專利名稱：一種檢測血清結締組織生長因子用試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種用于肝纖維化實驗室檢測的試劑盒，特別涉及一種檢測血清結締組織生長因子用試劑盒。
背景技術：
目前，在肝纖維化的實驗室診斷方面，多以檢測細胞外間質(extracellulatrix,ECM)及其代謝產物作為輔助診斷指標。目前，臨床較為常用的實驗項目有111型前膠原(Procollagen III, PC III )、IV型膠原(Collagen IV,CIV)、層粘蛋白(Laminin, LN)和透明質酸(Hyaluronicacid, HA)。但在臨床上，由于多種原因使得這些實驗項目其診斷肝纖維化靈敏度與特異性均不夠理想。因此，對于肝纖維化的實驗室診斷尋找新的指標仍是臨床上亟待解決的問題。 肝纖維化的輔助診斷的另外一些重要實驗室指標，如細胞因子類項目可在大多數(shù)肝纖維化患者發(fā)生顯著變化，但是目前臨床實際應用的并不普遍。所以，仍需探索在診斷肝纖維化方面特異性好、靈敏度高且操作方便的方法。發(fā)明內容為了探索現(xiàn)有技術存在的診斷肝纖維化的特異性不好、靈敏度不高的缺點，本實用新型公開了一種檢測血清結締組織生長因子用試劑盒，具有較好的特異性和靈敏度，操作簡便。本實用新型的技術方案為一種檢測血清結締組織生長因子用試劑盒，所述試劑盒由盒體和盒蓋組成，盒體內分隔為試劑區(qū)和設備區(qū)，在試劑區(qū)設有9個試劑儲液單元，分別為CTGF標準品儲液單元、1:100生物素標記的CTGF抗體儲液單元、1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液單元、標準品和標本用稀釋液儲液單元、生物素化抗體稀釋液儲液單元、酶結合物稀釋液儲液單元、濃縮洗滌液儲液單元、TMB顯色劑儲液單元、終止劑儲液單元，在設備區(qū)設有封口膜、若干包被板條和一個包被板條支架。所述的包被板條活動設于包被板條支架上。所述的包被板條為矩形板,板上設有12個盛液孔。所述的CTGF標準品儲液單元的容積為O. 5ml、所述的1:100生物素標記的CTGF抗體儲液單元的容積為150 μ I、所述的1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液單元的容積為150 μ I、所述的標準品和標本用稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的生物素化抗體稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的酶結合物稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的濃縮洗滌液儲液單元的容積為20ml、所述的TMB顯色劑儲液單元的容積為12ml、所述的終止劑儲液單元的容積為12ml。有益效果I.應用CTGF診斷肝纖維化患者的靈敏度可以達到65. 5%，特異度達到91. 1%0CTGF為診斷肝纖維化較為敏感的實驗室指標。操作簡便。
圖I為本實用新型試劑盒打開狀態(tài)下的結構示意圖。其中I為試劑區(qū)，2為設備區(qū)。
具體實施方式
檢測原理CTGF是ー種具有多種生理功能的細胞因子，作為轉化生長因子(TGF-β)的下游作用因子，它主要由成纖維細胞等間質細胞產生，反過來又介導TGF-β對間質細胞的作用，可促進細胞增生和細胞外基質(ECM)合成、分泌膠原成份等。通過免疫組化和原位雜交等方法已經證實，當肝纖維化時CTGF水平明顯增高，并可分泌進入外周血中，血清中的
CTGF主要來自于肝臟。當患者為肝纖維化患者時，患者的CTGF會出現(xiàn)大幅的升高。本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人結締組織生長因子(CTGF)水平。首先用純化的CTGF單體包被微孔板，制成固相抗體；向包被單抗的微孔中加入血清，血清中CTGF與單抗結合后，再與生物素標記的CTGF單體結合，形成抗體-抗原-生物素標記抗體復合物，經過徹底洗滌后，再加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HRP)結合物，最后形成抗體-抗原-生物素標記抗體-鏈霉親和素標記HRP的結合物。經過再次徹底洗滌后，カロTMB底物，TMB在HRP的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成黃色。顏色的深淺和樣品中的CTGF呈正比。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(Α值)，通過標準曲線計算樣品中CTGF濃度。一種檢測血清結締組織生長因子用試劑盒，所述試劑盒由盒體和盒蓋組成，盒體內分隔為試劑區(qū)和設備區(qū)，在試劑區(qū)設有9個試劑儲液單元，分別為CTGF標準品儲液單元、I 100生物素標記的CTGF抗體儲液單元、1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液単元、標準品和標本用稀釋液儲液単元、生物素化抗體稀釋液儲液単元、酶結合物稀釋液儲液単元、濃縮洗滌液儲液単元、TMB顯色劑儲液單元、終止劑儲液單元，在設備區(qū)設有封ロ膜、若干包被板條和ー個包被板條支架。所述的CTGF標準品儲液單元的容積為O. 5ml、所述的1:100生物素標記的CTGF抗體儲液單元的容積為150μ I、所述的1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液単元的容積為150 μ I、所述的標準品和標本用稀釋液儲液単元的容積為16ml、所述的生物素化抗體稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的酶結合物稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的濃縮洗滌液儲液單元的容積為20ml、所述的TMB顯色劑儲液單元的容積為12ml、所述的終止劑儲液單元的容積為12ml。所述的包被板條活動設于包被板條支架上。所述的包被板條為矩形板，板上設有12個盛液孔。所述的包被板條一般每盒配置8條。包被板條和包被板條支架均為PP或是PE制成，包被板條支架的形狀與包被板條的形狀相適應。試劑盒中的各個試劑儲液單元可以內設具有不同顔色瓶蓋的試劑瓶，以示區(qū)分。具體使用方法為將標本或是CTGF標準品以標準品和標本用稀釋液稀釋到合適濃度，洗滌液以濃縮洗滌液按要求配制，I 100生物素標記的CTGF單抗以生物素化抗體稀釋液稀釋到合適濃度，I 100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶以酶結合物稀釋液稀釋到合適濃度得到酶結合物工作液。從試劑盒中取出包被板條，將稀釋好的標本或是CTGF標準品按50 μ I/孔加入到相應的包被板孔中，空白孔除外。用封ロ膜封孔，37°C 60min后用洗滌液洗滌包被板條4次。再加入稀釋好的生物素化抗體100 μ I/孔。用封ロ膜封孔，37°C 30min后用洗滌液洗滌包被板條4次。加入酶結合物工作液ΙΟΟμ I/孔，用封口膜封孔，37°C 30min后用洗滌液洗滌包被板條4次。然后各孔加100 μ I的TMB顯色劑，37°C避光15min。每孔再加終止液50 μ 1，充分混合后以空白調零，在450nm波長處測量吸光度(A)值。以標準品的濃度為橫坐標，標準品對應A值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的A值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品CTGF的實際濃度。采用本實用新型所述的試劑盒進行實驗，結果如下I.檢測線性范圍0 64 ug/L范圍內CTGF和A值呈良好的線性關系(R2=O. 995，P<Q. 001)。2.檢測靈敏度與精密度檢測靈敏度O. 2 ug/L ;高、低2 份不同CTGF標準品的批內CV分別為4. 5%、9. 8%，批間CV分別為10. 1%、12. 8%，符合ELISA試驗批內、批間CV分別不超過10%和15%要求。3.回收實驗低值、中值和高值的回收率分別為為98. 2%、101. 9%和103. 8%，均在95% 105%范圍內。4.特異性試驗結果按優(yōu)化的 ELISA 條件，取 10 ug/L LPDGF_BB、EGF、IGF_I、FGF以及10名健康人混合血清作為被檢標本，所有孔的A45tl值與標準曲線上空白孔A值相近，與加入10 ug/L CTGF標準品孔的A450值差異有統(tǒng)計學意義U= 11. 321，P=O. 000)，表明未發(fā)生交叉反應，該方法有較強的特異性。5.血清CTGF與4項肝纖維化指標的相關性分析264例慢性肝病(CHB)血清CTGF和4項肝纖維化指標相關性分析，結果顯示，CTGF與HA、PCIII、CIV、LN均呈正相關(r值分別為O. 367,0. 424,0. 528和O. 434，產均〈O. 05)。CHB患者血清CTGF含量與其肝纖維化分期顯著相關(rM). 689，/X0. 001)。6. CTGF臨床應用肝纖維化診斷效率分析將CTGF與HA、PCIII、LN和CIV實驗數(shù)據(jù)通過受試工作曲線(ROC)分析，結果經ROC曲線分析比較，264例CHB患者CTGF及4項肝纖維化相關指標的診斷性能顯示，CTGF區(qū)分輕度肝纖維化(S0 SI)和明顯肝纖維化組(S2 S4)的曲線下面積(AUC)為 0.841 (95% Cl O. 762 O. 920)，高于 HA 的 O. 797(95% Cl 0. 703 O. 891)，PCIII 的 O. 777 (95% Cl 0. 680 O. 873)，LN 的 O. 767 (95%Cl :0· 670 O. 863 )和 CIV 的 O. 744 (95 % Cl 0. 643- 0.845)。用 ROC 曲線分析比較CTCF, HA、PC III、C IV及LN在診斷最佳臨界值時的敏感度、特異度、預測值(陽性和陰性)和約登指數(shù)。當CTGF在臨界值為10. 3 ug/L時，敏感度為70. 5%，其特異度(82. 4%)、陽性預測值(79. 8%)和約登指數(shù)(O. 53)在5項指標中最高，且預測明顯纖維化的ROC曲線下面積最大。
權利要求1.一種檢測血清結締組織生長因子用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由盒體和盒蓋組成，盒體內分隔為試劑區(qū)和設備區(qū)，在試劑區(qū)設有9個試劑儲液單元，分別為CTGF標準品儲液單元、I 100生物素標記的CTGF抗體儲液單元、1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液単元、標準品和標本用稀釋液儲液単元、生物素化抗體稀釋液儲液単元、酶結合物稀釋液儲液單元、濃縮洗滌液儲液単元、TMB顯色劑儲液單元、終止劑儲液單元，在設備區(qū)設有封ロ膜、若干包被板條和ー個包被板條支架。
2.根據(jù)權利要求I所述檢測血清結締組織生長因子用試劑盒，其特征在于，所述的包被板條活動設于包被板條支架上。
3.根據(jù)權利要求I或2所述檢測血清結締組織生長因子用試劑盒，其特征在于，所述的包被板條為矩形板，板上設有12個盛液孔。
4.根據(jù)權利要求I所述檢測血清結締組織生長因子用試劑盒，其特征在于，所述的CTGF標準品儲液單元的容積為O. 5ml、所述的1:100生物素標記的CTGF抗體儲液單元的容積為150 μ I、所述的1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液単元的容積為150 μ I、所述的標準品和標本用稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的生物素化抗體稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的酶結合物稀釋液儲液単元的容積為16ml、所述的濃縮洗滌液儲液單元的容積為20ml、所述的TMB顯色劑儲液單元的容積為12ml、所述的終止劑儲液単元的容積為 12ml。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測血清結締組織生長因子用試劑盒，所述試劑盒由盒體和盒蓋組成，盒體內分隔為試劑區(qū)和設備區(qū)，在試劑區(qū)設有9個試劑儲液單元，分別為CTGF標準品儲液單元、1:100生物素標記的CTGF抗體儲液單元、1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液單元、標準品和標本用稀釋液儲液單元、生物素化抗體稀釋液儲液單元、酶結合物稀釋液儲液單元、濃縮洗滌液儲液單元、TMB顯色劑儲液單元、終止劑儲液單元，在設備區(qū)設有封口膜、若干包被板條和一個包被板條支架。具有操作簡便，靈敏度高，特異性好的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK202661471SQ20122034521
公開日2013年1月9日 申請日期2012年7月17日 優(yōu)先權日2012年7月17日
發(fā)明者王念躍 申請人:南京市第二醫(yī)院