專利名稱：循環(huán)酶法乙醇濃度檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種循環(huán)酶法檢測唾液中乙醇含量的試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，酒后引起的刑事案件和交通事故案不斷上升，2011年5月I日《中華人民共和國刑法修正案(八)》正式實施，醉酒駕駛作為危險駕駛罪被追究駕駛?cè)诵淌仑?zé)任，有關(guān)酒駕的話題再次成為人們關(guān)注的焦點。目前，許多國家都制定了血液中乙醇濃度與交通事故責(zé)任認(rèn)定的關(guān)系，建立了多 種能夠檢測血液中乙醇含量的方法，如GM/MS法等，雖然這些方法可以準(zhǔn)確定量，但是存在著購買儀器價格昂貴，檢測成本高，需專門培訓(xùn)，無法在案發(fā)現(xiàn)場快速檢測等缺點。相比之下，唾液比血液容易獲取，并且不存在交叉感染，因此基本不存在衛(wèi)生安全隱患，同時唾液采集便捷，可避免采血導(dǎo)致的疼痛，屬于無創(chuàng)診斷技術(shù)，因而人們更青睞于唾液乙醇檢測。大量研究表明，人體在攝入乙醇后唾液和血液中的乙醇含量幾乎相等，唾液/血液中乙醇的比值大約是I. 07，因此檢測唾液中的乙醇含量可以反映血液中的乙醇濃度。目前市場上有很多便于攜帶的乙醇檢測試劑條，但皆存在如下缺陷(I)試劑反應(yīng)后顏色會很快消褪；(2)反應(yīng)靈敏度較低，且生成的產(chǎn)物堆積對反應(yīng)起抑制作用，影響檢測的準(zhǔn)確度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種乙醇濃度檢測試劑盒，用該試劑盒進(jìn)行乙醇濃度檢測時簡便衛(wèi)生、速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性高，且該試劑盒易攜帶、尤其適合現(xiàn)場檢測。一種乙醇濃度檢測試劑盒，由試劑條和標(biāo)準(zhǔn)比對卡組成,其中試劑條為寬O. 5-lcm的濾紙條，濾紙條上含有固相化的乙醇氧化酶、乙醇脫氫酶、辣根過氧化物酶、還原型輔酶
1、4_乙酰氧基氮雜環(huán)丁酮(4-AAP)、苯胺類似物和呈色穩(wěn)定劑，標(biāo)準(zhǔn)比對卡包括不同乙醇濃度的顯色比對區(qū)。根據(jù)唾液和血液中乙醇含量一致性的實驗基礎(chǔ),該乙醇濃度檢測試劑盒的反應(yīng)原理為采用循環(huán)酶法進(jìn)行乙醇濃度測定，具體為在氧氣的存在下，乙醇在乙醇氧化酶的作用下生成乙醛及過氧化氫，反應(yīng)生成的乙醛在乙醇脫氫酶的作用下又能生成乙醇，形成循環(huán)反應(yīng)，這個循環(huán)反應(yīng)可以使檢測信號明顯放大，循環(huán)累計生成的過氧化氫在辣根過氧化物酶，4-AAP，苯胺類似物和呈色穩(wěn)定劑的存在下顯色，具體的反應(yīng)原理如下
權(quán)利要求
1.一種乙醇濃度檢測試劑盒，其特征在于由試劑條和標(biāo)準(zhǔn)比對卡組成，其中試劑條為寬O. 5-lcm的濾紙條，濾紙條上含有固相化的乙醇氧化酶、乙醇脫氫酶、辣根過氧化物酶、還原型輔酶1、4_乙酰氧基氮雜環(huán)丁酮、苯胺類似物和呈色穩(wěn)定劑，標(biāo)準(zhǔn)比對卡包括不同乙醇濃度的顯色比對區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乙醇濃度檢測試劑盒，其特征在于所述苯胺類似物為N-乙基-N-(2-羥基-3-丙磺基)間甲苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽，N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺鈉鹽(二水合物)，N-乙基-N- (3-磺丙基)苯胺鈉鹽，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺鈉鹽，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺鈉鹽，N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺鈉鹽，N- (2-羥基-3-磺丙基)_3，5- 二甲氧基苯胺鈉鹽，N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)_3，5- 二甲基苯胺鈉鹽中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乙醇濃度檢測試劑盒，其特征在于所述呈色穩(wěn)定劑為吐溫20、吐溫80、布里杰-35 (Bri j-35)、曲拉通100 (曲拉通X-100)等非離子表面活性劑中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乙醇濃度檢測試劑盒，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)比對卡包括乙醇濃度分別為 0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml 的五個顯色比對區(qū)。
5.權(quán)利要求I所述的乙醇濃度檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括試劑條的制備和標(biāo)準(zhǔn)比對卡的制備，其中 試劑條的制備包括以下步驟 (1)配制乙醇氧化酶、辣根過氧化物酶和乙醇脫氫酶液將乙醇氧化酶溶于PH7.0-9. O的O. I-IM三羥甲基氨基緩沖液中，使每毫升的緩沖液中酶的總活性為100-200U，再加入100-200U/ml的辣根過氧化物酶，攪拌均勻，充分溶解后，再加入乙醇脫氫酶100_500U/ml。
(2)配制4-AAP和苯胺類似物溶液將10-500mg4-AAP溶于50_500ml水中，再加入50-1000mg苯胺類似物，攪拌均勻，充分溶解后，再加入呈色穩(wěn)定劑5-15g。
(3)配制還原型輔酶I溶液將I-IOg還原型輔酶I溶于50-500ml水中。
(4)酶和底物的固相化將濾紙浸入(I)酶混合液中取出濾紙干燥；將(2)溶液滴在已干燥的濾紙上，干燥；將(3)溶液滴在已干燥的濾紙上，干燥。
(5)制備試劑條將步驟⑷中干燥后的濾紙貼在單面含膠的白色聚酯板的前端，用切紙機切成寬O. 5-lcm的長條，即成檢測試劑條； 標(biāo)準(zhǔn)比對卡的制備步驟為 將濃度為0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml的乙醇分別滴加到制備成的試紙條上，30°C熱風(fēng)、避光下干燥lOmin，用掃描儀輸入電腦中，用photoshop軟件吸管測量顏色信息，根據(jù)每個濃度梯度顏色值用Photoshope. O軟件制成5個梯度的標(biāo)準(zhǔn)比色卡，即成標(biāo)準(zhǔn)比對卡。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種循環(huán)酶法乙醇濃度檢測試劑盒及其制備方法，該試劑盒由試劑條和標(biāo)準(zhǔn)比對卡組成，其中試劑條為寬0.5-1cm的濾紙條，濾紙條上含有固相化的乙醇氧化酶，乙醇脫氫酶，還原型輔酶I，辣根過氧化物酶，4-乙酰氧基氮雜環(huán)丁酮，苯胺類似物及呈色穩(wěn)定劑，標(biāo)準(zhǔn)比對卡包括不同乙醇濃度的顯色比對區(qū)。用該試劑盒進(jìn)行檢測乙醇濃度時簡便衛(wèi)生、速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性高，且該試劑盒易攜帶、尤其適合現(xiàn)場檢測。
文檔編號G01N21/78GK102901727SQ20121043686
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者王金堂, 高偉良, 王珂, 王哲元 申請人:公安海警學(xué)院