專利名稱：一種檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的衍生化gc-ms方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的衍生化GC-MS方法，利用該方法可以測(cè)定處于不同生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)煙葉中的糖、氨基酸、有機(jī)酸、酚、萜醇等多種次生代謝物質(zhì)，是一種高通量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
煙草作為重要的模式作物及經(jīng)濟(jì)作物，人們對(duì)其化學(xué)組成有了很多了解。但是，大多數(shù)研究?jī)H限于對(duì)調(diào)制后煙葉的了解，而人們對(duì)于新鮮煙葉，包括不同生長(zhǎng)周期、不同部位煙葉的化學(xué)組成了解仍舊十分有限。次生代謝物主要是指分子量在1000以下的小分子代謝物，與植物基體抗性、信號(hào)傳導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育、植物的花色、香氣等現(xiàn)象相關(guān)。因此，了解不同時(shí)期、處于不同生長(zhǎng)周期的煙葉的代謝物組成及含量本身具有重大意義，而且是開展基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的化學(xué)平臺(tái)。盡管近幾年國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開始開展關(guān)于煙葉次生代謝物的研究工作，但是數(shù)量有限，且大都研究針對(duì)調(diào)制后煙葉。調(diào)制過程中，煙葉化學(xué)成分不斷發(fā)生化學(xué)變化，而且不同類型煙葉調(diào)制方法不同，難以進(jìn)行控制。因此，分析調(diào)制后煙葉的次生代謝物并不能反應(yīng)煙株的真實(shí)代謝過程。而建立一種檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的方法是十分必要的。衍生化 GC-MS方法可以同時(shí)檢測(cè)煙葉中有機(jī)酸、氨基酸、胺、酚、醇、糖等大多數(shù)代謝物，具有高通量特征，而且目前還無采用衍生化GC-MS測(cè)定新鮮煙葉中代謝物的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而專門提供一種檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的衍生化GC-MS方法。利用該方法可以測(cè)定處于不同生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)煙葉中的糖、氨基酸、有機(jī)酸、酚、萜醇等多種次生代謝物質(zhì)，是一種高通量測(cè)定方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
一種檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的衍生化GC-MS方法快速采集新鮮煙葉并用液氮現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行速凍，采用冷凍干燥方法除去水分后對(duì)煙葉進(jìn)行粉碎，用溶劑超聲提取煙粉中次生代謝物，對(duì)提取液上清液進(jìn)行干燥，然后對(duì)干燥后提取物進(jìn)行肟化反應(yīng)、硅烷衍生化反應(yīng)， 最后采用GC-MS進(jìn)行分析。具體步驟如下
(I)煙葉的采集、處理、干燥、粉碎快速采摘煙株指定部位煙葉，用液氮迅速冷凍以終止生命過程，冷凍干燥24h以除去煙葉水分，干燥過的煙葉粉碎至40-60目，放于-20°c冰箱保存；(2)煙葉中次生代謝物的萃取稱量10-30mg粉碎后的煙葉于I.5ml離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇-氯仿-水萃取溶劑超聲提取，超聲萃取后離心，取上清液并用氮吹儀吹干;
(3)肟化反應(yīng)向吹干的提取液基質(zhì)中加入甲氧胺鹽酸鹽溶液，斡旋震蕩后在30-40°C 下反應(yīng)70-100min ;此步驟的目的是對(duì)糖等化合物的醛基進(jìn)行肟化反應(yīng)以防止其成環(huán)，從而減少其異構(gòu)體，便于定量比較。(4)硅烷化衍生反應(yīng)在步驟(3)之后，向離心管中加入N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)，斡旋震蕩后在30-40°C下衍生25_35min ；
(5)檢測(cè)采用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)分析。色譜條件如下
色譜柱DB-5ms (30mX0. 25mmX0. 25 μ m)； 載氣，He ;流速1.0ml/ min ;進(jìn)樣口溫度290 V ;進(jìn)樣量I μ L ;分流比為10:1 ;升溫程序 60°C保持4min，然后以5°C /min的升溫速度升到310°C，保持10 min,
MS參數(shù)采用全掃描模式；采集質(zhì)量數(shù)范圍40-510。所述內(nèi)標(biāo)溶液為用萃取溶劑配制的氘代十六烷酸溶液。所述萃取溶劑甲醇-氯仿-水的配比為5 : 2 : 2。所用甲氧胺鹽酸鹽溶液濃度為20_40mg/ml，配置在吡啶溶液中，加入量為 30-70 μ I ;反應(yīng)采用水浴或搖床(空氣加熱)進(jìn)行控溫。衍生化試劑三甲基硅烷基三氟乙酰胺的加入量為30-120 μ 1，反應(yīng)采用水浴或搖床進(jìn)行控溫。在步驟(I)的處理過程中要迅速去處煙葉主脈，用錫箔紙包裹葉片部分，標(biāo)記后放入液氮中終止煙葉生命過程，并放于_80°C低溫冰箱冷凍保存，在煙葉從冰箱取出至冷凍干燥開始之前，必須用干冰包埋，進(jìn)行轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)之一是發(fā)展了適用于新鮮煙葉中次生代謝物的提取方法。由于煙葉面積較大，次生代謝物在整個(gè)煙葉分布并不均勻，不適合采用打孔取樣技術(shù)采用。而本發(fā)明的煙葉采集及提取方法可以真實(shí)反應(yīng)所在采集周期、采集部位煙葉的代謝物組成。本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)檢測(cè)新鮮煙葉中糖類、氨基酸類、有機(jī)酸類、萜醇類等大部分重要的煙草代謝物，具有高通量檢測(cè)特性。


圖I為本發(fā)明的檢測(cè)步驟流程圖。圖2為本發(fā)明所得GC-MS的全掃描色譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)施例(附圖)做進(jìn)一步描述，但并不限制本發(fā)明。實(shí)施例I :
采集實(shí)驗(yàn)室6片旺長(zhǎng)期煙株的新鮮煙葉(紅花大金元品種)，快速去除主干并用錫箔紙包裹，用液氮速凍。從液氮取出錫箔紙包，輕輕拍碎，立即用冷凍干燥機(jī)冷凍24小時(shí)取出水分，并磨碎至40-60目。稱取IOmg煙粉于I. 5ml離心管，加入200 μ I氘代十六烷酸內(nèi)標(biāo)溶液，I. Oml的5 2 2的甲醇-水-氯仿溶液，超聲提取30min, 10000r/min下離心IOmin, 取200 μ I上清液于另一 I. 5ml離心管,40°C下用氮吹儀吹干。加入30 μ I的濃度為20mg/ ml的甲氧胺鹽酸鹽溶液(配于吡啶中)，斡旋震蕩Imin后在37°C水浴中保持90min，再加入 30 μ I的TFMSA，斡旋震蕩Imin后在37°C水浴中保持90min，用GC-MS檢測(cè)。色譜條件如下
色譜柱DB-5ms (30mXO. 25mmXO. 25 μ m);載氣，He ;流速I. Oml/min ;進(jìn)樣口溫度290°C ;進(jìn)樣量lyL ;分流比為10:1 ;升溫程序60°C保持4min，然后以5°C /min的升溫速度升到310°C，保持10 min。MS參數(shù)采用全掃描模式；采集質(zhì)量數(shù)范圍40_510。全掃描色譜圖如圖2所示。在連續(xù)10日，每日進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)選取20個(gè)樣品峰，計(jì)算10次實(shí)驗(yàn)中色譜峰的面積，并計(jì)算10次實(shí)驗(yàn)各色譜峰“峰面積/內(nèi)標(biāo)面積”值(S/Srt)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，％) 和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，列于表I。其中，S/S肖的RSD〈0. 03%,保留時(shí)間RSD〈8. 9%,證明該方法具有較好的重現(xiàn)性。表 I
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的衍生化GC-MS方法，其特征在于快速采集新鮮煙葉并用液氮現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行速凍，采用冷凍干燥方法除去水分后對(duì)煙葉進(jìn)行粉碎，用溶劑超聲提取煙粉中次生代謝物，對(duì)提取液上清液進(jìn)行干燥，然后對(duì)干燥后提取物進(jìn)行肟化反應(yīng)、硅烷衍生化反應(yīng)，最后采用GC-MS進(jìn)行分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的衍生化GC-MS方法，其特征在于具體步驟如下(1)煙葉的采集、處理、干燥、粉碎快速采摘煙株指定部位煙葉，用液氮迅速冷凍以終止生命過程，冷凍干燥24h以除去煙葉水分，干燥過的煙葉粉碎至40-60目，放于-20°C冰箱保存；(2)煙葉中次生代謝物的萃取稱量10-30mg粉碎后的煙葉于I.5ml離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇-氯仿-水萃取溶劑超聲提取，超聲萃取后離心，取上清液并用氮吹儀吹干;(3)肟化反應(yīng)向吹干的提取液基質(zhì)中加入甲氧胺鹽酸鹽溶液，斡旋震蕩后在30-40°C 下反應(yīng) 70-100min ；(4)硅烷化衍生反應(yīng)在步驟(3)之后，向離心管中加入N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)，斡旋震蕩后在30-40°C下衍生25_35min ；(5)檢測(cè)采用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)分析；色譜條件如下色譜柱DB-5ms (30mX0. 25mmX0. 25 μ m)； 載氣，He ;流速1.0ml/ min ;進(jìn)樣口溫度290 V ;進(jìn)樣量I μ L ;分流比為10:1 ;升溫程序 60°C保持4min，然后以5°C /min的升溫速度升到310°C，保持10 min ；MS參數(shù)采用全掃描模式；采集質(zhì)量數(shù)范圍40-510。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的衍生化GC-MS方法，其特征在于內(nèi)標(biāo)溶液為用萃取溶劑配制的氘代十六烷酸溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的衍生化GC-MS方法，其特征在于所述萃取溶劑甲醇-氯仿-水的配比為5 : 2 : 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的衍生化GC-MS方法，其特征在于所用甲氧胺鹽酸鹽溶液濃度為20-40mg/ml，配置在吡啶溶液中，加入量為30-70 μ I ;反應(yīng)采用水浴或搖床空氣加熱進(jìn)行控溫。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的衍生化GC-MS方法，其特征在于衍生化試劑三甲基硅烷基三氟乙酰胺的加入量為30-120 μ 1，反應(yīng)采用水浴或搖床進(jìn)行控溫。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的衍生化GC-MS方法，其特征在于在步驟(I)的處理過程中要迅速去處煙葉主脈，用錫箔紙包裹葉片部分，標(biāo)記后放入液氮中終止煙葉生命過程，并放于_80°C低溫冰箱冷凍保存，在煙葉從冰箱取出至冷凍干燥開始之前，必須用干冰包埋，進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
全文摘要
一種檢測(cè)新鮮煙葉中次生代謝物的衍生化GC-MS方法，其特征是快速采集新鮮煙葉并用液氮現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行速凍，采用冷凍干燥方法除去水分后對(duì)煙葉進(jìn)行粉碎，用溶劑超聲提取煙粉中次生代謝物，對(duì)提取液上清液進(jìn)行干燥，然后對(duì)干燥后提取物進(jìn)行肟化反應(yīng)、硅烷衍生化反應(yīng)，最后采用GC-MS進(jìn)行分析。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于一是發(fā)展了適用于新鮮煙葉中次生代謝物的提取方法。由于煙葉面積較大，次生代謝物在整個(gè)煙葉分布并不均勻，不適合采用打孔取樣技術(shù)采用。而本發(fā)明的煙葉采集及提取方法可以真實(shí)反應(yīng)所在采集周期、采集部位煙葉的代謝物組成。二是可以同時(shí)檢測(cè)新鮮煙葉中糖類、氨基酸類、有機(jī)酸類、萜醇類等大部分重要的煙草代謝物，具有高通量檢測(cè)特性。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102590412SQ20121001565
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者丁麗, 劉惠民, 張麗, 楊軍, 王昇, 王曉瑜, 秦亞瓊, 謝復(fù)煒, 賈云禎 申請(qǐng)人:中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院