專利名稱：卡那霉素抗性標記的轉(zhuǎn)基因莖瘤芥篩選方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，特別涉及一種卡那霉素抗性標記的轉(zhuǎn)基因莖瘤芥篩選方法。
背景技術(shù)：
莖瘤芥(Brassicajuncea var.tumida Tsen et Lee),又稱青菜頭，是十字花科蕓薹屬植物，該屬包含許多有重要經(jīng)濟價值的油料、蔬菜、飼料作物，如油菜、白菜、甘藍等，莖瘤芥為榨菜的主要原料，口感鮮嫩、營養(yǎng)豐富，是我國重慶、四川、浙江等地區(qū)主要的經(jīng)濟作物之一。多年來，莖瘤芥的相關(guān)研究主要集中在遺傳育種、良種繁育、栽培技術(shù)、品質(zhì)安全等領域，近年才陸續(xù)有生物學方面研究的報道，包括基因的克隆、功能研究以及莖瘤芥瘤狀莖膨大相關(guān)研究，企圖通過基因工程方法提高莖瘤芥的產(chǎn)量、質(zhì)量以及抗病性、抗逆性等。莖瘤芥轉(zhuǎn)基因方法目前主要采用的方法為:取外植體進行組織培養(yǎng)，再通過農(nóng)桿菌浸染外植體使農(nóng)桿菌中攜帶的外源基因轉(zhuǎn)化至外植體中從而獲得轉(zhuǎn)基因植株，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法如文獻《芥菜轉(zhuǎn)基因再生體系的建立》(楊朝輝等，作物學報)和《芥菜cry2基因RNAi載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化研究》(梁婷等，安徽農(nóng)業(yè)科學)，其中農(nóng)桿菌中的重組表達質(zhì)粒除攜帶外源基因序列外，通常還有抗生素抗性標記基因以便篩選轉(zhuǎn)基因植株，當農(nóng)桿菌侵染外植體后，通過添加相應抗生素以篩選獲得可能的轉(zhuǎn)基因植株。通過組培方法篩選獲得的存活下來的植株，由于添加抗生素的濃度和時間可能不適宜(濃度和時間不適宜會導致非轉(zhuǎn)化體逃離篩選)或者由于采用較低的抗生素濃度篩選(采用較低的抗生素濃度是增加再生苗甚至是轉(zhuǎn)基因苗數(shù)量的方法，因為濃度低則選擇壓小，則愈傷組織會更多地生長和分化，因此非轉(zhuǎn)化體數(shù)量會增多)，則再生苗中很可能多數(shù)是假轉(zhuǎn)化體，因此后續(xù)必須對這些植株進行進一步的分子生物學篩選，比如提取植株的DNA與RNA進行基因的PCR、RT-PCR、Southern雜交、Northern雜交，甚至Western雜交以確保為轉(zhuǎn)基因植株。另外，農(nóng)桿菌侵染獲得的第一代轉(zhuǎn)基因植株還是雜合子，若要進行功能分析和研究，必須獲得純合子，那么，同樣地，需要進行大量的篩選，篩選放方法仍然為提取植株的DNA與RNA進行基因的PCR、RT-PCR、Southern雜交、Northern雜交,甚至Western雜交。然而,提取植株的DNA與RNA、Southern雜交、Northern雜交等這些分子生物學技術(shù)需要使用大量試劑和耗材，而且特異性越強的檢測技術(shù)所需的費用越昂貴，檢測周期長，并且操作復雜，當篩選的植株的量大時顯然成本高昂而且費時費力。為節(jié)省實驗成本，CN102696477A和CN102217472A分別公開了用卡那霉素溶液浸種篩選轉(zhuǎn)基因棉花和卡那霉素涂抹葉片篩選轉(zhuǎn)基因蘿卜的方法，但兩者所采用的卡那霉素濃度高，分別為1000-1500mg/L和1000mg/L，后者篩選時間長，需12天；另外，棉花種子大適合浸種篩選，莖瘤芥種子相對棉花非常小，不適宜對種子進行抗生素處理；而且，不同物種、不同組織對同一濃度抗生素的承受能力均不同，因此，更不能將上述篩選棉花和蘿卜的方法直接應用于莖瘤芥的轉(zhuǎn)基因篩選。
因此，需要一種快速簡單的篩選轉(zhuǎn)基因莖瘤芥的方法，尤其是當篩選植株量較大時，可以節(jié)約實驗成本和時間成本，以實現(xiàn)初步篩選，縮小后續(xù)分子生物學實驗的篩選范圍。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，為節(jié)約實驗成本，縮小分子生物學實驗(如提取植株的DNA與RNA進行基因的PCR、RT-PCR、Southern雜交、Northern雜交,甚至Western雜交等)的篩選范圍，本發(fā)明提供一種簡單、低成本的轉(zhuǎn)基因莖瘤芥初步篩選的方法，采用的技術(shù)方案是:通過切取莖瘤芥植株的一小片葉片，并將切下的葉片于含有生長素和抗生素的水溶液中觀察葉片的黃化程度來判斷是否為轉(zhuǎn)基因植株，具體方法為:切取莖瘤芥植株的葉片，放入含6-芐氨基腺嘌呤和卡那霉素的水溶液的檢測液中，并觀察所述葉片是否黃化死亡，若是則判斷為非轉(zhuǎn)基因植株，若否則判斷為轉(zhuǎn)基因植株。無卡那霉素抗性的葉片在一定濃度的卡那霉素溶液中會黃化甚至死亡，即葉片顏色由綠色變?yōu)辄S色或褐色，由此作為判斷轉(zhuǎn)基因植株的特征；生長素6-芐氨基腺嘌呤可以幫助切下的葉片保持一定生存能力。進一步地,所述葉片為新生嫩葉，葉面積為2_4cm2，即新長出來的葉面積在2_4cm2的葉片；6_芐氨基腺嘌呤和卡那霉素的濃度分別為lmg/L和120mg/L，且觀察5-6天后所述葉片是否黃化死亡。由于不同種植物、甚至同種植物的不同組織器官對同一濃度的抗生素的承受能力均不同，因此必須通過梯度試驗獲得檢測液中卡那霉素的最佳濃度以用于檢測。另外，葉片面積過大會延長黃化死亡時間，不利于篩選；葉片過小又不能起到觀察黃化程度變化的過程，從而導致判斷失誤。進一步地，所述黃化死亡指所述葉片的黃化面積比例為80-100%。當黃化面積達80%,實驗證明葉片已經(jīng)不能進行正常的生存代謝，時間再延長2-3天必定全部黃化即死亡。特別地，在判斷是否為轉(zhuǎn)基因植株時，我們以黃化死亡為判定準則，因為只有黃化死亡才能為我們提供更正確的判定結(jié)果，才能嚴格為后續(xù)的分子生物學實驗縮小篩選范圍。進一步地,所述葉面積為3cm2。進一步地，所述觀察的天數(shù)為5天。實驗證明5天后葉片均黃化死亡，為減少觀察的時間，5天即可。本發(fā)明中，通過切取莖瘤芥葉片并放入含6-芐氨基腺嘌呤和卡那霉素的檢測液中觀察是否黃化死亡來判斷轉(zhuǎn)基因與否的方法，實驗成本低，方法簡單，在lmg/L6-芐氨基腺嘌呤和120mg/L卡那霉素的檢測液中，5-6天即可快速篩選，正確率高；當篩選的植株量大時，該篩選方法尤其適用，可以大大縮小進一步進行分子生物學實驗驗證轉(zhuǎn)基因植株的范圍，節(jié)約人力物力，節(jié)約試劑和時間。


圖1為本發(fā)明野生型葉片在不同濃度卡那霉素檢測液中5天的黃化情況圖；圖2為本發(fā)明lmg/L6-BA和120mg/L Kana檢測液篩選轉(zhuǎn)基因葉片的葉片黃化情況圖；圖3為本發(fā)明葉片篩選轉(zhuǎn)基因后又進一步以基因組DNA為模板PCR擴增目的基因驗證的電泳圖。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例和附圖來詳細說明本發(fā)明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應用范圍。本發(fā)明不限于下述實施方式或?qū)嵤├?，凡不違背本發(fā)明精神所做出的修改及變形，均應包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。1、通過葉片篩選莖瘤芥轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素濃度梯度實驗:由于不同種植物、甚至同種植物的不同組織器官對同一抗生素的承受能力均不同，因此要獲取切下的莖瘤芥葉片對卡那霉素的承受程度以選擇合適的抗生素濃度需要做梯度試驗，方法如下:十月中旬將莖瘤芥種子(品種為永安小葉，購買于重慶市涪陵農(nóng)科所)野生型播種于地里；同時將本實驗室獲得的超表達莖瘤芥光敏色素A的轉(zhuǎn)基因莖瘤芥種子和超表達莖瘤芥光敏色素B的轉(zhuǎn)基因莖瘤芥種子(二者均攜帶nptll基因，可以采用卡那霉素篩選)播種于地里。播種一個半月后切取野生型和轉(zhuǎn)基因莖瘤芥的新生嫩葉，其葉面積為3-4cm2，在不同濃度的檢測液中檢測葉片的黃化情況以判斷是否為轉(zhuǎn)基因植株(沒有抗性的葉片，在抗生素環(huán)境下將逐步黃化死亡)。檢測液為含lmg/L的生長素6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和不同濃度的卡那霉素(簡寫為Kana)，其中卡那霉素的濃度設有六個梯度，為:20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L。上述播種的3個品種莖瘤芥均切取葉片于各個濃度中進行檢測，每個品種、每個濃度均檢測10片嫩葉，并重復3次，在10小時光照、14小時黑暗、20°C條件下培養(yǎng)并定期觀察葉片變色情況，葉片的黃化面積比例達80%認為葉片死亡，定期觀察為每24小時觀察I次。檢測統(tǒng)計結(jié)果見表I，可見，野生型葉片在120mg/L卡那霉素檢測液5天(即葉片放入檢測液中120小時)時黃化面積達80-100%，即葉片全部死亡；野生型葉片在160mg/L卡那霉素檢測液4天(96小時)時黃化面積達80_100%，即葉片全部死亡；野生型葉片在200mg/L卡那霉素檢測液2天(48小時)時黃化面積達80_100%，即葉片全部死亡。圖1所示為5天時不同濃度卡那霉素的檢測液中野生型葉片的黃化程度，從左至右依次為 20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L,黃化程度約為 0_5%、15-30%、40-60%、80_100%。根據(jù)表1，轉(zhuǎn)基因葉片在160mg/L卡那霉素檢測液2_3天就會出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，200mg/L卡那霉素檢測液中黃化現(xiàn)象嚴重，說明轉(zhuǎn)基因植株不能承受較高濃度的卡那霉素選擇壓。從時間上、黃化程度上考慮，并參照野生型黃化數(shù)據(jù)(參照野生型黃化數(shù)據(jù)較好，因為不同的轉(zhuǎn)基因植株的抗性效率會有差異，有不確定性)，最終選擇最佳的卡那霉素濃度為120mg/L以篩選轉(zhuǎn)基因植株較合適，即如果葉片于含lmg/L6-BA和120mg/L Kana的檢測液中5天仍不死亡則初步判斷為轉(zhuǎn)基因植株。表I不同濃度卡那霉素檢測液中葉片黃化程度統(tǒng)計
權(quán)利要求
1.一種卡那霉素抗性標記的轉(zhuǎn)基因莖瘤芥篩選方法，其特征在于，切取莖瘤芥的葉面積為2-4cm2的新生葉片，放入含lmg/L6-芐氨基腺嘌呤和120mg/L卡那霉素的水溶液的檢測液中5-6天，觀察所述葉片是否黃化死亡，若是則判斷為非轉(zhuǎn)基因植株，若否則判斷為轉(zhuǎn)基因植株。
2.如權(quán)利要求1所述的卡那霉素抗性標記的轉(zhuǎn)基因莖瘤芥篩選方法，其特征在于，所述黃化死亡指所述新生葉片的黃化面積比例為80-100%。
3.如權(quán)利要求1所述的卡那霉素抗性標記的轉(zhuǎn)基因莖瘤芥篩選方法，其特征在于，所述新生葉片的葉面積為3cm2。
4.如權(quán)利要求1所述的卡那霉素抗性標記的轉(zhuǎn)基因莖瘤芥篩選方法，其特征在于，將所述新生葉片放入含lmg/L6-芐氨基腺嘌呤和120mg/L卡那霉素的水溶液的檢測液中5天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種卡那霉素抗性標記的轉(zhuǎn)基因莖瘤芥篩選方法，所述方法通過切取莖瘤芥葉片并放入含6-芐氨基腺嘌呤和卡那霉素的水溶液的檢測液中觀察葉片是否黃化死亡來判斷轉(zhuǎn)基因與否，實驗成本低，方法簡單；當篩選的植株量大時，該方法尤其適用，可以大大縮小進一步進行分子生物學實驗驗證轉(zhuǎn)基因植株的范圍，節(jié)約人力物力，節(jié)約試劑和時間。
文檔編號G01N21/25GK103149157SQ20121059231
公開日2013年6月12日 申請日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
發(fā)明者向瀏欣, 蔡應繁, 付于銀, 劉吉軍, 冉燕子, 王秋娟, 王小艷 申請人:重慶郵電大學