基于激子-等離子激元能量相互作用檢測蛋白激酶的傳感器及其制備方法、應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供基于激子?等離子激元能量相互作用檢測蛋白激酶的傳感器及其制備方法、應(yīng)用。包括：導(dǎo)電基體；組裝在導(dǎo)電基體上的量子點層；偶聯(lián)在量子點層上的多肽；修飾在所述導(dǎo)電基體上的一端含有磷酸基的DNA/AuNPs探針；所述多肽在活性待測生物酶與三磷酸腺苷ATP存在條件下，可發(fā)生磷酸化反應(yīng)。在蛋白激酶的定量篩選及在復(fù)雜的細胞裂解液中蛋白激酶活性的分析方面，該光電化學(xué)生物傳感器表現(xiàn)優(yōu)異。因此，由于同時具備靈敏性、簡單易操作以及在細胞實驗中的實用性，該工作不僅提供了一種利用EPI能量轉(zhuǎn)移檢測蛋白激酶活性的方法，同時在臨床醫(yī)療及藥物研發(fā)方面也表現(xiàn)出了極大的潛力。步驟簡單、操作方便、實用性強。
【專利說明】
基于激子-等離子激元能量相互作用檢測蛋白激酶的傳感器及其制備方法、應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于光電生物傳感器領(lǐng)域，特別涉及基于激子-等離子激元能量相互作用檢測蛋白激酶的傳感器及其制備方法、應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白激酶在真核細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，影響了生長、發(fā)育、迀移以及凋亡等各個細胞過程。其表達水平或活性異常時，就有可能導(dǎo)致癌癥、心血管疾病以及其他各種疾病，因此蛋白激酶是治療這些疾病很好的分子靶點。迄今為止，美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準了多種蛋白激酶的抑制劑作為上市藥物，用于相應(yīng)的臨床治療。目前存在著各種檢測激酶活性的方法，激酶生化檢測方法尤為眾多，比較傳統(tǒng)的有放射性同位素的方法。但是放射性同位素法其操作步驟比較復(fù)雜并且具有危害性的放射性產(chǎn)物，因此這種方法已逐漸被其他的方法所替代。目前，多種檢測方法被用來對蛋白激酶進行活性分析及進行蛋白激酶抑制劑的篩選實驗，諸如酶聯(lián)免疫法、反相高效液相色譜法、核磁共振分析法等等。而各種均相非放射性同位素的檢測方法，由于其污染小、操作便捷，逐漸成為激酶抑制劑篩選的首選。
[0003]然而，現(xiàn)有的生物傳感器中的工作電極主要為玻碳電極或金電極，其中，玻碳電極不能直接進行物理方法或者化學(xué)方法固載酶，只能通過在玻碳電極表面進行其他處理，例如化學(xué)交聯(lián)或者溶膠凝膠使得玻碳電極表面固載少量酶。由于玻碳電極的固載酶量低，使得其靈敏度未能達到理想水平。而金電極通常只對含有或者修飾有特定基團比如巰基的酶進行固載，有一定的局限性。此外，玻碳電極及金電極在使用之前都要打磨拋光及活化處理，過程比較繁瑣。因此，提供一種酶固載量高、分析靈敏度高且簡單快速的工作電極具有重要的現(xiàn)實意義。
[0004]中國專利(CN105021575A)公開了一種基于局域表面等離子體共振檢測激酶活性的光電傳感器。通過含有貴金屬納米粒子及光敏劑三聯(lián)吡啶釕的DNA探針發(fā)生局域表面等離子體共振效應(yīng)，使得其更多的電子躍迀到半導(dǎo)體金屬氧化物導(dǎo)帶上從而產(chǎn)生光電流，實現(xiàn)了激酶活性的檢測。但該設(shè)計中采用的光敏劑吡啶釕成本較為高昂，另一方面，組裝過程中，染料常常非特異性的吸附到電極上，產(chǎn)生較大誤差，且制備工藝要求高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述不足，本發(fā)明提供一種基于納米金(AuNPs)貴金屬粒子與硫化鎘量子點(CdS QDs)相互作用的光電化學(xué)生物傳感器來檢測蛋白激酶活性及蛋白激酶抑制劑的篩選。在蛋白激酶的定量篩選及在復(fù)雜的細胞裂解液中蛋白激酶活性的分析方面，該光電化學(xué)生物傳感器表現(xiàn)優(yōu)異。由于同時具備靈敏性、簡單易操作以及在細胞實驗中的實用性，該工作不僅提供了一種利用EPI能量轉(zhuǎn)移檢測蛋白激酶活性的方法，同時在臨床醫(yī)療及藥物研發(fā)方面也表現(xiàn)出了極大的潛力。
[0006]研究中，為了克服現(xiàn)有吡啶釕作為光敏劑成本過高的問題，本發(fā)明對現(xiàn)有的光敏劑進行了大量篩選，結(jié)果不甚理想。為此，發(fā)明人對現(xiàn)有的光電轉(zhuǎn)化材料進行了系統(tǒng)分析和實驗摸索，發(fā)現(xiàn):QDs(量子點)比如CdS QDs等由于電子和空穴被量子限域，連續(xù)的能帶結(jié)構(gòu)變成了分立能級結(jié)構(gòu)，當受到光激發(fā)后會導(dǎo)致電子從CdS QDs的價帶傳到導(dǎo)帶，從而導(dǎo)致電子-空穴的產(chǎn)生，導(dǎo)帶當中的電子被注入電極，與此同時，溶液中的電子供體源源不斷補充到價帶中去，從而形成穩(wěn)定的光電流響應(yīng)。當WS QDs與納米金Au NPs在一定條件下相互接近時，其粒子與粒子之間會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，從而能夠影響光電流的大小。因此，將QDs與納米金結(jié)合，可以構(gòu)建一種“signal off”PEC生物傳感器來檢測蛋白激酶的活性。進一步實驗結(jié)果表明:在本體系中，CdS QDs不僅充當光電活性物質(zhì)構(gòu)建PEC生物傳感界面，而且通過CdSQDs與Au NPs之間發(fā)生EPI實現(xiàn)信號傳導(dǎo)，使檢測器的光穩(wěn)定性和準確性大幅提高。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008]一種基于激子-等離子激元能量相互作用的電極，包括:
[0009]導(dǎo)電基體；
[0010]組裝在導(dǎo)電基體上的QDs層；
[0011]偶聯(lián)在QDs層上的多肽；
[0012]修飾在所述導(dǎo)電基體上的一端含有磷酸基的DNA/Au NPs探針；
[0013]所述多肽在活性待測生物酶與三磷酸腺苷ATP存在條件下，可發(fā)生磷酸化反應(yīng)。
[0014]本發(fā)明中QDs作為一種基于EPI(激子-等離子體能量相互作用)的光電化學(xué)信號傳導(dǎo)元件，在生物傳感器中對生物識別反應(yīng)進行分析。而當入射光子頻率與Au NPs的整體振動頻率相匹配時，Au NPs會對光子能量產(chǎn)生很強的吸收作用，就會產(chǎn)生LSPR(局域表面等離子體效應(yīng))。在本體系中，首先，將CdS QDs組裝到Ti02/IT0電極上，然后修飾上肯普肽。當PKA(蛋白激酶)催化肯普肽發(fā)生磷酸化作用之后，我們利用DNA雙鏈將Au NPs通過Zr4+離子對磷酸根的螯合作用連接到磷酸化的肯普肽/Ti02/IT0電極上。在光照射下，CdS QDs輻射發(fā)光進而繼續(xù)激發(fā)Au NPs產(chǎn)生表面等離子體激元。激發(fā)狀態(tài)下，粒子間會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，能量轉(zhuǎn)移會影響CdS QDs的激子狀態(tài)從而導(dǎo)致CdS QDs的光電流強度發(fā)生一定程度的降低，通過光電流的變化來反映出蛋白激酶的活性。
[0015]優(yōu)選的，所述量子點層采用CdSQDs制成;研究中對多種量子點材料進行篩選后發(fā)現(xiàn):采用CdS QDs與Au NPs配合時，其能量相互作用顯著增強。
[0016]優(yōu)選的，所述納米貴金屬為AuNPs;
[0017]優(yōu)選的，所述多肽為肯普肽；
[0018]優(yōu)選的，所述生物酶為蛋白激酶。
[0019]優(yōu)選的，所述導(dǎo)電基體為半導(dǎo)體金屬氧化物/ITO電極，其中，半導(dǎo)體金屬氧化物為氧化鈦T12或氧化鋅ZnO。
[0020]本發(fā)明還提供了一種基于激子-等離子激元能量相互作用的光電化學(xué)傳感器，其包括任一上述的工作電極。
[0021]本發(fā)明還提供了一種基于激子-等離子激元能量相互作用檢索蛋白激酶活性的光電化學(xué)傳感器，所述光電化學(xué)傳感器包括工作電極，所述工作電極包括:
[0022]導(dǎo)電基體；
[0023]組裝在導(dǎo)電基體上的量子點層；
[0024]偶聯(lián)在量子點層上的多肽；
[0025]修飾在所述導(dǎo)電基體上的一端含有磷酸基的DNA/Au NPs探針；
[0026]所述多肽在活性待測生物酶與三磷酸腺苷ATP存在條件下，可發(fā)生磷酸化反應(yīng)。
[0027]優(yōu)選的，所述量子點層采用CdSQDs制成；
[0028]優(yōu)選的，所述納米貴金屬為AuNPs;
[0029]優(yōu)選的，所述多肽為肯普肽；
[0030]優(yōu)選的，所述生物酶為蛋白激酶。
[0031]本發(fā)明還提供了一種基于激子-等離子激元能量相互作用的電極的制備方法，包括:
[0032]在導(dǎo)電電極上組裝量子點，形成量子點層；
[0033]在量子點層上偶聯(lián)多肽；
[0034]在所述導(dǎo)電基體上修飾一端含有磷酸基的DNA/Au NPs探針；
[0035]所述多肽在活性待測生物酶與三磷酸腺苷ATP存在條件下，可發(fā)生磷酸化反應(yīng)。
[0036]優(yōu)選的，所述量子點層采用CdSQDs制成；
[0037]優(yōu)選的，所述納米貴金屬為AuNPs;
[0038]優(yōu)選的，所述多肽為肯普肽；
[0039]優(yōu)選的，所述生物酶為蛋白激酶。
[0040]優(yōu)選的，所述導(dǎo)電基體為半導(dǎo)體金屬氧化物/ITO電極，其中，半導(dǎo)體金屬氧化物為氧化鈦T12或氧化鋅ZnO。
[0041]本發(fā)明還提供了一種較優(yōu)的基于激子-等離子激元能量相互作用的生物傳感器的制備方法，包括:
[0042 ] TGA修飾的CdS QD s參照文獻方法合成并稍作修改。在10mL三頸瓶中加入5OmL
0.0lM CdCl2溶液和250yL TGA，攪拌同時向溶液中通入氮氣30min。在此期間，使用IM的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液的pH到一定數(shù)值。然后加入5.0mL 0.1M Na〗S溶液，氮氣環(huán)境下下110°(:加熱回流4h。
[0043]Au NPs的合成:10mL 0.01 % (w/v)的氯金酸水溶液置于磁力攪拌器上攪拌加熱至沸騰，之后1% (w/v)檸檬酸鈉水溶液快速加入沸騰的氯金酸溶液中，當溶液變?yōu)榫萍t色時，停止加熱得到Au NPs，將其置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0044]DNA/Au NPs探針的合成:DNAl (5'-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3')和DNA2(3'-GCAAATCCTAAAC)配置成10—6M的溶液，之后混合搖床37°C雜交孵育一個小時，待反應(yīng)完全結(jié)束后將雜交后的DNA雙鏈加入ImL的Au NPs溶液中，室溫攪拌24h之后，將150yLlM的氯化鈉溶液逐滴緩慢加入，放置24h，最后，混合溶液在12000rpm每分鐘的情況下離心15min兩次，撇去上清液，將沉淀重新分散于包含有300mM的氯化鈉，50mM的Tris-HCI溶液中。之后將修飾有DNA的Au NPs在紫外下進行表征。
[0045]ITO玻璃依次在丙酮、氫氧化鈉(IM)的乙醇水(1: lv/v)溶液、水中超聲清洗15min，然后將其放在90°C烘箱中12h，烘干備用。預(yù)處理之后的ITO玻璃取出之后，滴加0.5mg/mL的氧化鈦于固定面積(0.5cm2)的ITO玻璃片之上，之后將其放入200°C環(huán)境中15h。之后將電極依次浸入2%PDDA(用0.5M NaCl溶液配制)1min，取出后用水洗滌，再放入CdS QDs溶液中l(wèi)Omin，取出后用水洗滌，重復(fù)之后得到所需的多層膜修飾電極。
[0046]肯普肽通過CdSQDs表面的羧基與肯普肽表面的氨基通過EDC偶聯(lián)到一起。首先，室溫下，將CdS/Ti02/IT0電極浸入EDC與NHS溶液中60min，清洗過后將50μ!4^度為500μΜ的肯普肽溶液滴加到電極上室溫黑暗處反應(yīng)12h使得肯普肽連接到電極上，二次水清洗之后氮氣吹干，得到肯普肽修飾的電極；ImM的6-氨基己酸封閉空白位點30min以減輕非特異性吸附，之后用二次水淋洗并用N2干燥;含有一系列濃度的PKA和ATP的緩沖溶液(50mM Tris-HCl和20mM MgCl2，pH 7.4)滴加到電極上，在37°C下反應(yīng)80min之后滴加50yL的Zr4+溶液；Ih后將探針DNA/Au NPs滴加到電極上反應(yīng)，用大量緩沖溶液進行清洗，氮氣吹干，得到制備好的光電生物傳感器準備檢測。
[0047]本發(fā)明還提供了通過任一項的上述方法獲得的電極。
[0048]研究還發(fā)現(xiàn):CdS/Ti02/IT0電極在可見光的照射下具有強烈而穩(wěn)定的光電流，當CdS/Ti02/IT0電極修飾上肯普肽之后，然后被PKA磷酸化，光電流明顯的降低，這主要是肯普肽的位阻效應(yīng)造成的，修飾的物質(zhì)阻礙了溶液中的電子供體AA(抗壞血酸)向電極表面的擴散。
[0049]基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了一種基于量子點光電效應(yīng)的電極，包括:
[0050]導(dǎo)電基體；
[0051 ]組裝在導(dǎo)電基體上的量子點層；
[0052]偶聯(lián)在量子點層上的多肽；
[0053]所述多肽在活性待測生物酶與三磷酸腺苷ATP存在條件下，可發(fā)生磷酸化反應(yīng)。
[0054]優(yōu)選的，所述量子點層采用CdSQDs制成；
[0055]優(yōu)選的，所述多肽為肯普肽；
[0056]優(yōu)選的，所述生物酶為蛋白激酶。
[0057]優(yōu)選的，所述導(dǎo)電基體為半導(dǎo)體金屬氧化物/ITO電極，其中，半導(dǎo)體金屬氧化物為氧化鈦T12或氧化鋅ZnO。
[0058]本發(fā)明還提供了一種基于量子點激子光電效應(yīng)的光電化學(xué)傳感器，包括任一上述的工作電極。
[0059]本發(fā)明還提供了一種基于量子點光電效應(yīng)的電極的制備方法，包括:
[0060]在導(dǎo)電電極上組裝量子點，形成量子點層；
[0061]在量子點層上偶聯(lián)多肽；
[0062]所述多肽在活性待測生物酶與三磷酸腺苷ATP存在條件下，可發(fā)生磷酸化反應(yīng)。
[0063]優(yōu)選的，所述量子點層采用CdSQDs制成；
[0064]優(yōu)選的，所述多肽為肯普肽；
[0065]優(yōu)選的，所述生物酶為蛋白激酶。
[0066]優(yōu)選的，所述導(dǎo)電基體為半導(dǎo)體金屬氧化物/ITO電極，其中，半導(dǎo)體金屬氧化物為氧化鈦T12或氧化鋅ZnO。
[0067]本發(fā)明的有益效果
[0068](I)在本發(fā)明中，我們將利用QDs與Au NPs粒子之間的相互作用構(gòu)建了一種“signal off’PEC生物傳感器來檢測蛋白激酶的活性。首先，CdS QDs組裝到Ti02/IT0電極上，然后修飾上肯普肽。當PKA催化肯普肽發(fā)生磷酸化作用之后，我們利用DNA雙鏈將Au NPs通過Zr4+離子對磷酸根的螯合作用連接到磷酸化的肯普肽/Ti02/IT0電極上。在光照射下，CdS QDs輻射發(fā)光進而繼續(xù)激發(fā)Au NPs產(chǎn)生表面等離子體激元。激發(fā)狀態(tài)下，粒子間會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，能量轉(zhuǎn)移會影響CdS QDs的激子狀態(tài)從而導(dǎo)致CdS QDs的光電流強度發(fā)生一定程度的降低，通過光電流的變化來反映出蛋白激酶的活性。在本體系中，CdS QDs不僅充當光電活性物質(zhì)構(gòu)建PEC生物傳感界面，而且通過CdS QDs與Au NPs之間發(fā)生EPI實現(xiàn)信號傳導(dǎo)。本工作對蛋白激酶活性檢測提供了新的方法。
[0069](2)構(gòu)建了一種基于貴金屬納米粒子Au NPs與CdS QDs相互作用的光電化學(xué)生物傳感器來檢測蛋白激酶活性及蛋白激酶抑制劑的篩選。CdS QDs的PL譜與Au NPs的紫外吸收峰存在重疊，因此CdS QDs的PL可以激發(fā)Au NPs的LSPR，激發(fā)狀態(tài)下，Au NPs與CdS QDs之間的相互作用影響著CdS QDs的激子狀態(tài)從而導(dǎo)致系統(tǒng)光電流的猝滅，達到對蛋白激酶活性分析的效果。同時，在蛋白激酶的定量篩選及在復(fù)雜的細胞裂解液中蛋白激酶活性的分析方面，該光電化學(xué)生物傳感器表現(xiàn)優(yōu)異。因此，由于同時具備靈敏性、簡單易操作以及在細胞實驗中的實用性，該工作不僅提供了一種利用EPI能量轉(zhuǎn)移檢測蛋白激酶活性的方法，同時在臨床醫(yī)療及藥物研發(fā)方面也表現(xiàn)出了極大的潛力。
[0070](3)本發(fā)明制備方法簡單、檢測效率高、實用性強，易于推廣。
【附圖說明】
[0071]圖1(a)是基于激子-等離子激元能量相互作用的光電化學(xué)傳感器組裝示意圖和(b)實驗機理示意圖:主要過程包括光子吸收及電子從導(dǎo)帶躍迀到價帶產(chǎn)生電子-空穴對；空穴將電子供體d氧化成d+;電子從CdS QDs轉(zhuǎn)移到Ti02/IT0電極上形成光電流，用于分析蛋白激酶的活性；電子-空穴對復(fù)合包含兩部分，非輻射衰變(nD)與輻射衰變(rD)，同時伴隨CdS QDs與Au NPs之間EPI。
[0072]圖2是紫外光譜圖。其中，(A)CdSQDs(a)和Au NPs(b)的紫外吸收峰，插圖分別為所合成的CdS QDs和Au NPs溶液；(B)Au NPs(a)和DNA/Au NPs(b)的紫外譜圖。
[0073]圖3是CdS/Ti02/IT0修飾電極的穩(wěn)定性測試圖，測試在含有0.1M AA的0.1PBS溶液中進行。光密度190mWcm—2，電極反應(yīng)面積0.5 cm2。
[0074]圖4是光電化學(xué)傳感器的光電流響應(yīng)圖。其中，(a)ITO電極，(b)CdS/Ti02/IT0電極，(C)肯普肽酸化的肯普肽/CdS/Ti02/IT0電極的光電流響應(yīng)圖。光密度190mWcm—2，電極反應(yīng)面積0.5cm2 ο
[0075]圖5是將DNA/AuNPs分別修飾到肯普肽(a)和磷酸化肯普肽(b)修飾電極上的光電流響應(yīng)圖。光密度190mWcm—2，電極反應(yīng)面積0.5cm2。
[0076]圖6是ATP濃度對光電流的影響圖。光密度190mWcm—2，電極反應(yīng)面積0.5cm2。
[0077]圖7是磷酸化時間對光電流的影響圖。光密度190mWcm—2，電極反應(yīng)面積0.5cm2。
[0078]圖8是不同濃度PKA對應(yīng)的光電流圖。內(nèi)插圖為光電流強度與PKA濃度的線性關(guān)系曲線圖。其中，光密度190mWcm—2，電極反應(yīng)面積0.5cm2 WKA的濃度為:0.00651^1/1,
0.0075UmL—1，0.0 lUmL—1,0.015UmL—1，0.025UmL_1，0.05UmL—1，0.06UmL—1，0.065UmL—1。
[0079]圖9是用激活劑Forskolin和抑制劑ellagicacid分別處理細胞MCF-7得到的細胞裂解液中的PKA所對應(yīng)的光電流響應(yīng)圖。光密度190mWcm—2，電極反應(yīng)面積0.5cm2。
【具體實施方式】
[0080]以下通過實施例對本發(fā)明特征及其它相關(guān)特征作進一步詳細說明，以便于同行業(yè)技術(shù)人員的理解:
[0081 ] 實施例1
[0082]I實驗部分
[0083]1.1實驗試劑與材料
[0084]蛋白激酶PKA，抑制劑縣花酸4,4/,5,5',6,6'_137hexahydroxydiphenicacid 2，6 , 2'，6, -di lactone (El lagic acid)，絡(luò)氨酸抑制劑N-138 (3-chloropheny I) -6，7-dimethoxy-4-quinazolinamine(Tyrphos-139tinAG1478)，激活劑毛喉素ForskoI in和IBMX購于Sigma公司；肯普肽(Cysteine-terminated kemptide(CLRRASLG))購于GL b1chem(上海，中國);ATP由鼎國生物試劑公司提供;氯金酸HAuCl4.3H20(48 % w/w)購自于上海試劑公司；CdCl2 2.5H20購于Aladdin試劑公司(上海，中國)，其他試劑均購自于北京化學(xué)品公司。
[0085]1.2實驗儀器
[0086]光電系統(tǒng)用到的光源為氙燈，采用460nm以上波長的可見光濾光片，輻照強度為190mW/cm2;光電實驗在CHI802B電化學(xué)工作站上進行(上海辰華)，使用三電極體系(參比電極:Ag/AgCI電極，對電極:鈾絲電極，工作電極:1TO電極)，試驗過程在恒定電壓(0V vs飽和Ag/AgCl)下進行，以含有0.1M抗壞血酸為電子供體的PBS磷酸鹽溶液為反應(yīng)溶液;UV-vis紫外吸收光譜由UV-3900紫外分光光度計上進行(Hitachi ,Japan)。
[0087]1.3CdS QDs、Au NPs和探針DNA/Au NPs的合成
[0088]TGA修飾的CdS QDs參照文獻方法合成并稍作修改。在10mL三頸瓶中加入50mL
0.0lM CdCl2溶液和250yL TGA，攪拌同時向溶液中通入氮氣30min。在此期間，使用IM的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液的pH到一定數(shù)值。然后加入5.0mL 0.1M Na〗S溶液，氮氣環(huán)境下下110°(:加熱回流4h。
[0089]Au NPs的合成:10mL 0.01 % (w/v)的氯金酸水溶液置于磁力攪拌器上攪拌加熱至沸騰，之后1% (w/v)檸檬酸鈉水溶液快速加入沸騰的氯金酸溶液中，當溶液變?yōu)榫萍t色時，停止加熱得到Au NPs，將其置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0090]DNA/Au NPs探針的合成:DNAi(5'-SH-C6-ATCGTTTAGGATTTGGATGA-P-3' WPDNA2(3'-GCAAATCCTAAAC)配置成10—6M的溶液，之后混合搖床37°C雜交孵育一個小時，待反應(yīng)完全結(jié)束后將雜交后的DNA雙鏈加入ImL的Au NPs溶液中，室溫攪拌24h之后，將150yL IM的氯化鈉溶液逐滴緩慢加入，放置24h，最后，混合溶液在12000rpm每分鐘的情況下離心15min兩次，撇去上清液，將沉淀重新分散于包含有300mM的氯化鈉，50mM的Tris-HCI溶液中。之后將修飾有DNA的Au NPs在紫外下進行表征。
[0091 ] 1.4電極的組裝及肯普肽在電極上的磷酸化反應(yīng)
[0092]ITO玻璃依次在丙酮、氫氧化鈉(IM)的乙醇水(1: lv/v)溶液、水中超聲清洗15min，然后將其放在90°C烘箱中12h，烘干備用。預(yù)處理之后的ITO玻璃取出之后，滴加0.5mg/mL的氧化鈦于固定面積(0.5cm2)的ITO玻璃片之上，之后將其放入200°C環(huán)境中15h。之后將電極依次浸入2%PDDA(用0.5M NaCl溶液配制)1min，取出后用水洗滌，再放入CdS QDs溶液中l(wèi)Omin，取出后用水洗滌，重復(fù)之后得到所需的多層膜修飾電極。
[0093]肯普肽通過CdSQDs表面的羧基與肯普肽表面的氨基通過EDC偶聯(lián)到一起。首先，室溫下，將CdS/Ti02/IT0電極浸入EDC與NHS溶液中60min，清洗過后將50μ!4^度為500μΜ的肯普肽溶液滴加到電極上室溫黑暗處反應(yīng)12h使得肯普肽連接到電極上，二次水清洗之后氮氣吹干，得到肯普肽修飾的電極；ImM的6-氨基己酸封閉空白位點30min以減輕非特異性吸附，之后用二次水淋洗并用N2干燥;含有一系列濃度的PKA和ATP的緩沖溶液(50mMTris-HCl and 20mM MgCl2,pH 7.4)滴加到電極上，在37°C下反應(yīng)80min之后滴加50yL的Zr4+溶液；Ih后將探針DNA/Au NPs滴加到電極上反應(yīng)，用大量緩沖溶液進行清洗，氮氣吹干，得到制備好的光電生物傳感器準備檢測。
[0094]1.5細胞的培養(yǎng)與細胞裂解液的提取
[0095]MCF-7細胞分成三組，在DMEM細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。在5 %⑶2、37 °C下培養(yǎng)，在添加激活劑和抑制劑之前，改用無血清培養(yǎng)基(ImL)培養(yǎng)四小時，隨后，細胞被分別加入蛋白激酶激活劑(毛喉素For sko I in，IBMX)和蛋白激酶抑制劑(e11agi c ac id)使其最終濃度分別為25μΜ，最后一組為對照組。經(jīng)過一段時間的孵育之后，細胞分別加入2mL的細胞裂解液，五分鐘之后，對三組細胞裂解液進行離心，最后將獲得的上清液存在_80°C處備用。
[0096]細胞裂解液中的I3KA活性檢測通過將獲得的細胞裂溶解于不同的I3KA緩沖溶液(50mM Tris-HCl，20mM MgCl2,ΙΟΟμΜ ATP,pH 7.4)中，對細胞中的PKA活度的光學(xué)檢測與單獨PKA蛋白激酶的活性方法相同。
[0097]2.實驗結(jié)果與討論
[0098]2.1PEC傳感器的組裝及實驗原理
[0099]PEC傳感器的組裝及檢測PKA活性機理如圖1所示，肯普肽在蛋白激酶及ATP與金屬鎂離子的存在下，由于蛋白激酶的催化，其絲氨酸上的羥基會被ATP中的磷酸基取代從而發(fā)生肯普肽磷酸化。由于金屬離子Zr4+對磷酸基團的絡(luò)合作用，因此，一端修飾有磷酸根的DNA/Au NPs探針與磷酸化的肯普肽被Zr4+連接到一起。在可見光的照射下，由于CdS QDs和Au NPs之間的吸收峰有明顯的重合，有利于激發(fā)這兩種粒子分別產(chǎn)生激子和等離子體激元，從而迅速產(chǎn)生EPI ο抗壞血酸在此方法中作為電子供體，使體系不斷產(chǎn)生連續(xù)、穩(wěn)定的光電流。隨著激酶活度的不同，光電流的變化也會隨之變化，由此達到靈敏高效檢測蛋白激酶的目的。圖1 (a)基于激子-等離子激元能量相互作用的光電化學(xué)傳感器組裝示意圖。(b)實驗機理示意圖:主要過程包括光子吸收及電子從導(dǎo)帶躍迀到價帶產(chǎn)生電子-空穴對;空穴將電子供體d氧化成d+;電子從CdS QDs轉(zhuǎn)移到Ti02/IT0電極上形成光電流，用于分析蛋白激酶的活性;電子-空穴對復(fù)合包含兩部分，非輻射衰變(nD)與輻射衰變(rD)，同時伴隨CdS QDs與Au NPs之間EPI。
[0100]2.2CdS QDs、Au NPs和DNA/Au NPs的表征
[0101]由圖2A可以看到，CdSQDs具有較寬的吸收譜，適合作為PEC活性基底材料。此外，CdS QDs還具有一個對稱的峰值在約510nm的發(fā)射峰(曲線a)。曲線b是所制備的Au NPs的吸收譜，在約522nm處呈現(xiàn)出典型的表面等離子體共振(LSPR)吸收峰。很明顯，CdS QDs的熒光發(fā)射譜與Au NPs的SPR吸收譜之間有著較大的譜圖重疊，這將有利于在Au NPs的表面引發(fā)SPR進而在兩者粒子之間產(chǎn)生EPI相互作用。圖2B為DNA/Au NPs探針的紫外表征:紫外可見分光光度計證明Au NPs吸收峰在522nm處(a)，而DNA修飾到Au NPs之后可以看到，Au NPs的紫外吸收峰由522nm紅移到529nm(b)，這是由于雜交鏈的DNA修飾到Au NPs所引起的，由此證明DNA/Au NPs的成功組合。
[0102]2.3CdS/Ti02/IT0電極的光電性能
[0103]對于PEC生物傳感器來說，具有穩(wěn)定響應(yīng)的基底是非常重要的。因此，我們對所制備的CdS/Ti02/ITO修飾電極的光響應(yīng)穩(wěn)定性進行了考查。如圖3所示，當光照射電極時，產(chǎn)生的光電流迅速上升達到穩(wěn)定值，這說明CdS QDs中快速的電荷分離以及CdS QDs與T12/ITO電極之間高效的電子轉(zhuǎn)移。控制每次光照的時間為50s，對電極連續(xù)激發(fā)10次以上，由圖看見，光電流信號穩(wěn)定并且?guī)缀鯖]有任何衰減的現(xiàn)象。這表明制備的CdS/Ti02/IT0修飾電極在AA溶液中有良好的穩(wěn)定性，比較適合構(gòu)建PEC生物傳感器。
[0104]2.4光電化學(xué)傳感器的光電流響應(yīng)
[0105]本節(jié)討論了本體系構(gòu)建的光電化學(xué)傳感器的光電流行為。圖4為在可見光照射下，在含有0.1M抗壞血酸的0.1M PBS緩沖溶液中測量得到的修飾電極的光電流圖。由圖4中可見，CdS/Ti02/IT0電極在可見光的照射下具有強烈而穩(wěn)定的光電流，當CdS/Ti02/IT0電極修飾上肯普肽之后，然后被PKA磷酸化，光電流明顯的降低，這主要是肯普肽的位阻效應(yīng)造成的，修飾的物質(zhì)阻礙了溶液中的電子供體AA(抗壞血酸)向電極表面的擴散。將探針DNA/AuNPs通過Zr4+連接到磷酸化kemptide/CdS/Ti02/IT0電極上的時候，可以觀察到光電流繼續(xù)下降。已有報道表明，在光激發(fā)條件下，當CdS QDs與Au NPs緊密靠近，激發(fā)電子便會從CdSQDs向Au NPs轉(zhuǎn)移并被捕獲，繼而與停留在CdS QDs-Au NPs界面的光生空穴非輻射復(fù)合、或者由Au NPs電子載體轉(zhuǎn)移到電極表面。由于Au NPs的存在使得CdS QDs內(nèi)部的電子-空穴在在空間分開，使得電子-空穴復(fù)合延緩，從而提高光電流的效率。然而在本體系中，肯普肽及雙鏈DNA的存在使得CdS QDs與Au NPs保持一定的距離。如果電子依舊能夠從CdS QDs轉(zhuǎn)移至IJAu NPs上同時無能量轉(zhuǎn)移的話，光電流應(yīng)該是上升的，然而事實上光電流出現(xiàn)明顯的下降。這是由于CdS QDs與Au NPs之間機理的增大，勢皇的增加極大的降低了CdS QDs與AuNPs之間的電子轉(zhuǎn)移的可能性。而Au NPs的表面引發(fā)SPR進而使CdS QDs與Au NPs兩者粒子之間產(chǎn)生EPI，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移從而使得光電流的降低。
[0106]蛋白激酶PKA能夠磷酸化肯普肽，從而通過金屬絡(luò)合將探針修飾到電極上。圖5為肯普肽連接上DNA/Au NPs探針的光電流(曲線a)探針和磷酸化的肯普肽連接上DNA/Au NPs(曲線b)對比圖。由圖5可見，當肯普肽沒有被蛋白激酶PKA磷酸化時，修飾電極的光電流值比較大，這是因為沒有被磷酸化的肯普肽不能被Zr4+離子將DNA/Au NPs連接到電極上，沒有EPI反應(yīng)，因此產(chǎn)生強烈的光響應(yīng)。而肯普肽被磷酸化之后，由于Zr4+對磷酸根具有絡(luò)合作用，一端含有磷酸基的DNA/Au NPs探針被修飾到電極上，在可見光的照射下，CdS QDs與AuNPs之間發(fā)生EPI能量轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致光電流明顯的降低。
[0107]2.5光實驗條件的優(yōu)化
[0108]在肯普肽的磷酸化過程中，ATP提供了磷酸根的供體，在磷酸化的過程中起著至關(guān)重要的作用，因此，我們對實驗所用的ATP的濃度進行了優(yōu)化。由圖6可見，光電流的變化值隨著ATP的濃度的增加而增大，當ATP的濃度達到10mM時光電流變化值得到最大，隨著ATP的濃度繼續(xù)增加，光電流變化值不再變化，因此本實驗選取ATP的濃度為10mM時進行實驗。
[0109]在酶催化實驗中，反應(yīng)時間也很重要。如圖7所示，隨著磷酸化時間的延長，光電流的變化值逐漸增大，當磷酸化時間達到SOmin時達到最大，之后不再變化，因為本發(fā)明選擇80min的磷酸化時間。
[0110]2.6PKA的光電化學(xué)檢測
[0111]EPI作用強度與蛋白激酶的活性相關(guān)。蛋白激酶活性的強弱決定著修飾到電極上的DNA/Au NPs的量的多少，從而影響EPI的強度大小，因此，通過檢測光電流的變化我們可以實現(xiàn)對蛋白激酶活性的分析。在最優(yōu)條件下，我們利用構(gòu)建的光電化學(xué)傳感器對蛋白激酶PKA的活度進行了分析。圖8為不同的PKA激酶所對應(yīng)的光電流的變化值。由圖8可見，隨著PKA濃度的增加，光電流不斷降低。在PKA的濃度為0.0065?0.065U/mL范圍內(nèi)，光電流呈線性下降，線性方程為I = 1.178-5.601 X C，相關(guān)系數(shù)R = 0.994，其中，I為光電流的強度，c為蛋白激酶PKA的活度，求得檢測限為0.00591ML—1 (S/N = 3)。為了考察本體系對構(gòu)建的檢測PKA激酶活性的光電生物傳感器的重復(fù)性，我們利用五根相同組裝的電極對同一活度(0.5UmL—1)的PKA進行檢測，測得其RSD = 6.15%,重復(fù)性良好。
[0112]2.7細胞裂解液中PKA活性的檢測
[0113]當?shù)鞍准っ傅谋磉_發(fā)生異常的時候，能夠?qū)е露喾矫娴募毎麊栴}，比如細胞的增值和分化以及腫瘤的生長等。除此之外，蛋白激酶還是一些腫瘤的標志物等，因此，本體系將構(gòu)建的生物傳感器還應(yīng)用到了 MCF-7細胞內(nèi)的蛋白激酶PKA的活性檢測。將MCF-7細胞用鞣花酸和毛喉素培養(yǎng)后裂解細胞得到細胞裂解液，然后分別測量不同的細胞裂解液中的蛋白激酶的活性。圖9為其對應(yīng)的光電流相應(yīng)圖?？梢钥吹?，當MCF-7細胞用用鞣花酸處理后，其裂解液中的PKA活度最低，而用毛喉素處理的細胞裂解液測得的蛋白激酶的活度最高。證明本體系構(gòu)建的光電傳感界面可以應(yīng)用于在細胞裂解液中對蛋白激酶活性的分析及蛋白激酶抑制劑的篩選，為在細胞中進行蛋白激酶活性分析及蛋白激酶抑制劑的篩選提供理論依據(jù)。
[0114]最后應(yīng)該說明的是，以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種基于激子-等離子激元能量相互作用的電極，其特征在于，包括: 導(dǎo)電基體； 組裝在導(dǎo)電基體上的量子點QDs層； 偶聯(lián)在量子點層上的多肽； 修飾在所述導(dǎo)電基體上的一端含有磷酸基的DNA/Au NPs探針； 所述多肽在活性待測生物酶與三磷酸腺苷ATP存在條件下，可發(fā)生磷酸化反應(yīng)。2.如權(quán)利要求1所述的電極，其特征在于，所述量子點層采用CdSQDs制成； 或所述納米貴金屬為納米金Au NPs； 或所述多肽為肯普肽； 或所述生物酶為蛋白激酶； 優(yōu)選的，所述導(dǎo)電基體為半導(dǎo)體金屬氧化物/ITO電極，其中，半導(dǎo)體金屬氧化物為氧化鈦T12或氧化鋅ZnO。3.—種基于激子-等離子激元能量相互作用的光電化學(xué)傳感器，其特征在于，包括權(quán)利要求I或2的所述的工作電極。4.一種基于激子-等離子激元能量相互作用檢索蛋白激酶活性的光電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述光電化學(xué)傳感器包括工作電極，所述工作電極包括: 導(dǎo)電基體； 組裝在導(dǎo)電基體上的量子點層； 偶聯(lián)在量子點層上的多肽； 修飾在所述導(dǎo)電基體上的一端含有磷酸基的DNA/Au NPs探針； 所述多肽在活性待測生物酶與三磷酸腺苷ATP存在條件下，可發(fā)生磷酸化反應(yīng)。5.—種基于激子-等離子激元能量相互作用的電極的制備方法，其特征在于，包括: 在導(dǎo)電電極上組裝量子點，形成量子點層； 在量子點層上偶聯(lián)多肽； 在所述導(dǎo)電基體上修飾一端含有磷酸基的DNA/Au NPs探針； 所述多肽在活性待測生物酶與三磷酸腺苷ATP存在條件下，可發(fā)生磷酸化反應(yīng)。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述量子點為CdSQDs; 或所述納米貴金屬為納米金Au NPs； 或所述多肽為肯普肽； 或所述生物酶為蛋白激酶； 優(yōu)選的，所述導(dǎo)電基體為半導(dǎo)體金屬氧化物/ITO電極，其中，半導(dǎo)體金屬氧化物為氧化鈦T12或氧化鋅ZnO。7.能通過權(quán)利要求5-6任一項的方法獲得的電極。8.一種基于量子點激子光電效應(yīng)的電極，其特征在于，包括: 導(dǎo)電基體； 組裝在導(dǎo)電基體上的量子點層； 偶聯(lián)在量子點層上的多肽； 所述多肽在活性待測生物酶與三磷酸腺苷ATP存在條件下，可發(fā)生磷酸化反應(yīng)。9.如權(quán)利要求8所述電極，其特征在于，所述量子點層采用CdSQDs制成； 或所述多肽為肯普肽； 或所述生物酶為蛋白激酶； 優(yōu)選的，所述導(dǎo)電基體為半導(dǎo)體金屬氧化物/ITO電極，其中，半導(dǎo)體金屬氧化物為氧化鈦T12或氧化鋅ZnO。10.—種基于量子點激子光電效應(yīng)的光電化學(xué)傳感器，其特征在于，包括權(quán)利要求8或9所述的電極。
【文檔編號】G01N21/552GK105938095SQ201610300655
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年5月9日
【發(fā)明人】趙凱, 閆志勇, 王宗花
【申請人】青島大學(xué)