專(zhuān)利名稱(chēng)：一種具有降血糖功能制劑的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具降血糖功能制劑的檢測(cè)方法，特別是指一種以L(fǎng)-阿拉伯糖與殼寡糖為主要原料制成的復(fù)方制劑檢測(cè)方法，屬于對(duì)食品或保健食品進(jìn)行質(zhì)量控制的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
一種具有降血糖功能制劑是本申請(qǐng)人研制的一種由以L(fǎng)-阿拉伯糖與殼寡糖為主要原料制成的復(fù)方制劑，參見(jiàn)本申請(qǐng)人于2012-09-10申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?01210333553X名稱(chēng)為一種具有輔助降血糖功能的組合物及其制品的專(zhuān)利申請(qǐng)，殼寡糖是由2-20個(gè)D-氨基葡萄糖通過(guò)β -1, 4糖苷鍵組成的水溶性低聚糖，是殼聚糖經(jīng)化學(xué)或酶降解后的產(chǎn)物，L-阿拉伯糖為戊醛單糖，通常與其他單糖結(jié)合，以雜多糖形式廣泛地存在于植物中。臨床實(shí)驗(yàn)證明，兩者均有降血糖作用，將殼寡糖與L-阿拉伯糖進(jìn)行聯(lián)合服用具有協(xié)同作用，通過(guò)結(jié)合殼寡糖的促進(jìn)人體胰島素分泌、增加胰島受體敏感性作用，與L-阿拉伯糖抑制蔗糖降解、降低葡萄糖吸收作用相結(jié)合，起到雙向調(diào)節(jié)作用，可有效地將血糖值控制在人體正常范圍內(nèi)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)產(chǎn)品安全穩(wěn)定、質(zhì)量可控有著重要的意義,本品為復(fù)方制劑,對(duì)產(chǎn)品中功效成分進(jìn)行定性或定量測(cè)定，將提高產(chǎn)品質(zhì)量的可控度，保證產(chǎn)品療效。鑒于目前尚無(wú)制劑中殼寡糖鑒別方法、L-阿拉伯糖含量測(cè)定方法，本發(fā)明將首次建立制劑中殼寡糖鑒別方法及L-阿拉伯糖含量測(cè)定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所述的一種含有L-阿拉伯糖與殼寡糖、具降血糖功能制劑的質(zhì)量控制方法，包括性狀、檢查、鑒別和含量測(cè)定，其中鑒別將采用化學(xué)顯色法和薄層色譜法對(duì)制劑中殼寡糖進(jìn)行鑒別，含量測(cè)定采用高效液相色譜法對(duì)衍生化的L-阿拉伯糖進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)文獻(xiàn)查詢(xún)及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，本品原料殼寡糖為多糖類(lèi)成分，無(wú)法提供標(biāo)準(zhǔn)品，故無(wú)法進(jìn)行含量測(cè)定，但其分子結(jié)構(gòu)中有特征性的游離氨基，因而可以對(duì)水解后產(chǎn)生的特有氨基葡萄糖進(jìn)行Elson — Morgan法鑒別及薄層鑒別，專(zhuān)屬性強(qiáng)。L-阿拉伯糖可以采用高效液相法進(jìn)行含量測(cè)定，但采用高效液相-示差檢測(cè)器、高效液相-蒸發(fā)光檢測(cè)器法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，多糖殼寡糖對(duì)L-阿拉伯糖的測(cè)定存在嚴(yán)重干擾，而采用柱前衍生-高效液相-紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，可以有效的降低含量測(cè)定的干擾?！N具有降血糖功能制劑的質(zhì)量控制方法，該制劑以L(fǎng)-阿拉伯糖與殼寡糖為主要原料提取制成，分別對(duì)L-阿拉伯糖與殼寡糖進(jìn)行定量測(cè)定和定性鑒別，其中，對(duì)L-阿拉伯糖的定量測(cè)定方法如下:向待測(cè)試樣中加入氫氧化鈉溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入適量鹽酸中和，濾膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定；
對(duì)殼寡糖的定性鑒別采用化學(xué)顯色鑒別或薄層色譜鑒別。所述高效液相色譜測(cè)定的色譜條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，O.1-ο. 2mol/L pH5. 0-6. O醋酸銨緩沖溶液-乙腈為流動(dòng)相，醋酸銨緩沖溶液_乙腈的體積比為 80-70 20 :30，檢測(cè)波長(zhǎng)為 244-252nm。所述反應(yīng)樣品溶液中L-阿拉伯糖濃度為O. 0133mol/L時(shí)，氫氧化鈉溶液的濃度為O. 07-0. 15mol/L,1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液濃度為O. 2-0. 4mol/L,即控制氫氧化鈉、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮和L-阿拉伯糖三者的摩爾比為5. 22-11. 18
11.21-22. 43 :1。所述衍生化反應(yīng)條件為60-80°C水浴中反應(yīng)至少30min，每10_20min振搖一次。所述化學(xué)顯色鑒別方法為根據(jù)殼寡糖酸性條件下與乙酰丙酮縮合形成生色原2-甲基-3- 二乙酰吡咯衍生物，生色原再與對(duì)-二甲基苯甲醛在濃鹽酸甲醇溶液中發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成紫色溶液，從而進(jìn)行鑒別。所述薄層色譜鑒別方法是以鹽酸水解后的殼寡糖為供試品，鹽酸氨基葡萄糖為對(duì)照品，以體積比7-9:3-1的甲醇氨水為展開(kāi)劑，茚三酮試液為顯色劑的薄層色譜鑒別方法。本發(fā)明建立的一種具有降血糖功能制劑的質(zhì)量控制方法，根據(jù)殼寡糖分子中特征氨基基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)顯色法鑒別，或以鹽酸氨基葡萄糖為對(duì)照品對(duì)水解后的殼寡糖進(jìn)行薄層鑒別，對(duì)制劑中L-阿拉伯糖采用衍生化后，采用高效液相色譜-紫外光譜法進(jìn)行測(cè)定，可實(shí)現(xiàn)對(duì)具有降血糖功能制劑的良好質(zhì)量控制。


附圖1為本發(fā)明的化學(xué)顯色鑒別試驗(yàn)圖譜，其中I為空白溶劑，2為陰性空白，3為對(duì)照品溶液，4為供試品溶液(批號(hào)20120501)，5為供試品溶液(批號(hào)20120502)，6為供試品溶液(批號(hào)=20120503)；附圖2為本發(fā)明的薄層色譜鑒別圖譜，其中I為對(duì)照品溶液，2為制劑樣品溶液，3為殼寡糖原料溶液，4為殼寡糖未水解溶液制備，5為陰性對(duì)照溶液制備；附圖3為本發(fā)明的含量測(cè)定系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)-對(duì)照品溶液圖譜，其中I為衍生試劑峰，2為衍生化L-阿拉伯糖峰；附圖4為本發(fā)明的含量測(cè)定系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)-供試品溶液圖譜，其中I為衍生試劑峰，2為衍生化L-阿拉伯糖峰；附圖5為本發(fā)明的含量測(cè)定系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)-陰性對(duì)照溶液圖譜，其中I為衍生試劑峰；圖6為具體實(shí)施方式
的4. 4節(jié)中L-阿拉伯糖含量線(xiàn)性范圍圖。
具體實(shí)施例方式為了便于理解本發(fā)明，特列舉以下實(shí)施例。其作用被理解為是對(duì)本發(fā)明的闡釋而非對(duì)本發(fā)明的任何形式的限制。實(shí)施例一一種具有降血糖功能制劑的化學(xué)顯色鑒別法考察殼寡糖的鑒別實(shí)驗(yàn)參照Elson-Morgan法進(jìn)行,并加以改進(jìn)。其原理是殼寡糖經(jīng)鹽酸水解可生成氨基葡萄糖單糖，氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)中的游離氨基在堿性條件下與乙酰丙酮縮合形成生色原2-甲基3- 二乙酰吡咯衍生物，生色原再與P-DABA (對(duì)-二甲氨基苯甲醛)在濃鹽酸甲醇溶液中發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成紫色溶液。試驗(yàn)方法供試品溶液制備取本品內(nèi)容物O. lg，置具塞試管中，加鹽酸3ml，密塞，水浴加熱3小時(shí)，冷卻至室溫后，加水IOml分次洗滌蒸發(fā)皿中，蒸干，加水30ml分次溶解，濾過(guò)，濾液合并至50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，即得。對(duì)照品溶液制備取氨基葡萄糖鹽酸鹽對(duì)照品適量，加水制成每Iml含O. 5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。陰性對(duì)照溶液制備取缺殼寡糖樣品(即L-阿拉伯糖)O. 05g，置具塞試管中，力口鹽酸3ml，密塞，水浴加熱3小時(shí)，冷卻至室溫后，加水IOml分次洗滌蒸發(fā)皿中，蒸干，加水30ml分次溶解，濾過(guò)，濾液合并至50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，即得。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各5ml分別置具塞試管中，另取具塞試管I支，加蒸餾水5ml作為溶劑空白，各加乙酰丙酮試液(取乙酰丙酮2ml，加
O.5mol/L碳酸鈉溶液至50ml，臨用前配置)1. 0ml，搖勻，置沸水浴中，加熱25分鐘，取出，用冰水迅速冷卻后，加對(duì)二甲氨基苯甲醛試液(對(duì)二甲氨基苯甲醛O. Sg,加無(wú)醛乙醇15ml及鹽酸15ml,搖勻)1. Oml,即可。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，供試品溶液與對(duì)照品譜，均顯紫紅色，陰性對(duì)照溶液與空白試劑均未顯色，故本方法可用于殼寡糖的鑒別。結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)上述化學(xué)顯色鑒別法考察結(jié)果，制定一種具有降血糖功能制劑中殼寡糖化學(xué)顯色鑒別方法如下取本品內(nèi)容物O. lg，置具塞試管中，加鹽酸3ml，密塞，水浴加熱3小時(shí)，冷卻至室溫后，加水IOml分次洗滌蒸發(fā)皿中，蒸干，加水30ml分次溶解，濾過(guò)，濾液合并至50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，取5ml置具塞試管中，加乙酰丙酮試液(取乙酰丙酮2ml，加O. 5mol/L碳酸鈉溶液至50ml，臨用前配置)1. Oml，搖勻，置沸水浴中，加熱25分鐘，取出，用冰水迅速冷卻后，加對(duì)二甲氨基苯甲醛試液(對(duì)二甲氨基苯甲醛O. Sg，加無(wú)醛乙醇15ml及鹽酸15ml,搖勻)1. Oml,即顯紫紅色。實(shí)施例二一種具有降血糖功能制劑的薄層色譜鑒別法考察對(duì)殼寡糖水解產(chǎn)物氨基葡萄糖進(jìn)行薄層色譜法鑒別，以鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品，由于結(jié)構(gòu)中2位羥基被氨基取代，而呈現(xiàn)堿性，因而采用甲醇/濃氨水、氯仿/甲醇/濃氨水等展開(kāi)劑系統(tǒng)進(jìn)行考察，結(jié)果以甲醇/濃氨水為展開(kāi)系統(tǒng)分離度好，斑點(diǎn)清晰，展開(kāi)效果好，制劑樣品色譜中、殼寡糖原料色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且缺殼寡糖的陰性對(duì)照色譜、未水解殼寡糖色譜中無(wú)干擾，圖譜見(jiàn)附圖2。實(shí)驗(yàn)方法如下對(duì)照品溶液制備取鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品，加水制成每Iml含5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。制劑樣品溶液制備取本品內(nèi)容物O. lg，置具塞試管中，加鹽酸3ml，密塞，水浴加熱3小時(shí)，冷卻至室溫后，加水IOml分次洗滌蒸發(fā)皿中，蒸干，加水30ml分次溶解，濾過(guò)，濾液合并至50ml量瓶中，取20ml濃縮至5ml，即得。
殼寡糖原料溶液制備取殼寡糖0.05g，置25ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，即得。殼寡糖未水解溶液制備取殼寡糖0.05g,置具塞試管中，按制劑樣品溶液制備方法制備，即得。陰性對(duì)照溶液制備取缺殼寡糖的陰性對(duì)照樣品(即L-阿拉伯糖)0.05g，按制劑樣品溶液制備方法制備，即得。 點(diǎn)樣對(duì)照品溶液、制劑樣品溶液、殼寡糖原料溶液、殼寡糖未水解溶液和陰性對(duì)照溶液各2 μ I薄層板硅膠G板展開(kāi)劑甲醇:濃氨水=9: I展開(kāi)方式展開(kāi)劑預(yù)平衡30分鐘，上行展開(kāi)定位取出，晾干，105°C烘3分鐘，噴以茚三酮試液，105°C下烘干，置日光下檢視。根據(jù)上述薄層色譜鑒別法考察結(jié)果，制定一種具有降血糖功能制劑中殼寡糖薄層鑒別方法如下:取本品內(nèi)容物0.lg，置具塞試管中，加鹽酸3ml，密塞，水浴加熱3小時(shí)，冷卻至室溫后，加水IOml分次洗滌蒸發(fā)皿中，蒸干，加水30ml分次溶解，濾過(guò)，濾液合并至50ml量瓶中，取20ml濃縮至5ml，作為供試品溶液；同時(shí)取鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品，加水制成每Iml含5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，甲醇-氨水(9:1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，105°C下烘3分鐘，噴以茚三酮試液，105°C下烘干，置日光下檢視，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的紫色斑點(diǎn)。實(shí)施例三一種具有降血糖功能制劑的含量測(cè)定方法選擇研究目前并沒(méi)有針對(duì)制劑中L-阿拉伯糖的定量測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)，考慮糖類(lèi)可經(jīng)衍生化后轉(zhuǎn)變成具有紫外吸收的物質(zhì)，使原本難以檢測(cè)的成分可以用常用的紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，本專(zhuān)利首次針對(duì)制劑中L-阿拉伯糖采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)進(jìn)行衍生化處理，對(duì)樣品前處理過(guò)程中衍生試劑用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、堿用量、有機(jī)試劑萃取次數(shù)等衍生條件進(jìn)行了考察，結(jié)合高效液相色譜法，得出L-阿拉伯糖含量測(cè)定條件。3.1液相條件及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，分別對(duì)①水-乙腈(75:25)②0.15mol/L(pH5.5)醋酸銨緩沖溶液-乙腈(75:25)③0.lmol/L(pH6.5)磷酸鹽緩沖溶液三種流動(dòng)相體系進(jìn)行考察，采用DAD檢測(cè)器。樣品前處理方法:精密稱(chēng)取0.2g L-阿拉伯糖置IOOml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，取2ml置具塞試管中，加入0.lmol/L NaOH溶液2ml，再加入0.2mol/LPMP甲醇溶液1.5ml，控制反應(yīng)溫度為70°C，反應(yīng)60min，期間每20min振搖一次，反應(yīng)結(jié)束后放入冷水中冷卻至室溫，并加入0.lmol/L HCL溶液2.5ml中和，用水洗至IOOml容量瓶中，并用水定容至刻度，微孔濾膜過(guò)濾后，取10μ I注入色譜儀，記錄色譜圖，同時(shí)以試劑為空白同法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在醋酸銨緩沖溶液-乙腈流動(dòng)性體系條件下，L-阿拉伯糖衍生峰系統(tǒng)適應(yīng)性最佳，理論塔板數(shù)大于4000，與衍生試劑峰分離度大于1.5，因而選擇0.15mol/L(pH5.5)醋酸銨緩沖溶液-乙腈(75:25)為液相測(cè)定方法。同時(shí)根據(jù)DAD全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，L-阿拉伯糖色譜峰在248nm處有最大吸收，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本液相條件適用于L-阿拉伯糖衍生峰的含量測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為248nm。3.2衍生試劑去除考察衍生反應(yīng)完成后通常需使用有機(jī)溶劑萃取多余的衍生試劑，以消除衍生試劑對(duì)樣品測(cè)定色譜峰的干擾。本實(shí)驗(yàn)對(duì)衍生反應(yīng)結(jié)束后試液的氯仿萃取過(guò)程進(jìn)行考察。取0.2gL-阿拉伯糖溶于IOOml水中，取2ml置具塞試管中，加入0.lmol/L NaOH溶液2ml，再加入
0.2mol/L PMP甲醇溶液1.5ml，控制反應(yīng)溫度為70°C，反應(yīng)60min，期間每20min振搖一次，反應(yīng)結(jié)束后加入適量HCL中和，用水洗至50ml容量瓶中，并用水定容至刻度，取IOml置分液漏斗中，分別用氯仿IOml萃取一次和兩次后，水溶液蒸干，用水溶解并稀釋定容至25ml容量瓶中，采用HPLC分析，取未萃取溶液10ml，用水稀釋定容至25ml容量瓶中，采用HPLC分析，結(jié)果見(jiàn)表1。表1萃取次數(shù)-去除率/回收率考察[0057權(quán)利要求
1.一種具有降血糖功能制劑的質(zhì)量控制方法，該制劑以L(fǎng)-阿拉伯糖與殼寡糖為主要原料提取制成，其特征在于:分別對(duì)L-阿拉伯糖與殼寡糖進(jìn)行定量測(cè)定和定性鑒別，其中，對(duì)L-阿拉伯糖的定量測(cè)定方法如下:向待測(cè)試樣中加入氫氧化鈉溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入適量鹽酸中和，濾膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定；對(duì)殼寡糖的定性鑒別采用化學(xué)顯色鑒別或薄層色譜鑒別。
2.如權(quán)利要求1所述的一種具有降血糖功能制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于:所述高效液相色譜測(cè)定的色譜條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，0.1-0.2mol/LpH5.0-6.0醋酸銨緩沖溶液-乙腈為流動(dòng)相，醋酸銨緩沖溶液-乙腈的體積比為80-70:20:30，檢測(cè)波長(zhǎng)為244-252nm。
3.如權(quán)利要求1所述的一種具有降血糖功能制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于:所述衍生化反應(yīng)過(guò)程中，控制氫氧化鈉、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮和L-阿拉伯糖三者的摩爾比為 5.22-11.18:11.21-22.43:1。
4.如權(quán)利要求1所述的一種具有降血糖功能制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于:所述衍生化反應(yīng)條件為:60-80°C水浴中反應(yīng)至少30min，每10-20min振搖一次。
5.如權(quán)利要求1所述的一種具有降血糖功能制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于:所述化學(xué)顯色鑒別方法為根據(jù)殼寡糖酸性條件下與乙酰丙酮縮合形成生色原2-甲基-3- 二乙酰吡咯衍生物，生色原再與對(duì)-二甲基苯甲醛在濃鹽酸甲醇溶液中發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成紫色溶液，從而進(jìn)行鑒別。
6.如權(quán)利要求1 所述的一種具有降血糖功能制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于:所述薄層色譜鑒別方法是以鹽酸水解后的殼寡糖為供試品，鹽酸氨基葡萄糖為對(duì)照品，以體積比7-9:3-1的甲醇:氨水為展開(kāi)劑，茚三酮試液為顯色劑的薄層色譜鑒別方法。
全文摘要
一種具有降血糖功能制劑的質(zhì)量控制方法，該制劑以L(fǎng)-阿拉伯糖與殼寡糖為主要原料提取制成，分別對(duì)L-阿拉伯糖與殼寡糖進(jìn)行定量測(cè)定和定性鑒別，其中，對(duì)L-阿拉伯糖的定量測(cè)定方法如下向待測(cè)試樣中加入氫氧化鈉溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入適量鹽酸中和，濾膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定；對(duì)殼寡糖的定性鑒別采用化學(xué)顯色鑒別或薄層色譜鑒別，可實(shí)現(xiàn)對(duì)具有降血糖功能制劑的良好質(zhì)量控制。
文檔編號(hào)G01N30/90GK103076325SQ201210592158
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者李仲樹(shù), 周麗娟, 賴(lài)榮勝, 王英, 李新南, 傅珊珊 申請(qǐng)人:廈門(mén)金日制藥有限公司