專利名稱：利用腸球菌抗生素抗性識別海洋水體糞便污染來源的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用腸球菌抗生素抗性識別海洋水體糞便污染來源的方法，具體地說，涉及一種包括腸球菌分離純化步驟、已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫的建立與分析步驟和海洋水體糞便污染溯源分析步驟的利用腸球菌抗生素抗性識別海洋水體糞便污染來源的方法。
背景技術：
糞便污染源示蹤技術是利用不同動物糞便源本身所含有的示蹤因子(化學物、微生物)的特異性，通過一系列實驗技術針對水環(huán)境中的示蹤因子的特異性加以檢測識別以溯源的過程。該技術利用環(huán)境水體中的糞便污染指示菌來追蹤宿主源，基因型(如脈沖場凝膠電泳法)和表型方法的應用尤其廣泛。盡管基因方法重現(xiàn)性好，但因其高成本，操作復雜，對儀器設備要求高等特點不容易推廣。表型方法中的抗生素抗性分析法只需基因型方法成本的一小部分，因操作簡單、用時短、對指示細菌種群的要求低等優(yōu)點而得到了廣泛應用?？股乜剐苑治龇椒☉玫睦碚摶A是寄住于不同物種源腸道內(nèi)的同種菌群因其生活的抗生素環(huán)境的不同，攜帶了帶有其宿主特異性的抗生素抗性指紋，技術應用的關鍵首先要構建一個已知源指示細菌抗生素抗性指紋圖譜庫。指示細菌的選擇是糞便污染源示蹤技術的基礎和關鍵部分。腸球菌為革蘭氏陽性需氧及兼性厭氧菌，是人和溫血動物腸道內(nèi)的長期寄住菌群，主要包括糞腸球菌、屎腸球菌、鳥腸球菌等，多數(shù)能在含6. 5% NaCl、40%膽鹽、pH 9. 6的介質(zhì)中生長，與其他指示細菌 (如大腸埃希氏菌)相比，具有對外界環(huán)境溫度適應性強、抵抗力強及耐受性強、可以與多種抗生素相抵抗、生長營養(yǎng)要求不高等優(yōu)點，相較于其他菌種更適合作為糞便污染指示細菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用腸球菌抗生素抗性識別海洋水體糞便污染來源的方法，該方法包括腸球菌分離純化步驟，在該步驟中，選擇合適梯度體積的糞便樣本，以帶柵格纖維濾膜和腸球菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)，在36士 1°C下培養(yǎng)2天后挑取符合腸球菌形態(tài)特征的菌落進行2 3次純化，對經(jīng)生化鑒定后確定為腸球菌的菌株進行保存；已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫的建立與分析步驟，在該步驟中，采用瓊脂擴散法，以MH瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)，檢測腸球菌對10種常用抗生素的抗藥性，以“1”表示抗藥，“0”表示敏感表示各菌株的抗藥表型，即各菌株的抗生素抗性指紋，構建已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫，采用數(shù)據(jù)分析軟件對圖譜庫進行判別分析；海洋水體糞便污染溯源分析步驟，在該步驟中，采用數(shù)據(jù)分析軟件，將從海洋水體樣本中分離得到的未知源腸球菌的抗生素抗性指紋與已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫進行比對，依據(jù)相似性大小排序確定其最大可能來源，并據(jù)此對采樣海域水體中的糞便污染進行溯源。本發(fā)明提供的腸球菌分離純化步驟包括1.選擇合適梯度體積的糞便樣本，以帶柵格纖維濾膜和腸球菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)，在36士 1°C條件下培養(yǎng)2天后挑取符合腸球菌形態(tài)特征的菌落進行2 3次純化， 對經(jīng)生化鑒定后確定為腸球菌的菌株進行保存；2.在腸球菌分離純化步驟中，腸球菌生化鑒定要求對每株菌均需進行接觸酶實驗、10°C和45°C生長驗證實驗、耐高鹽實驗、耐高PH實驗、牛奶中0. 亞甲基藍還原性實驗共6種實驗，對6種實驗要求均完全滿足的為腸球菌。本發(fā)明提供的腸球菌分離純化步驟可以大批量處理糞便樣本，實現(xiàn)對腸球菌的快速分離與純化。本發(fā)明提供的已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫的建立與分析步驟包括1.采用瓊脂擴散法，以MH瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)，檢測腸球菌對10種常用抗生素的抗藥性，以“ 1”表示抗藥，“0”表示敏感表示各菌株的抗藥表型，即各菌株的抗生素抗性指紋， 構建已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫，采用數(shù)據(jù)分析軟件對圖譜庫進行判別分析。2.圖譜庫建立方法選用的常用抗生素為青霉素G、四環(huán)素、利福平、萬古霉素、紅霉素、呋喃妥因、氯霉素、環(huán)丙沙星、磷霉素、高濃度慶大霉素共10種，本方法要求檢測每株菌株對全部10種抗生素的抗藥表型，并進行抗藥性結果判讀。3.圖譜庫分析方法應用數(shù)據(jù)分析軟件，采用判別分析法對圖譜庫進行分析，以源驗證和交叉驗證得到的平均正確歸類率評估腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫的歸類準確性。本發(fā)明提供的已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫的建立與分析步驟可用于大批量檢測腸球菌的抗藥性，能夠滿足對圖譜庫建立與分析的時效性與準確性要求，可以用于圖譜庫的快速建立與準確分析。本發(fā)明提供的海洋水體糞便污染溯源分析步驟包括在該步驟中，將從海洋水體樣品中分離得到的未知源腸球菌的抗生素抗性指紋與已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫進行比對，應用數(shù)據(jù)分析軟件的判別分析程序進行未知源菌株的歸類識別，依據(jù)相似性大小排序確定其最大可能來源，并據(jù)此對采樣海域水體中的糞便污染進行溯源。本發(fā)明提供的海洋水體糞便污染溯源分析步驟可以用于準確、高效識別海洋水體糞便污染來源，及時有效地為近岸海域糞便污染監(jiān)測與管理提供依據(jù)。本發(fā)明方法的優(yōu)點體現(xiàn)在識別海洋水體糞便污染來源的準確性高，檢測時間短，一般在48個小時即可得到結果；操作簡便易行，具備微生物操作基礎即可實現(xiàn)；對儀器要求不高，檢測成本低，適于推廣；可以進行大批量檢測；可用于細菌抗生素學調(diào)查和研究。
具體實施例方式本發(fā)明優(yōu)選采用的腸球菌分離純化步驟包括(1)糞便樣本采集以無菌采樣勺采取新鮮糞便樣本放入無菌帶塞試管，4°C保存運輸，并在M小時內(nèi)處理。( 樣本前處理按1 10比例加入無菌生理鹽水，玻璃棒研磨，渦旋振蕩器振蕩5分鐘混勻，用無菌生理鹽水稀釋至合適梯度；(3)濾膜抽濾應用濾膜法，以0. 45 μ m帶柵格纖維濾膜和腸球菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)，在36士 1°C條件下培養(yǎng)48小時。(4)菌株純化選擇胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)，挑取白色，點狀，帶棕黑色暈圈的腸球菌劃線分離，進行2 3次的純化。(5)生化鑒定對純化后的腸球菌進行包括接觸酶實驗、10°C和45°C生長驗證實驗、耐高鹽實驗、耐高PH實驗、牛奶中0. 亞甲基藍還原性實驗共6種實驗的生化鑒定。(6)菌株保存將完全符合6種生化鑒定實驗指標的菌株配置成含有30%甘油的菌液，-20°C冷凍保存。本發(fā)明所采用的已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫的建立與分析步驟包括(I)MH平板制備用90毫米直徑培養(yǎng)皿配置MH培養(yǎng)基，pH值7. 2 7. 4，厚度為 4毫米。(2)幼齡菌菌懸液的制備將菌種接種到增菌液37°C，llOr/min振蕩培養(yǎng)18小時，將菌懸液稀釋到0. 5麥氏單位，菌液濃度達到1 X IO8 2 X 108cellS/mL。(3)接種細菌及貼紙片移取0. 2ml菌液至MH平板，涂布均勻，待干后，將藥敏紙片均勻貼于培養(yǎng)基表面，每種平板三個平行。(4)培養(yǎng)15分鐘內(nèi)將平板放入恒溫培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)18 M小時后用游標卡尺讀取抑菌圈的直徑。(5)抗生素抗性結果判定抗藥性結果判讀按照美國臨床實驗室標準化委員會頒布的《紙片法抗菌藥物敏感試驗的執(zhí)行標準》(2003版)執(zhí)行，分為“耐藥”、“中敏”、“敏感”
三個等級。(6)指紋圖譜建庫將腸球菌對10種抗生素的抗性表型數(shù)據(jù)中的耐藥數(shù)據(jù)標記為 “1”，敏感和中敏標記為“0”，以二元制表示每株腸球菌的抗生素抗性指紋，建立腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫。(7)圖譜庫分析應用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 15. O (SPSS Inc,IL,USA)中的判別分析程序對圖譜庫進行分析，以源驗證和交叉驗證得到的平均正確歸類率評估腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫的歸類準確性。本發(fā)明所采用的海洋水體糞便污染溯源分析步驟包括應用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 15. O (SPSS hc，IL，USA)中的判別分析程序，將從海洋水體樣品中分離得到的未知源腸球菌的抗生素抗性指紋與已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫進行比對，依據(jù)相似性大小排序確定其最大可能來源，并據(jù)此對采樣海域水體中的糞便污染進行溯源。本發(fā)明方法中所選用試劑和材料優(yōu)選分別為菌株分離基質(zhì)腸球菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基菌株純化基質(zhì)胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基增菌液胰蛋白胨大豆肉湯稀釋液0. 9 %生理鹽水藥敏試驗培養(yǎng)基質(zhì)MH瓊脂培養(yǎng)基濾膜0. 45 μ m帶柵格纖維濾膜
藥敏紙片青霉素G(10yg/片)、四環(huán)素(3(^8/片)、利福平(5 48/片)、萬古霉素(30 μ g/片)、紅霉素(15 μ g/片)、呋喃妥因(30 μ g/片)、氯霉素(30 μ g/片)、環(huán)丙沙星(5 μ g/片)、磷霉素(20 μ g/片)、高濃度慶大霉素(120 μ g/片)。以下通過實施例的方式具體說明本發(fā)明利用腸球菌抗生素抗性分析識別海洋水體糞便污染來源的方法。建庫實施例(1)腸球菌的分離純化采集新鮮糞便樣本，經(jīng)研磨和梯度稀釋后，采用濾膜法， 以0. 45 μ m帶柵格纖維濾膜和腸球菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)，在36 士 1°C條件下培養(yǎng)4 后挑取白色，點狀，帶棕黑色暈圈的腸球菌進行2 3次的純化，對經(jīng)生化鑒定確定為腸球菌的菌株進行保存，最終得到646株來自五種不同物種源(人、狗、雞、牛、豬)的腸球菌菌株。(2)腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫的建立采用Kirby-Bauer瓊脂擴散法，以MH 瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)，檢測腸球菌對10種常用抗生素的抗藥性，以“ 1”表示抗藥，“0”表示敏感表示各菌株的抗藥表型，即抗性指紋，建立已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫，應用數(shù)學統(tǒng)計軟件SPSS 15.0 (SPSS Inc, IL,USA)中的判別分析程序對圖譜庫進行歸類準確性驗證。本圖譜庫物種源模式的源驗證和交叉驗證的平均正確歸類率分別為52. 9%和52. 2%, “人源VS動物源”模式的源驗證和交叉驗證平均正確歸類率均為70%，兩種模式各自在兩種驗證下的平均正確歸類率之差均< 5%，說明圖譜庫歸類準確性良好，實踐可用。應用實施例選擇已知源腸球菌50株作為未知源菌株，在物種源模式和“人源VS動物源”模式下應用已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫分別進行溯源，查驗歸類源與真實源之間的一致性。(1)物種源模式溯源結果由表1可知，人源，狗源，雞源，牛源，豬源的正確歸類率分別為60 %，50 %，50 %， 40%和40%。對已知源腸球菌中人源的歸類準確性較高，對牛源和豬源的歸類準確性偏低， 雞源和狗源居中。50株腸球菌整體的平均正確歸類率為48%，與圖譜庫物種源模式的交叉驗證的平均正確歸類率之差為4. 2% ( < 5% )，說明已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫在物種源模式下的歸類準確性良好，證實圖譜庫的物種源模式實踐可用。表1物種源模式溯源結果
權利要求
1.一種利用腸球菌抗生素抗性識別海洋水體糞便污染來源的方法，該方法包括腸球菌分離純化步驟，在該步驟中，選擇合適梯度體積的糞便樣本，以帶柵格纖維濾膜和腸球菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)，在36士 1°C下培養(yǎng)2天后挑取符合腸球菌形態(tài)特征的菌落進行2 3次純化，對經(jīng)生化鑒定后確定為腸球菌的菌株進行保存；已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫的建立與分析步驟，在該步驟中，采用瓊脂擴散法，以MH瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)，檢測腸球菌對10種常用抗生素的抗藥性，以“1”表示抗藥， “0”表示敏感表示各菌株的抗藥表型，即各菌株的抗生素抗性指紋，構建已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫，采用數(shù)據(jù)分析軟件對圖譜庫進行判別分析；海洋水體糞便污染溯源分析步驟，在該步驟中，采用數(shù)據(jù)分析軟件，將從海洋水體樣本中分離得到的未知源腸球菌的抗生素抗性指紋與已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫進行比對，依據(jù)相似性大小排序確定其最大可能來源，并據(jù)此對采樣海域水體中的糞便污染進行溯源。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用腸球菌抗生素抗性識別海洋水體糞便污染來源的方法， 其中在腸球菌分離純化步驟中對腸球菌進行生化鑒定時，對每株菌均需進行接觸酶實驗、 10°C和45°C生長驗證實驗、耐高鹽實驗、耐高pH實驗、牛奶中0. 亞甲基藍還原性實驗共 6種實驗，對6種實驗要求均完全滿足的為腸球菌。
3.根據(jù)權利要求1中所述的利用腸球菌抗生素抗性識別海洋水體糞便污染來源的方法，其中在已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫的建立與分析步驟中，選用的常用抗生素為青霉素G、四環(huán)素、利福平、萬古霉素、紅霉素、呋喃妥因、氯霉素、環(huán)丙沙星、磷霉素、高濃度慶大霉素共10種，本步驟要求檢測每株菌株對全部10種抗生素的抗藥表型，并進行抗藥性結果判讀。
4.根據(jù)權利要求1所述的利用腸球菌抗生素抗性識別海洋水體糞便污染來源的方法， 其中在已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫的建立與分析步驟中，應用數(shù)據(jù)分析軟件，采用判別分析法對圖譜庫進行分析，以源驗證和交叉驗證得到的平均正確歸類率評估腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫的歸類準確性。
5.根據(jù)權利要求1所述的利用腸球菌抗生素抗性識別海洋水體糞便污染來源的方法， 其中在海洋水體糞便污染溯源分析步驟中，采用判別分析法進行未知源菌株的歸類識別。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用腸球菌抗生素抗性識別海洋水體糞便污染來源的方法。本發(fā)明采用腸球菌選擇性培養(yǎng)基濾膜法分離純化腸球菌，選用瓊脂擴散法檢測腸球菌對抗生素的抗藥表型，從而建立已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫并對其進行分析，將從海洋水體樣本中分離得到的未知源腸球菌的抗生素抗性指紋與已知源腸球菌抗生素抗性指紋圖譜庫進行比對，依據(jù)相似性大小排序確定其最大可能來源，并據(jù)此識別海洋水體中糞便污染來源。本發(fā)明具有所需儀器設備簡單、檢測成本低、耗時短等優(yōu)點，能夠滿足有關研究單位、環(huán)境監(jiān)測與管理部門對近岸海域糞便污染監(jiān)測、管理的需求。
文檔編號G06F19/10GK102181513SQ201010609989
公開日2011年9月14日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權日2010年12月29日
發(fā)明者馮雯雯, 曹賓霞, 楊玉敏, 梁斌, 王耀兵, 程亮 申請人:國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心