(duì)使用所述HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的可能性，其中在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)步驟(d)中計(jì)算的比率超過(guò)2表明所述患者將可能起反應(yīng)。
[0043]在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用于確定患有可成像腫瘤的癌癥患者是否將可能對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含以下步驟:
[0044](a)向所述患者投予優(yōu)先結(jié)合于所述腫瘤中或所述腫瘤的腫瘤細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑；
[0045](b)在步驟(a)中所述投予后4小時(shí)以上的一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)量所述患者的腫瘤對(duì)所述放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑的吸收，
[0046]其中相對(duì)于所述腫瘤周圍的健康組織中的吸收，在所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)所述抑制劑的吸收表明所述患者將可能對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)。
[0047]在又一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用于確定可成像腫瘤是否將可能對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含以下步驟:
[0048](a)向所述患者投予優(yōu)先結(jié)合于所述腫瘤中或所述腫瘤的腫瘤細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑；
[0049](b)在步驟(a)中所述放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑投予后2個(gè)小時(shí)或2個(gè)小時(shí)以上的一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)通過(guò)PET目視檢查所述放射性標(biāo)記的抑制劑在所述腫瘤中或在所述腫瘤的腫瘤細(xì)胞中的吸收，
[0050](c)將步驟(b)中獲得的PET影像與在所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)在所述腫瘤周圍的健康組織中獲得的PET影像比較；
[0051]其中在所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)所述腫瘤中或所述腫瘤的腫瘤細(xì)胞中PET影像中的明亮區(qū)域的存在表明所述患者將可能對(duì)HSP90抑制療法起反應(yīng)。
[0052]在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用于確定患有表達(dá)致癌HSP90的腫瘤的特定癌癥患者是否將可能對(duì)使用界定劑量的HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含以下步驟:
[0053](a)向所述患者投予優(yōu)先結(jié)合于所述腫瘤中或所述腫瘤的腫瘤細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的所述HSP90抑制劑的放射性標(biāo)記形式；
[0054](b)在步驟(a)中所述投予后一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)量所述患者的腫瘤對(duì)所述HSP90抑制劑的所述放射性標(biāo)記形式的吸收；
[0055](C)基于步驟(b)中在所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的吸收,針對(duì)所述HSP90抑制劑的界定劑量，計(jì)算在所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)中的每一個(gè)在所述患者的腫瘤中存在的所述HSP90抑制劑的濃度；以及
[0056](d)將步驟(C)中計(jì)算的所述HSP90抑制劑的濃度與在所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)在腫瘤中存在的使所述HSP90抑制劑有效治療所述腫瘤所需的所述HSP90抑制劑的參考濃度比較，
[0057]其中如果步驟(C)中計(jì)算的所述HSP90抑制劑的濃度將等于或超過(guò)有效治療所述腫瘤所需的所述HSP90抑制劑的濃度，那么所述患者將可能對(duì)使用所述界定劑量的HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)。
[0058]在另一方面，展示放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑可以用于確定HSP90抑制劑的有效劑量和給藥時(shí)程。
[0059]在一個(gè)所述實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用于確定患有表達(dá)致癌HSP90的腫瘤的特定癌癥患者是否將可能對(duì)使用界定劑量的HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含以下步驟:
[0060](a)向所述患者投予優(yōu)先結(jié)合于所述腫瘤中或所述腫瘤的腫瘤細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的所述HSP90抑制劑的放射性標(biāo)記形式；
[0061](b)在步驟(a)中所述投予后一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)量所述患者的腫瘤對(duì)所述HSP90抑制劑的所述放射性標(biāo)記形式的吸收；
[0062](C)基于步驟(b)中在所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的吸收,針對(duì)所述HSP90抑制劑的界定劑量，計(jì)算在所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)中的每一個(gè)在所述患者的腫瘤中存在的所述HSP90抑制劑的濃度；以及
[0063]Cd)將步驟(C)中計(jì)算的所述腫瘤對(duì)所述HSP90抑制劑的暴露與在所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)在所述腫瘤中存在的使所述HSP90抑制劑有效治療所述腫瘤所需的對(duì)所述HSP90抑制劑的參考暴露比較，
[0064]其中如果步驟(C)中計(jì)算的所述腫瘤對(duì)所述HSP90抑制劑的暴露將等于或超過(guò)有效治療所述腫瘤所需的所述腫瘤對(duì)所述HSP90抑制劑的暴露，那么所述患者將可能對(duì)使用所述界定劑量的HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)。
[0065]額外的實(shí)施例包括一種用于確定使用HSP90抑制劑的療法對(duì)于患有可成像腫瘤的特定癌癥患者投予的有效劑量和頻率的方法；一種用于確定癌癥患者中可成像腫瘤中存在的HSP90抑制劑的濃度的方法；以及一種用于確定或監(jiān)測(cè)癌癥患者中腫瘤對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法。
[0066]在又一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用于確定使用HSP90抑制劑的療法對(duì)于患有表達(dá)致癌HSP90的腫瘤的特定癌癥患者投予的有效劑量和頻率的方法，其包含以下步驟:
[0067](a)向所述患者投予優(yōu)先結(jié)合于腫瘤或腫瘤細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的所述HSP90抑制劑的放射性標(biāo)記形式；
[0068](b)在步驟(a)中所述投予后一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)量所述患者的腫瘤對(duì)所述HSP90抑制劑的所述放射性標(biāo)記形式的吸收；以及
[0069](C)基于步驟(b)中在所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的吸收，計(jì)算在所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)中的每一個(gè)維持所述腫瘤中有效治療所述腫瘤的所述HSP90抑制劑的濃度所需的投予劑量和頻率，由此確定使用所述HSP90抑制劑的療法對(duì)于所述癌癥患者投予的有效劑量和頻率。
[0070]在又一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用于確定使用HSP90抑制劑的療法對(duì)于患有表達(dá)致癌HSP90的腫瘤的特定癌癥患者投予的有效劑量和頻率的方法，其包含以下步驟:
[0071](a)向所述患者投予優(yōu)先結(jié)合于腫瘤或腫瘤細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的所述HSP90抑制劑的放射性標(biāo)記形式；
[0072](b)在步驟(a)中所述投予后一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)量所述患者的腫瘤對(duì)所述HSP90抑制劑的所述放射性標(biāo)記形式的吸收；以及
[0073](C)基于步驟(b)中在所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的吸收，計(jì)算在治療時(shí)期內(nèi)維持所述腫瘤中有效治療所述腫瘤的所述HSP90抑制劑的平均腫瘤濃度所需的投予劑量和頻率，由此確定使用所述HSP90抑制劑的療法對(duì)于所述癌癥患者投予的有效劑量和頻率。
[0074]在又一方面，本發(fā)明提供了一種用于確定癌癥患者中表達(dá)致癌HSP90的腫瘤中存在的HSP90抑制劑的濃度的方法，其包含以下步驟:
[0075]Ca)向所述患者共投予預(yù)定量的所述HSP90抑制劑和一定量的所述HSP90抑制劑的放射性標(biāo)記形式，所述HSP90抑制劑優(yōu)先結(jié)合于腫瘤或腫瘤細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式；
[0076](b)在步驟(a)中所述共投予后一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)周期性地測(cè)量所述患者的腫瘤對(duì)所述放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑的吸收；以及
[0077](C)基于步驟(b)中所述放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑的吸收的測(cè)量，確定在任何所述時(shí)間點(diǎn)所述腫瘤中存在的所述HSP90抑制劑的濃度。
[0078]在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于確定癌癥患者中表達(dá)致癌HSP90的腫瘤對(duì)使用HSP90抑制劑的療法的反應(yīng)的方法，其包含以下步驟:
[0079](a)在所述患者接收所述HSP90抑制劑作為療法的時(shí)期內(nèi)一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)向所述患者投予優(yōu)先結(jié)合于腫瘤或腫瘤細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的所述HSP90抑制劑的放射性標(biāo)記形式；
[0080](b)在步驟(a)中所述投予后所述一個(gè)或一個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)測(cè)量所述患者的腫瘤中所述放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑的濃度；以及
[0081](c)將步驟(b)中測(cè)量的所述放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑的濃度與有效治療所述腫瘤所需的所述HSP90抑制劑的最小濃度比較，其中測(cè)量的濃度超過(guò)治療所述腫瘤所需的最小值表明所述患者可能對(duì)使用所述HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)。
[0082]在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于確定罹患神經(jīng)變性疾病的患者是否將可能對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含以下步驟:
[0083](a)使腦與優(yōu)先結(jié)合于所述患者的腦細(xì)胞中存在的HSP90的病原性形式的放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑接觸；
[0084](b)測(cè)量結(jié)合于樣品中腦細(xì)胞的標(biāo)記的HSP90抑制劑的量；以及
[0085](c)將步驟(b)中測(cè)量的結(jié)合于樣品中腦細(xì)胞的標(biāo)記的HSP90抑制劑的量與參考量比較；
[0086]其中步驟(b)中測(cè)量的結(jié)合于腦細(xì)胞的標(biāo)記的HSP90抑制劑的量比參考量大表明所述患者將可能對(duì)所述HSP90抑制劑起反應(yīng)。
[0087]在另一方面，本發(fā)明提供了用HSP90抑制劑PU-H71治療HSP90依賴性癌癥的方法。在特定實(shí)施例中，提供治療HSP90依賴性癌癥的方法以實(shí)現(xiàn)PU-H71的特定腫瘤暴露。在其它實(shí)施例中，提供TO-H71的新穎給藥方案。
[0088]在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于確定患者中存在的人類癌癥是否將可能對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含:
[0089](a)獲得含有來(lái)自患者癌癥的細(xì)胞的樣品，所述細(xì)胞僅僅表達(dá)HSP90蛋白質(zhì)或除HSP70蛋白質(zhì)外還表達(dá)HSP90蛋白質(zhì)；
[0090](b)針對(duì)步驟(a)中獲得的所述樣品中存在的所述細(xì)胞，評(píng)估至少一個(gè)以下參數(shù)的存在:活化AKT通路、PTEN腫瘤抑制因子功能或表達(dá)的缺陷、活化STAT5通路或Bcl_xL蛋白質(zhì)表達(dá)；以及
[0091](C)將步驟(b)中獲得的所述評(píng)估與步驟(b)中評(píng)估的相同參數(shù)對(duì)于來(lái)自對(duì)使用所述HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的一個(gè)或一個(gè)以上癌癥患者的人類癌細(xì)胞的預(yù)定參考評(píng)估比較，以便由此確定所述患者的癌癥是否將可能對(duì)使用所述HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)。
[0092]在一個(gè)實(shí)施例中，相當(dāng)關(guān)注此特定方法的使用的人類癌癥是乳癌、胰腺癌和急性骨髓白血病。
[0093]用于評(píng)估每一參數(shù)的方法在所屬領(lǐng)域中眾所周知并且容易獲得。然而，先前尚未展示一個(gè)或一個(gè)以上這些特定參數(shù)與預(yù)測(cè)HSP90抑制劑功效的相關(guān)性。雖然理論上單個(gè)參數(shù)可足以能夠使技術(shù)熟練的行業(yè)者預(yù)測(cè)任何既定HSP90抑制劑的功效，但更可能需要考慮至少2個(gè)、或許至少3個(gè)或3個(gè)以上或甚至所有這些參數(shù)來(lái)對(duì)功效作一個(gè)可靠的預(yù)測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0094]圖1.PU-H71優(yōu)先與在癌細(xì)胞中更豐富的HSP90的限定部分相互作用。(a)使用H9010 (一種抗-HSP90抗體)的連續(xù)免疫純化步驟耗盡MDA-MB-468細(xì)胞提取物中的HSP90。溶解產(chǎn)物=對(duì)照細(xì)胞提取物。(b)來(lái)自MDA-MB-468提取物的HSP90通過(guò)連續(xù)的化學(xué)和免疫純化步驟分離。每一池中HSP90的量都通過(guò)密度測(cè)定法定量并且值相對(duì)于內(nèi)標(biāo)歸一化。
(c)在指示的細(xì)胞中用1311-PU-H71進(jìn)行飽和度研究。對(duì)所有分離的細(xì)胞樣品計(jì)數(shù)并且確定1311-PU-H71的特定吸收。這些數(shù)據(jù)相對(duì)于1311-PU-H71的濃度繪圖以得到飽和結(jié)合曲線。呈現(xiàn)四個(gè)分開(kāi)的重復(fù)研究的代表性數(shù)據(jù)(下圖)。指示的細(xì)胞中HSP90的表達(dá)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析(上圖)。(d)原代AML和CML⑶34+臍帶血細(xì)胞(CB)或K562細(xì)胞用指示劑量的PU-H71預(yù)處理24小時(shí)。處理后的細(xì)胞用I μ MPU-FITC處理。PU-FITC與細(xì)胞的結(jié)合通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估并且表示為平均熒光強(qiáng)度(MFI)。TEG-FITC作為非特異性結(jié)合對(duì)照展示。使用⑶45對(duì)比SSC的門控將結(jié)合于胚細(xì)胞或淋巴細(xì)胞與原代樣品區(qū)分。(e)在指示劑量的PU-H71下原代AML和CMIXD34+CB或K562細(xì)胞在處理后相對(duì)于未處理的對(duì)照的活力％。細(xì)胞活力通過(guò)在處理后96小時(shí)膜聯(lián)蛋白V/7-AAD染色來(lái)評(píng)估。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值+ SE (n=3)。
[0095]圖2.PU-H71對(duì)與癌蛋白和輔助伴隨蛋白呈復(fù)合物的HSP90具有選擇性且分離其。(a)K562提取物中的HSP90復(fù)合物通過(guò)用H9010(—種非特異性IgG)沉淀或通過(guò)PU-H71-珠?；?qū)φ罩榱７蛛x。對(duì)照珠粒含有乙醇胺，一種HSP90惰性分子。下拉物(pull-down)中的蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析。(b、c)如所指示的單一或連續(xù)的免疫和化學(xué)沉淀在K562提取物中使用H9010和PU-珠粒以指示的頻率和所示順序進(jìn)行。下拉物中和剩余上清液中的蛋白質(zhì)通過(guò)WB分析。NS=非特異性。(d)K562細(xì)胞用媒劑(-)或PU-H71 ( + )處理24小時(shí)，并且通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析蛋白質(zhì)。(e)Hsp70敲減的細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(左圖)分析并且蛋白質(zhì)水平的變化以相對(duì)發(fā)光單位(RLU)呈現(xiàn)(右圖)。對(duì)照=零亂siRNA。(f )如所指示的單一或連續(xù)的化學(xué)沉淀在K562提取物中使用GM-珠粒、SNX-珠粒和NVP-珠粒以指示的頻率和所示順序進(jìn)行。下拉物中和剩余上清液中的蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析。(g)K562細(xì)胞中的HSP90以與異常Bcr-Abl和正常c-Abl蛋白質(zhì)的復(fù)合物存在。ro-H71，而不是H9010，選擇Bcr-Abl癌蛋白結(jié)合的HSP90群體。
[0096]圖3.(a、b)來(lái)自乳癌和CML細(xì)胞提取物(120 μ g)的HSP90通過(guò)如所指示的連續(xù)的化學(xué)和免疫純化步驟分離。分離上清液以分析留下的HSP90。每一部分中的HSP90通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析。溶解產(chǎn)物=內(nèi)源蛋白內(nèi)含物；PU-珠粒、GM-珠粒和對(duì)照珠粒指示在特定珠粒上分離的蛋白質(zhì)。H9010和IgG指示通過(guò)特定Ab分離的蛋白質(zhì)。對(duì)照珠粒含有一種HSP90惰性分子。數(shù)據(jù)與從多個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)(n ^ 2)中獲得的數(shù)據(jù)一致。(c) PE結(jié)合抗體對(duì)比PU-H71-FITC的HSP90結(jié)合。在數(shù)據(jù)條上方指示每一細(xì)胞系通過(guò)ro_H71分離的總細(xì)胞HSP90百分比。(d)在外周血白血球(PBL)提取物(250 μ g)中進(jìn)行連續(xù)的化學(xué)和免疫純化步驟以分離TO-H71和H9010特異性HSP90物質(zhì)。所有樣品都通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析(上圖)。PBL中HSP90的結(jié)合是通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)使用HSP90-PE抗體和PU-H71-FITC評(píng)估。FITC-TEG=非特異性結(jié)合的對(duì)照(下圖)。(e)—組14種白血病細(xì)胞系中PU-H71-FITC (ΙμΜ)與HSP90的結(jié)合對(duì)比用TO-H71處理后活力百分比的相關(guān)性:香住(Kasumi )_1、香住_4、KCL-22、REH、TF-1、KG-1、HL-60、0C1-AML3、K562、MOLM-13, TUR、THP-1、U937 和 MV4-11。這些細(xì)胞中總HSP90水平類似,如通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法顯示(未圖示)。
[0097]圖4.Ca)流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)圖說(shuō)明用于原代慢性骨髓白血病(CML)樣品的門控策略以區(qū)分胚細(xì)胞(⑶45dim，紅色圓圈)與非惡性淋巴細(xì)胞(藍(lán)色圓圈)。(b)來(lái)自(a)中所示的原代CML患者樣品的CML胚細(xì)胞相對(duì)于正常淋巴細(xì)胞中PU-H71-FITC與HSP90結(jié)合的比率。(c) Ca)中所示的原代CML樣品在指示時(shí)間點(diǎn)和指示劑量的PU-H71處理后CML胚細(xì)胞(紅色)或正常淋巴細(xì)胞(藍(lán)色)相對(duì)于未經(jīng)處理對(duì)照的活力百分比。(d)流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)圖顯示用于原代慢性期CML (cpCML)樣品的門控策略以區(qū)分胚細(xì)胞(⑶45dim，紅色圓圈)與非惡性淋巴細(xì)胞(藍(lán)色圓圈)，并且分析胚細(xì)胞門(⑶45dim，紅色圓圈)內(nèi)⑶34+細(xì)胞(紅色方塊)的結(jié)合?；?-AAD區(qū)分，⑶45對(duì)比SSC點(diǎn)圖對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行預(yù)先門控。(e)慢性期CML (cpCML)CD34+細(xì)胞和正常淋巴細(xì)胞中PU-H71-FITC與HSP90結(jié)合的比率。(f)用ΙμΜ PU-H71-FITC或TEG-FITC處理48小時(shí)后cpCML CD34+細(xì)胞(紅色)和正常淋巴細(xì)胞(藍(lán)色)相對(duì)于未經(jīng)處理對(duì)照的活力百分比。(g)來(lái)自正常臍帶血、慢性期CML (cpCML)和胚細(xì)胞期(bpCML)細(xì)胞(n=5)的CD34+細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中ro-H71_FITC與Hsp90結(jié)合的比率。(h)用PU-H71 (ΙμΜ)處理胚細(xì)胞和慢性CML⑶34+細(xì)胞以及正常⑶34+細(xì)胞(來(lái)自臍帶血；CB)48小時(shí)后相對(duì)于未經(jīng)處理對(duì)照的活力百分比。圖c、f和h中的細(xì)胞活力通過(guò)膜聯(lián)蛋白V/7-AAD染色評(píng)估。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值土SE (n=3)。
[0098]圖5.(a)在正常細(xì)胞內(nèi)，HSP90使細(xì)胞蛋白折疊和移位到其適當(dāng)細(xì)胞區(qū)室(“管家復(fù)合物”)中的進(jìn)化守恒的管家功能需要HSP90的組成型表達(dá)。惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞蛋白質(zhì)通過(guò)突變、機(jī)能亢進(jìn)、滯留不正確的細(xì)胞區(qū)室中或其它方式被擾亂。這些功能上改變的蛋白質(zhì)的存在是起始和維持惡性表型所需的，并且正是這些癌蛋白被應(yīng)激改變的HSP90的子集(“致癌復(fù)合物”)特異性地維持。PU-H71特異性地結(jié)合于伴隨癌蛋白的HSP90部分(“致癌復(fù)合物”)。(b)使用PU-珠粒和對(duì)照珠粒以及H9010和IgG固定的抗體，在K562細(xì)胞提取物中分離HSP90和其相互作用的輔助伴隨蛋白。對(duì)照珠粒含有一種HSP90惰性分子。(c)來(lái)自K562細(xì)胞提取物的HSP90通過(guò)三個(gè)連續(xù)的免疫純化步驟利用H9010HSP90特異性抗體分離。分離剩余上清液以分析留下的蛋白質(zhì)。每一部分中的蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析。溶解產(chǎn)物=內(nèi)源蛋白內(nèi)含物。數(shù)據(jù)與從多個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)(n ^ 2)中獲得的數(shù)據(jù)一致。
[0099]圖6.GM和PU-H71對(duì)異常的蛋白質(zhì)/HSP90物質(zhì)具有選擇性。(a)在實(shí)驗(yàn)中監(jiān)測(cè)Bcr-Abl和Abl結(jié)合的HSP90物質(zhì)，其中用指示量的K562細(xì)胞溶解產(chǎn)物探測(cè)恒定體積的PU-H71珠粒(80 μ L)(左圖)，或者其中用指示體積的ro-H71珠粒探測(cè)恒定量的溶解產(chǎn)物(Img)(右圖)。(b)(左圖)PU-珠粒和GM-珠粒(80yL)識(shí)別SKMel28黑色素瘤細(xì)胞提取物(300 μ g)中的HSP90-突變體B-Raf復(fù)合物，但無(wú)法與在正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞CCD18Co提取物(300 μ g)中發(fā)現(xiàn)的HSP90-WT B-Raf復(fù)合物相互作用。H9010HSP90Ab識(shí)別兩種HSP90物質(zhì)。(c )在MDA-MB- 468細(xì)胞提取物(300 μ g )中，PU-珠粒和GM-珠粒(80 μ I)與HER3和Raf-1激酶相互作用，但不與非致癌性酪氨酸-蛋白激酶CSK(—種c-Src相關(guān)酪氨酸激酶)和P38相互作用。Cd)(右圖)PU-珠粒(80yL)與v-Src/HSP90相互作用，但不與c-Src/HSP90物質(zhì)相互作用。為了促進(jìn)c-Src (豐度低于v-Src的一種蛋白質(zhì))檢測(cè)，與v-Src轉(zhuǎn)化的3T3細(xì)胞(250 μ g)相比，使用較高量的表達(dá)c-Src的3T3細(xì)胞溶解產(chǎn)物(I1OOOyg),此解釋了在這些3T3細(xì)胞(溶解產(chǎn)物，3T3成纖維細(xì)胞對(duì)比v-Src3T3成纖維細(xì)胞)中檢測(cè)到的較高HSP90水平。溶解產(chǎn)物=內(nèi)源蛋白內(nèi)含物；PU-珠粒、GM-珠粒和對(duì)照珠粒指示在特定珠粒上分離的蛋白質(zhì)。HSP90Ab和IgG指示通過(guò)特定抗體分離的蛋白質(zhì)。對(duì)照珠粒含有一種HSP90惰性分子。數(shù)據(jù)與從多個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)(n ≥ 2)中獲得的數(shù)據(jù)一致。
[0100]圖7.單一化學(xué)沉淀是在表達(dá)Bcr-Abl的CML細(xì)胞系(a)中和原代CML細(xì)胞提取物(b)中用PU-珠粒和對(duì)照珠粒進(jìn)行。下拉物中的蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析。若干Bcr-Abl裂解產(chǎn)物在原代CML樣品中如所報(bào)導(dǎo)注釋9°。N/A=不可得。
[0101]圖8.若干HSP90抑制劑的結(jié)構(gòu)。
[0102]圖9.合成的熱休克蛋白90(HSP90)的熒光配體含有異硫氰酸熒光素(FITC)、4_硝基苯并[1，2，5]噁二唑(NBD)或紅移染料磺酰羅丹明101 (得克薩斯紅(Texas Red))結(jié)合于 PU-H71。
[0103]圖10.所示反應(yīng)方案的試劑和條件:(a) FITC、Et3N, DMF、室溫、12小時(shí)、40% ； (b)得克薩斯紅磺酰氯、DMF、0-10°C、12小時(shí)、61% ；(c) DMF、室溫、20小時(shí)、47%。
[0104]圖11.所示反應(yīng)方案的試劑和條件:(a)FITC、Et3N' DMF、室溫、5小時(shí)、72%; (b)NBD-CUEt3N, DMF、室溫、12 小時(shí)、40%。
[0105]圖12.所示反應(yīng)方案的試劑和條件:(a)N-(3_溴丙基)_鄰苯二甲酰亞胺、Cs2C03、DMF、室溫、34% ； (b)水合肼、MeOHXH2Cl2、室溫、64% ; (c)FITC、Et3N、DMF、室溫、12 小時(shí)、74% ；
(d)NBD-Cl、Et3N、DMF、室溫、12 小時(shí)、42%。
[0106]圖13.(A)在37°C下將M0LM-13細(xì)胞用指示的ro_H71-熒光衍生物(I μ Μ)處理4小時(shí)，并且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)量與活細(xì)胞的結(jié)合(DAPI陰性)。結(jié)合程度顯示為平均熒光強(qiáng)度(MFI)。(B)在37°C下將M0LM-13細(xì)胞用指示的ro_H71-熒光衍生物(I μ M)處理24小時(shí)。通過(guò)DAPI排除測(cè)定其活力。(C)將M0LM-13細(xì)胞用指示的PU-H71-熒光衍生物(I μ Μ)處理24小時(shí)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析HSP90客戶蛋白mFLT3和Raf-1的穩(wěn)態(tài)水平。β-肌動(dòng)蛋白用以針對(duì)相等的蛋白負(fù)荷歸一化。
[0107]圖14.(A)用PU-H71-FITC2染色的白血病細(xì)胞的共焦熒光顯微鏡術(shù)展示顯著的細(xì)胞內(nèi)定位。(B)將原代急性骨髓白血病樣品用指示劑量的TO-H71或媒劑(未經(jīng)處理)預(yù)先處理24小時(shí)。將處理后細(xì)胞用ΙμΜ PU-H71-FITC2或TEG-FITC處理。PU-H71-FITC2和TEG-FITC與細(xì)胞的結(jié)合通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估并且表示為平均熒光強(qiáng)度(MFI )。TEG-FITC作為非特異性結(jié)合對(duì)照展示。CD45對(duì)比SSC的門控用以區(qū)分結(jié)合于胚細(xì)胞(惡性細(xì)胞)或淋巴細(xì)胞(正常細(xì)胞)與原代樣品。
[0108]圖15.正常細(xì)胞(左圖)和乳癌細(xì)胞(右圖)中的I3U-ANCA的熒光發(fā)射光譜。乳癌細(xì)胞的光譜發(fā)射型態(tài)在約530nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生熒光發(fā)射峰，這是結(jié)合的PU-H71-ANCA的代表性熒光發(fā)射。
[0109]圖16.(a)來(lái)自健康供體(臍帶血)和慢性和胚細(xì)胞期CML患者(分別是cpCML和bpCML)的臍帶血和CML胚細(xì)胞相對(duì)于正常淋巴細(xì)胞中的PU-H71-FITC與Hsp90結(jié)合的比率。注意，對(duì)比與疾病進(jìn)展有關(guān)的CML中的結(jié)合增加，未顯著結(jié)合于來(lái)自健康患者的臍帶血。(b)用PU-H71 (ΙμΜ)處理胚細(xì)胞和慢性CML⑶34+細(xì)胞以及正常⑶34+細(xì)胞(來(lái)自臍帶血；CB) 48小時(shí)后相對(duì)于未經(jīng)處理對(duì)照的活力百分比。細(xì)胞活力通過(guò)膜聯(lián)蛋白V/7-AAD染色來(lái)評(píng)估。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均土SE (n=3)。(c)在一組19個(gè)原代AML患者樣品中用500nMPU-H71處理48小時(shí)后PU-H71-FITC (I μ Μ)結(jié)合于HSP90與活力百分比的相關(guān)性。每一點(diǎn)表示原代AML樣品。每一實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行一式兩份。這些細(xì)胞表達(dá)類似的總HSP90水平。
[0110]圖17.異種移植分析表明體內(nèi)高I3U-FITC結(jié)合的AML樣品對(duì)PU-H71處理的敏感性。(a)體外PU-H71處理顯示低和高PU-FITC吸收(b)的兩個(gè)原代AML樣品48小時(shí)的活力百分比?；盍νㄟ^(guò)膜聯(lián)蛋白/7AAD分析測(cè)定。(b)來(lái)自異種移植動(dòng)物的骨髓細(xì)胞(對(duì)于圖a中所示的AML樣品)用人類特異性抗體染色以測(cè)定I3U-FITC結(jié)合。PU-FITC結(jié)合表示為人類(白血病)/鼠類(正常)的比率。(c) 一周用75mg/kg ro-H71處理3次，持續(xù)3周的動(dòng)物中⑶34+腫瘤細(xì)胞百分比。
[0111]圖18.使用標(biāo)記的ro-H71檢測(cè)和定量“致癌HSP90”并且預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)HSP90抑制劑的敏感性。(A)在一組胰腺癌和乳癌細(xì)胞系中用ΙμΜ PU-H71、SNX-2112或NVP-AUY922處理48小時(shí)后PU-H71-FITC (I μ Μ)結(jié)合于HSP90與活力百分比的相關(guān)性。結(jié)合測(cè)量為各別癌細(xì)胞中PU-FITC吸收與參考細(xì)胞HSP90抗性白血病細(xì)胞HL60中吸收(參見(jiàn)圖D)的比率。(B)總腫瘤HSP90的表達(dá)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)測(cè)量并且相對(duì)于PU-FITC結(jié)合繪圖。(C)在一組胰腺癌和乳癌細(xì)胞系中用I μ M PU-H71、SNX-2112或NVP-AUY922處理48小時(shí)后的活力百分比相對(duì)于總腫瘤HSP90的表達(dá)繪圖。(D)在低結(jié)合和敏感性(HL-60)以及高結(jié)合和敏感性(MV4-11) AML細(xì)胞系中PE結(jié)合的抗體對(duì)比ro-H71_FITC的HSP90結(jié)合。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值土 SE (n=3)。
[0112]圖19.PU-H71-FITC2結(jié)合于腫瘤細(xì)胞和參考HL-60白血病細(xì)胞的比率?？梢酝ㄟ^(guò)與非反應(yīng)性細(xì)胞的結(jié)合于ro-H71-FITC2的比率為約1.23到約2.07或低于2.07相比，反應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合于ro-H71-FITC2的比率為約2.7到約5.87或超過(guò)5.87，來(lái)區(qū)分反應(yīng)細(xì)胞050%活力減少)與非反應(yīng)性細(xì)胞(〈50%活力減少)。
[0113]圖20.EpCAM+循環(huán)腫瘤細(xì)胞中ro-H71_FITC2的累積:從全血分離的PBMC預(yù)先用I3U-FITC或?qū)φ?PU-FITC9、DMS0、1 μ M/2X 16個(gè)細(xì)胞/毫升、4小時(shí))處理。接著細(xì)胞用⑶45、⑶14和EpCAM抗體染色。(A)對(duì)細(xì)胞門控以排除死細(xì)胞。接著對(duì)活細(xì)胞門控以對(duì)比⑶45+細(xì)胞測(cè)定EpCAM+。通過(guò)進(jìn)一步以FSC，針對(duì)⑶14，對(duì)⑶45+細(xì)胞門控，將單核細(xì)胞從分析排除。(B)展示⑶45+⑶14-細(xì)胞(藍(lán)色)和EpCAM+細(xì)胞(紅色)的PU-FITC中值熒光強(qiáng)度(MFI)的直方圖。EpCAM+細(xì)胞中藥物的累積計(jì)算為減去DMSO和PU-FITC9對(duì)照(用作非特異性和背景結(jié)合對(duì)照)的值后MFIEpCAM+/MFI⑶45+⑶14-(循環(huán)腫瘤細(xì)胞/白血球)的比率。
[0114]圖21.展示不同Lyl克隆對(duì)PU-H71-FITC2的吸收并且表示為中值熒光強(qiáng)度。這些細(xì)胞對(duì)HSP90抑制劑的敏感性與其對(duì)標(biāo)記的ro-H71的吸收有關(guān)。這些腫瘤細(xì)胞中總腫瘤HSP90的表達(dá)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)測(cè)量(插圖)。
[0115]圖22 (a-c).胰腺癌細(xì)胞中TO-H71結(jié)合和毒性的相關(guān)性。(A)活細(xì)胞中的結(jié)合；將胰腺癌細(xì)胞(I X 16個(gè)細(xì)胞)用PUFITC2 (I μ Μ)或?qū)φ誟TEG-FITC (I μ Μ)或DMS0]處理6小時(shí)。將細(xì)胞用FACS緩沖液(PBS、0.05%FBS)洗滌兩次，并且在分析前在室溫下在FACS緩沖液中用1μ g/ml DAPI(英杰公司(Invitrogen))染色。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(LSR-1I，碧迪生物科學(xué)公司(BD B1sciences))獲得表示PU-H71-熒光衍生物結(jié)合的來(lái)自活細(xì)胞(DAPI陰性)的熒光強(qiáng)度，并且通過(guò)FlowJo軟件(俄勒R州亞什蘭的樹(shù)星公司(Tree Star, Ashland, OR))分析。值表示減去DMSO和TEG-FITC對(duì)照的平均熒光強(qiáng)度。(B)毒性:將胰腺癌細(xì)胞(I X 16個(gè)細(xì)胞)用PU-FITC2 (ΙμΜ)處理48小時(shí)。將細(xì)胞用FACS緩沖液(PBS、0.05%FBS)洗滌兩次，并且在室溫下在FACS緩沖液中用I μ g/ml DAPI (英杰公司)染色并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(LSR-1I，碧迪生物科學(xué)公司)獲得。值表示相對(duì)于來(lái)自DMSO對(duì)照的值歸一化的活細(xì)胞(DAPI陰性)％。(C)相關(guān)分析；從A和B中獲得的MFI和毒性分別在x和y軸上繪圖并且進(jìn)行相關(guān)線性回歸分析。
[0116]圖23.(A) PUH71-FITC2 與白血病干細(xì)胞(LSC，CD34+CD38_CD45dim)的結(jié)合。將原代AML樣品與I μ M PU-H71-FITC2在37°C下一起培育4小時(shí)。細(xì)胞用CD34、CD38、CD45和7-AAD染色，接著進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。PU-H71與LSC的結(jié)合顯示為活細(xì)胞(7-AAD陰性)中的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。(B)在用ΙμΜ PUH71處理48小時(shí)后LSC相對(duì)于來(lái)自三個(gè)原代AML樣品的未經(jīng)處理對(duì)照的活力百分比。細(xì)胞在膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色前用⑶45、⑶34和⑶38染色。LSC活力通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)量并且確定為⑶45dim⑶34+⑶38-門的膜聯(lián)蛋白V-/7AAD-百分比。
[0117]圖24.腫瘤的不同的[124I]-PU_H71吸收指示其“致癌HSP90”含量有差異，因此其對(duì)HSP90療法的反應(yīng)有差異。若干乳癌患者中[124I]-PU-H71注射后24小時(shí)的[124I]-PU-H7IPET影像測(cè)量為最大標(biāo)準(zhǔn)化吸收值(SUVmax)。BC=乳癌。TNBC-三陰性BC。
[0118]圖25.如通過(guò)PET測(cè)定，在投予[124I]-PU_H71后，對(duì)HSP90抑制療法起反應(yīng)的選定數(shù)目的患者的腫瘤:肌肉SUV比率。這些患者中，腫瘤:肌肉SUV隨時(shí)間推移而增加。呈現(xiàn)針對(duì)若干陽(yáng)性和陰性腫瘤平均的值。
[0119]圖26.患有套細(xì)胞淋巴瘤的患者的FDG/CT和[124I]-PU_H71PET/CT?；颊哒故驹谧⑸鋄124I]-PU-H71后30分鐘清晰可見(jiàn)病變。在后期(3.5-24小時(shí)和24小時(shí)以上)在此腫瘤中未看見(jiàn)[124I]-PU-H71吸收。
[0120]圖27.兩個(gè)指示的淋巴結(jié)(LN)中復(fù)發(fā)性乳癌患者的[124I]-PU_H71PET/CT。對(duì)[124I]-PU-H71注射后若干時(shí)間(0.1,0.4,0.6,3.5和21.4小時(shí))的PET定量，并且對(duì)于10mg/m2的PU-H71的投予劑量，將針對(duì)[124I]-PU-H71獲得的SUVmax數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)镠SP90i濃度。還計(jì)算在O到24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)兩個(gè)腫瘤對(duì)ro-H71的暴露并且表示為曲線下面積(AUC)。CT (左)、PU-PET/CT (中間)和FDG-PET/CT聯(lián)合(右)經(jīng)軸影像顯示在一個(gè)患病淋巴結(jié)而不是在另一個(gè)中的[124I]-PU-H71-親合力，表明氣管支氣管左前角淋巴結(jié)(TAALN)中的病變對(duì)HSP90療法起反應(yīng)的可能性低于氣管支氣管左角LN (TALN)0
[0121]圖28.用1241-PU_H71PET對(duì)三陰性乳癌患者成像。在注射后20分鐘，吸收在肺腫塊(左箭頭)和骨頭病變(右箭頭)中顯著(A)，但在24小時(shí)，僅在肺病變中看見(jiàn)吸收(B)。肺和骨頭腫瘤都通過(guò)CT和FDG-掃描確認(rèn)(C)。患者開(kāi)始用HSP90抑制劑STA-9090處理。HSP90抑制劑處理后二十天，如通過(guò)CT和FDG-PET兩者證明，肺而不是骨頭病變的尺寸明顯下降(D)。
[0122]圖29.氣管旁淋巴結(jié)中轉(zhuǎn)移性HER2乳癌患者的[124I]-PU-H71PET/CT。[124I]-PU-H71后或[124I]-PU-H71與10mg/m2PU_H71共注射后的指示時(shí)間的PET影像測(cè)量為最大標(biāo)準(zhǔn)化吸收值(SUVmax)。對(duì)于10mg/m2的PU-H71的投予劑量，將針對(duì)[124I]-PU-H71獲得的SUV數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)镠SP90i濃度。還計(jì)算在O到48小時(shí)的時(shí)間內(nèi)兩個(gè)腫瘤對(duì)PU-H71的暴露并且表示為曲線下面積(AUC)。在共注射[124I]-PU-H71/PU-H71后如從[124I]-PU-H7IPET估計(jì)或如從[124I]-PU-H71PET測(cè)定的PU-H71的腫瘤濃度(以微摩爾值為單位)是相當(dāng)?shù)摹?br> [0123]圖30.[124I]-PU-H71PET是一種用于HSP90抑制劑的非侵入性分析。(a)PU_H71和[124I]-PU-H71的化學(xué)結(jié)構(gòu)。(b) MDA-MB-468腫瘤負(fù)載小鼠中[124I]-PU-H71的代表性PET掃描。腫瘤的位置由紅色箭頭指示。(c)投予后指示時(shí)間的[124I]-PU-H71腫瘤對(duì)器官活性濃度比率。(d) MDA-MB-468腫瘤和血漿(n=5)中[mI]_PU_H71的生物學(xué)分布。腫瘤-S和腫瘤-L分別是小的和大的腫瘤。(插圖)使用如在GraphPad Prism中實(shí)施的線性回歸曲線擬合，分析PU-H71從腫瘤的24到140小時(shí)緩慢終末清除期。
[0124]圖31.[124I]-PU_H71PET準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)腫瘤中治療有效PU-H71濃度的遞送。(a)預(yù)測(cè)的PU-H71腫瘤分布基于由[124I]-PU-H71PET產(chǎn)生的平均％ID/g (下圖)。投予指示ro_H71劑量后指示時(shí)間的預(yù)測(cè)腫瘤濃度(上圖)。(b)在投予75mg/kg藥劑后的腫瘤TO-H71濃度(n=5)如通過(guò)[124I]-PU-H7IPET 預(yù)測(cè)，并且在共注射[124I]-PU-H71 和 PU-H71 后由 LC-MS/MS測(cè)定并由[124I]-PU-H71PET測(cè)定。(c、d)以指示劑量投予TO-H71并在投予后24小時(shí)分析的MDA-MB-468腫瘤(c )以及用指示濃度的ro-H71處理24小時(shí)的MDA-MB-468細(xì)胞(d)的代表性蛋白質(zhì)印跡分析。印跡(n=3)由密度測(cè)定法定量并且蛋白質(zhì)水平的變化相對(duì)于TO-H71的濃度繪圖(右圖)。(e、f)在示蹤量的[124I]-PU-H71與指示劑量的PU-H71混合進(jìn)行共投予后如通過(guò)[124I]-PU-H71PET預(yù)測(cè)的投予后24小時(shí)標(biāo)靶占有率。
[0125]圖32.[124I]-PU-H71PET預(yù)測(cè)HSP90療法的有效劑量方案的設(shè)計(jì)。(a)當(dāng)以一周3次(星期一-星期三-星期五，星期六/星期天中斷)的時(shí)程以指示劑量投予2周時(shí)基于由[124I]-PU-H7IPET獲得的平均腫瘤活性濃度(％ID/g)預(yù)測(cè)的PU-H71腫瘤分布。(插圖)腫瘤中PU-H71的AUC使用GraphPad Prism計(jì)算。(b)用指示劑量的PU-H71處理48小時(shí)的MDA-MB-468細(xì)胞的活力通過(guò)溴化乙錠/吖啶橙染色分析(上圖)。通過(guò)[124I]-PU-H71PET估計(jì)的誘發(fā)的腫瘤細(xì)胞凋亡預(yù)測(cè)指示的平均和最小PU-H71腫瘤濃度。(c)以一周3次的時(shí)程向MDA-MB-468腫瘤負(fù)載小鼠(n=5)腹膜內(nèi)投予指示劑量的TO-H71。腫瘤體積和小鼠重量在指示的處理時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)。(d)以一周3次的時(shí)程向MDA-MB-468腫瘤負(fù)載小鼠(n=5)腹膜內(nèi)投予指示劑量的PU-H71。腫瘤體積和小鼠重量在指示的處理時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)。(e)當(dāng)以一周3次(星期一-星期三-星期五，星期六/星期天中斷)的時(shí)程以指示劑量投予時(shí)，基于由[124I]-PU-H7IPET獲得的平均腫瘤活性濃度(％ID/g)預(yù)測(cè)的PU-H71腫瘤分布。(f)在星期四，即上次劑量投予后24小時(shí)處死的經(jīng)媒劑(對(duì)照)和TO-H71 (5mg/kg)處理的腫瘤的蛋白質(zhì)印跡分析。針對(duì)每一腫瘤指示如由LC-MS/MS測(cè)定的PU-H71腫瘤濃度。(f)來(lái)自圖(d)的數(shù)據(jù)分析(n=5)。
[0126]圖33.[124I]-PU-H7IPET預(yù)測(cè)HSP90療法的有效時(shí)程方案的設(shè)計(jì)。(a)當(dāng)以指示的時(shí)程以75mg/kg投予時(shí)，基于由[124I] -PU-H7IPET獲得的平均腫瘤活性濃度(％ID/g)的預(yù)測(cè)的PU-H71腫瘤分布。(b)如從體外分析預(yù)測(cè)，通過(guò)指示的平均和最小PU-H71腫瘤濃度估計(jì)的誘發(fā)的腫瘤細(xì)胞凋亡。(c)以指示的時(shí)程向MDA-MB-468腫瘤負(fù)載小鼠(n=5)腹膜內(nèi)投予PU-H71 (75mg/kg)。腫瘤體積和小鼠重量在指示的處理時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)。以一周I次的時(shí)程，在星期四給藥，在上次劑量投予后24小時(shí)處死，以及在星期四給藥，在上次劑量投予后96小時(shí)處死得到的經(jīng)PU-H71 (75mg/kg)處理的腫瘤的蛋白質(zhì)印跡(d)和LC-MS/MS分析(e)。對(duì)照；僅媒劑處理的小鼠。
[0127]圖34.針對(duì)患有轉(zhuǎn)移到肺的疾病的胰腺患者和指示的淋巴結(jié)，如通過(guò)I3U-PET預(yù)測(cè)的腫瘤對(duì)PU-H71的暴露。腫瘤濃度是基于20mg/m2的投予劑量計(jì)算。血漿暴露也以紅色展示。時(shí)間O到192小時(shí)的計(jì)算的AUC ( μ M-h)列表在右側(cè)。
[0128]圖35.肺中患有復(fù)發(fā)性疾病的胰腺癌患者的[124I]-PU_H71PET/CT。對(duì)[124I]-PU-H71注射后指示時(shí)間(48和196小時(shí)，左圖)的PET影像定量，并且對(duì)于ro_H71的指示投予劑量，將針對(duì)[124I]-PU-H71獲得的SUV數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤中的PU-H71濃度。還計(jì)算以一周兩次(星期二和星期五)的時(shí)程和20、60和80mg/m2的投予劑量(右上圖和下圖)處理兩周的兩個(gè)腫瘤(一個(gè)在左肺并且另一個(gè)在右肺門LN)在O到336小時(shí)的時(shí)間內(nèi)對(duì)PU-H71的暴露，并且表示為曲線下面積(AUC)并且為平均腫瘤濃度。
[0129]圖36.圖A展示如從PU-PET中獲得的在乳癌患者的腫瘤中O到72小時(shí)內(nèi)的1241-PU-H71的生物學(xué)分布。數(shù)據(jù)用以模擬當(dāng)在周末中斷下一周兩次持續(xù)兩周，在周末中斷下一周三次持續(xù)兩周，在周末中斷下一周一次持續(xù)兩周，以及在周末中斷下一周五次持續(xù)兩周給予時(shí)腫瘤對(duì)10mg/m2的投予劑量的暴露。
[0130]圖37.[124I]-PU-H7IPET預(yù)測(cè)對(duì)HSP90療法的反應(yīng)程度。(a)當(dāng)以指示劑量和指示時(shí)程投予時(shí)ro-H71對(duì)腫瘤HSP90位點(diǎn)的預(yù)期平均占有率。(b、c)在GraphPad Prism中分析腫瘤HSP90位點(diǎn)占有率與觀測(cè)到的抗腫瘤作用的相關(guān)性。
[0131]圖38.1241-PU-H71PET分析在HSP90抑制劑的臨床開(kāi)發(fā)中的用途:(a)測(cè)定實(shí)現(xiàn)有效腫瘤濃度所需的HSP90抑制劑的劑量、選擇適于HSP90療法的患者和設(shè)計(jì)有效的劑量和時(shí)程方案；(b)分析遞送到腫瘤的藥物的實(shí)際濃度并且預(yù)測(cè)HSP90療法的臨床結(jié)果；以及
(c)測(cè)定“最大腫瘤劑量”。CR=完全反應(yīng)，PR=部分反應(yīng)，NR=無(wú)反應(yīng)。
[0132]圖39.MDA-MB-468 異種移植 TNBC 小鼠中[124I]-PU-DZ13 和[124I]-PU-H71 的體內(nèi)PET成像。在R4或FOCuS120專用小動(dòng)物PET掃描器(田納西州諾克斯維爾的康科德微系統(tǒng)公司(Concord Microsystems, Inc., Knoxville, TN))上進(jìn)行 PET 成像；在專用小動(dòng)物 CT 掃描器(田納西州橡樹(shù)嶺的愛(ài)姆替科公司(ImTek, Inc.，Oak Ridge, TN))上,使用專用立體定向約束裝置進(jìn)行分開(kāi)的解剖成像。CT和PET影像數(shù)據(jù)集的最大強(qiáng)度投影(MIP)在解剖學(xué)上記錄，并且使用PET和CT數(shù)據(jù)的阿爾法透明摻合產(chǎn)生重疊影像。
[0133]圖40.BC的情況展示對(duì)TO-H71的劑量依賴性反應(yīng)。當(dāng)腫瘤對(duì)TO-H71高度敏感時(shí)H&E染色的載片顯示含有核濃縮細(xì)胞(指示早期細(xì)胞凋亡)與核破裂細(xì)胞(表示晚期細(xì)胞凋亡)的細(xì)胞凋亡顯著區(qū)域。(A)對(duì)用指示濃度的PU-H71處理48小時(shí)的TNBC樣品中細(xì)胞凋亡/細(xì)胞死亡定量并且相對(duì)于PU-H71的濃度繪圖。細(xì)胞凋亡與壞死性/晚期細(xì)胞凋亡細(xì)胞都進(jìn)行計(jì)數(shù)并且添加到如y軸上描繪的細(xì)胞凋亡％。注意，在三個(gè)敏感性群組中的一連串情況(最陡峭的上部曲線，最敏感，LNl5和LN16 ；中間曲線，敏感，PT12、PT17、PT25、PT28和LNlO ;以及下部曲線，不太敏感、PT10、PT15、PT16和PT30)。有趣地，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移展示在同等劑量下比原發(fā)性腫瘤敏感性高。PT=原發(fā)性腫瘤，LN=淋巴結(jié)。對(duì)TO-H71最敏感的腫瘤也針對(duì)P-Akt高度染色。(B)與(A)相同，使用來(lái)自用PU-H71處理24或48小時(shí)的HER2+、TNBC和ER+BC患者的樣品。
[0134]圖41.對(duì)HSP90抑制的細(xì)胞凋亡敏感性與細(xì)胞存活對(duì)AKT-和STAT-通路而不是MEK-通路的依賴性有關(guān)。(A)、(B)代表性AML細(xì)胞與指示濃度的HSP90、AKT、JAK和MEK抑制劑一起培育指示的時(shí)間，并且使用吖啶橙/溴化乙錠方法評(píng)估細(xì)胞凋亡。數(shù)據(jù)與從多個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)(η >3)中獲得的數(shù)據(jù)一致。點(diǎn)，平均值；棒，標(biāo)準(zhǔn)偏差。(C)來(lái)自僅僅用AKT1、MEKi和JAKi處理72小時(shí)的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡％值相對(duì)于在HSP90抑制劑處理后獲得的值繪圖，并且如Prism4.0中實(shí)施，進(jìn)行線性回歸分析。
[0135]圖42.具有最高水平P-STAT5的AML原代細(xì)胞也對(duì)ro_H71最敏感。(A)胚細(xì)胞中磷酸化STAT5水平(⑶45dim門控)表示為三個(gè)不同原代AML樣品的平均熒光強(qiáng)度(MFI )。Stat5的磷酸化水平通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估。(B)在用I μ M PUH71處理48小時(shí)后AML胚細(xì)胞相對(duì)于來(lái)自三種原代AML樣品的未經(jīng)處理對(duì)照的活力百分比。細(xì)胞在膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色前用CD45染色。AML胚細(xì)胞的活力通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)量并且確定為針對(duì)AML胚細(xì)胞的⑶45dim對(duì)比SSC門的膜聯(lián)蛋白V-/7AAD-百分比。
[0136]圖43.向8-10月齡的3xTg小鼠投予(A)75mg/kg或(B)指示劑量的HSP90抑制劑PU-HZ151并且在投予后24小時(shí)，在海馬區(qū)(在此AD模型中受折磨的腦部區(qū))中測(cè)量H)標(biāo)記物HSP70。當(dāng)HSP90被抑制時(shí)誘發(fā)HSP70，并且其誘發(fā)指示治療水平的HSP90抑制劑遞送到相關(guān)的腦部區(qū)域。(C)在投予50mg/kg PU-HZ151后通過(guò)LC-MS/MS測(cè)定指示的腦部區(qū)域和血漿中HSP90抑制劑的水平。在單次腹膜內(nèi)注射后不同時(shí)間的Hsp90抑制劑水平以微摩爾單位展示。腦暴露也測(cè)量為曲線下面積(AUC)。
[0137]圖44.PU-H71對(duì)HSP90具有選擇性。(A)若干HSP90抑制劑珠粒下拉物的考馬斯染色凝膠(Coomassie stained gel)。將K562溶解產(chǎn)物(60 μ g)與25 μ L指示珠粒一起培育。用指示的緩沖液洗滌后，下拉物中的蛋白質(zhì)施加于SDS-PAGE凝膠。(B)PU-H71( 10 μ Μ)在scanMAX篩(阿姆比特公司(Ambit))中針對(duì)359種激酶測(cè)試。呈現(xiàn)ro_H71的TREEspot?相互作用圖。僅SNARK (NUAK家族SNFl-樣激酶2)(激酶樹(shù)上的紅點(diǎn))表現(xiàn)為靶向小分子的潛在低親和力激酶。

【具體實(shí)施方式】
[0138]5.1.作為腫瘤特異性生物標(biāo)記物的致癌HSP90
[0139]本發(fā)明證明了不僅僅是由HSP90表達(dá)決定的此具體“致癌HSP90”物質(zhì)的豐度預(yù)測(cè)對(duì)HSP90抑制療法的敏感性并且因此是HSP90療法的生物標(biāo)記物。本發(fā)明還證明了鑒別和測(cè)量腫瘤內(nèi)此致癌HSP90物質(zhì)的豐度預(yù)測(cè)對(duì)HSP90療法的反應(yīng)。
[0140]在以下部分中，展示HSP90抑制劑PU-H71靶向腫瘤富集的HSP90復(fù)合物和以親和力捕獲HSP90依賴性致癌客戶蛋白?；衔颰O-H71在以引用的方式并入本文中的美國(guó)專利第7，834，181號(hào)中公開(kāi)。TO-H71具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu):
[0141]

【權(quán)利要求】
1.一種用于確定血液癌癥患者是否將可能對(duì)使用HSP90抑制劑的療法起反應(yīng)的方法，其包含以下步驟: (a)使含有來(lái)自所述患者的癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞的樣品與優(yōu)先結(jié)合于所述患者癌細(xì)胞中存在的HSP90的腫瘤特異性形式的可滲透細(xì)胞的熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑接觸； (b)測(cè)量結(jié)合于所述樣品中所述癌細(xì)胞和所述非癌細(xì)胞的突光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量；以及 (c)將結(jié)合于所述癌細(xì)胞的熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量與結(jié)合于所述非癌細(xì)胞的熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量比較； 其中結(jié)合于所述癌細(xì)胞的熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量大于所述非癌細(xì)胞指示所述腫瘤將可能對(duì)HSP90抑制劑起反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述非癌細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行所述測(cè)量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(b)中測(cè)量的結(jié)合于所述腫瘤或所述腫瘤細(xì)胞的突光標(biāo)記的HSP90抑制劑的量與結(jié)合于所述非癌細(xì)胞的放射性標(biāo)記的HSP90抑制劑相比的比率越大，對(duì)所述HSP90抑制劑療法的所述可能反應(yīng)的程度越大。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述血液癌癥是白血病。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述白血病是慢性骨髓白血病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述樣品包含活細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述樣品包含生物流體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述生物流體是血液或骨髓。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述生物流體是血液。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品包含破壞的腫瘤細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品包含冷凍細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求所述的方法，其中所述樣品包含固定的和滲透化細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到13中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑是待作為療法投予的所述HSP90抑制劑的標(biāo)記形式。
15.根據(jù)權(quán)利要求14中任一權(quán)利要求所述的方法，其中待作為療法投予的所述HSP90抑制劑是TO-H71或PU-H71的類似物、同系物或衍生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述HSP90抑制劑是TO-H71。
17.根據(jù)權(quán)利要求1到16中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑是TO-H71或PU-H71的類似物、同系物或衍生物的形式。
18.根據(jù)權(quán)利要求1到17中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑是TO-H71的形式。
19.根據(jù)權(quán)利要求1到18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑是 PU-H71-FITC2。
20.根據(jù)權(quán)利要求1到18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記的HSP90抑制劑是 TO-H71-NBD1。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK104081206SQ201280040606
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月8日
【發(fā)明者】加布里拉·奇奧斯, 托尼·塔爾多內(nèi), 瑪麗·L·阿爾波, 艾瑞卡·M·戈梅斯-達(dá)伽馬, 莫妮卡·L·古斯曼, 宗洪亮 申請(qǐng)人:斯隆-凱特林癌癥研究所, 康奈爾大學(xué)