專利名稱：一種檢測水產(chǎn)品中呋喃西林代謝物的試劑板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種檢測水產(chǎn)品中呋喃西林代謝物的試劑板，具體涉及一種檢測呋喃西林代謝物的免疫膠體金快速檢測試劑板。
背景技術(shù)：
呋喃西林(nitmfurazone)是一種人工合成的具有5—硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥，主要通過干擾細(xì)菌體內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng)，使細(xì)菌代謝發(fā)生紊亂，從而達(dá)到殺菌防腐的效果。曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用于家禽、家畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖動物傳染病的預(yù)防和治療，也曾用作飼料藥物添加劑。呋喃西林在動物體內(nèi)代謝速度較快，代謝物氨基脲(SEM)與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合成為結(jié)合態(tài)，能長期保持穩(wěn)定。SEM在弱酸條件下可以從蛋白質(zhì)中釋放出來，因此當(dāng)含有呋喃西林抗生素殘留的水產(chǎn)品被人食用后，SEM就可以在胃酸作用下從蛋白質(zhì)中釋放而被吸收，嚴(yán)重危害人體健康。呋喃西林在臨床上表現(xiàn)為明顯的三致作用(致癌、致畸、致突變)，因此引起各國的高度重視，歐盟在1995年就規(guī)定該類藥物禁止在食物中使用，并于2003年確定水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物及其代謝物的檢測限為I μ g/kg。我國農(nóng)業(yè)部也于2002年公布的《食品動物禁用獸藥及其他化合物清單》中規(guī)定呋喃西林抗生素在所有食品動物中禁止使用。目前呋喃西林及其代謝物的檢測方法主要有理化檢測法和免疫檢測法，如紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等，這些方法各有優(yōu)缺點及其應(yīng)用范圍。HPLC法和LC-MS法是目前國際上最常用來測定呋喃西林代謝物的方法，LC-MS法可以利用待測分子的結(jié)構(gòu)來定性，可以排除ELISA和HPLC法檢測的假陽性結(jié)果，用以確證檢測結(jié)果。但這兩種檢測方法涉及到大量的有機(jī)溶劑處理，過程比較復(fù)雜，周期也比較長，操作時需要專門的技術(shù)人員，難以滿足現(xiàn)代檢測快速、簡捷、現(xiàn)場化的要求。ELISA測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng),該法精確、靈敏，檢測時間大大縮短，但是ELISA法中酶的活性易受反應(yīng)條件影響，由此易造成測定結(jié)果重復(fù)性較差。此外ELISA試劑壽命短，因此需要低溫保藏。基于抗原抗體特異性反應(yīng)建立起來的免疫學(xué)測定方法靈敏度較高，特異性強(qiáng)，試樣預(yù)處理簡單，分析時間短，使用方便。因此，在現(xiàn)場監(jiān)控和基層的大規(guī)模篩選檢測中，免疫學(xué)檢測方法更實際。膠體金免疫層析法是在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡易快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)，除了具備酶聯(lián)免疫法的諸多優(yōu)點外，還克服了酶聯(lián)免疫法的一些不足。該方法將反應(yīng)所需要的原料的全部或大部分均已整合到試劑中，反應(yīng)通常只需數(shù)分鐘，測試結(jié)果以肉眼可見的顯色條帶來判斷。具有簡便快速、操作簡單、特異性強(qiáng)、不需要額外設(shè)備等優(yōu)點
實用新型內(nèi)容
[0010]本實用新型針對檢測需求，研制開發(fā)一種檢測限符合要求，重現(xiàn)性好，檢測時間短，適合現(xiàn)場快速檢測，技術(shù)產(chǎn)品或儀器設(shè)備成本較低，運行費用低的快速檢測試劑。[0011]本實用新型試劑板應(yīng)用層析式抗體免疫競爭原理，通過抗原和金標(biāo)抗體反應(yīng)顯色，特異性檢測水產(chǎn)樣品中的呋喃西林代謝物殘留水平。檢測樣品包括魚、蝦等水產(chǎn)品。如果樣品溶液中含有呋喃西林代謝物殘留，呋喃西林代謝物先和膠體金顆粒上的抗體反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨樣品溶液擴(kuò)散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的呋喃西林代謝物藥物占據(jù)而無法與檢測線上呋喃西林代謝物特異性抗原結(jié)合；當(dāng)樣品中的呋喃西林代謝物含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色，判定為陽性。反之，當(dāng)樣品中呋喃西林代謝物含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色與控制線相近或偏深，判定為陰性。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。相鄰各部分間有1-2_的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行。膠體金結(jié)合墊上包被有抗呋喃西林代謝物單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有呋喃西林代謝物-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和控制線。偶聯(lián)呋喃西林代謝物的載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血監(jiān)蛋白等。本實用新型試劑板的各部分組成成分和功能如下塑料模板，起固定背襯和標(biāo)示各功能區(qū)(加樣孔、檢測區(qū)、控制區(qū))的作用。背襯，由一面涂有不干膠的不吸水韌性材料制成，起固定支撐試劑板其他組成部分的作用。樣品墊，由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液和緩沖樣品溶液pH值的作用。膠體金結(jié)合墊，由聚酯膜制成，其上有抗呋喃西林代謝物單克隆抗體與膠體金顆粒的結(jié)合物，為樣品溶液中有效成分和金標(biāo)抗體反應(yīng)提供場所。硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。吸水墊，由濾紙制成，將反應(yīng)過程中多余的溶液吸收。本實用新型試劑板具有如下有益效果(I)特異性好。本實用新型試劑板對呋喃西林代謝物的交叉反應(yīng)率為100%，對如呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物等抗生素的交叉反應(yīng)率均低于I %?？梢?，本實用新型試劑板對呋喃西林代謝物反應(yīng)具有高度專一性。(2)靈敏度高。本實用新型試劑板對水產(chǎn)品中呋喃西林代謝物的檢出限為
O.5ppb，在水產(chǎn)品中對呋喃西林代謝物的檢測達(dá)到了較優(yōu)水平，適用于各類企業(yè)及檢測機(jī)構(gòu)。(3)操作簡單快捷。本實用新型試劑板將反應(yīng)所需的大部分原料整合到PVC背襯中，滴樣后，抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，大大縮短檢樣時間，且樣品無需特殊處理，滴樣后5-10分鐘即可用肉眼通過判斷硝酸纖維素膜上的檢測線和控制線的顏色深淺讀取結(jié)果。檢測實施過程不依賴任何實驗設(shè)備，普通人員均可操作，不需專業(yè)培訓(xùn)。(4)成本低，易推廣。本實用新型試劑板生產(chǎn)工藝簡單，流程成熟。生產(chǎn)成本低廉，投資少，收效快。

圖I為呋喃西林代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板背襯結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為樣品墊，2為膠體金結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為控制線，6為吸水墊，7為不干膠，8為PVC底板。圖2為呋喃西林代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控制區(qū)，T為檢測區(qū)。圖3. a、圖3. b、圖3. c為呋喃西林代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板結(jié)果判定示意圖，其中C為控制區(qū)，T為檢測區(qū)。
具體實施方式
本實用新型試劑板的制備包括載體蛋白偶聯(lián)物的制備，抗呋喃西林代謝物單克隆抗體的制備，膠體金溶液的制備，膠體金標(biāo)記抗呋喃西林代謝物單克隆抗體的制備和呋喃西林代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝。I.半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)呋喃西林代謝物對醛基苯甲酸衍生物合成稱取3g對醛基苯甲酸于IOmL蒸餾水中，滴加二甲基甲酰胺(DMF)至對醛基苯甲酸完全溶解，攪拌中加入I. Og呋喃西林代謝物，室溫反應(yīng)2h，過濾水洗得白色固體即為呋喃西林代謝物對醛基苯甲酸衍生物。呋喃西林代謝物對醛基苯甲酸衍生物-牛血清蛋白(BSA)的合成稱取23. 4mg呋喃西林代謝物對醛基苯甲酸衍生物溶于2mLDMF，攪拌加入27. 5mg的DCC，14. 4mg的NHS, 4 °C反應(yīng)過夜,5000r/min離心IOmin,取上清液標(biāo)記為A液。取170mg的BSA溶于IOmLO. lmol/L的PBS (pH 8. O)緩沖溶液，加入ImL的DMF溶解，標(biāo)記為B液。將A液逐滴加入到B液中，同時攪拌。4°C下密封反應(yīng)4h。5000r/min下離心IOmin,取上清液，4°C下PBS (pH 7. 4)透析3d，每天換液2次。反應(yīng)產(chǎn)物_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ寐亚宓鞍?OVA)替代BSA，采用同樣方法制備呋喃西林代謝物對醛基苯甲酸衍生物-卵清蛋白偶聯(lián)物。2.抗呋喃西林代謝物單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的BSA偶聯(lián)物與等體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強(qiáng)免疫I次，用不完全佐劑腹腔注射。融合前3d強(qiáng)化免疫I次，不用佐劑，劑量加倍。細(xì)胞融合按常規(guī)方法進(jìn)行將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按I : 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，371^,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初篩選擇10mg/L BSA包被酶聯(lián)板，被測孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRPd 1000)，oro顯色。篩選出的陽性孔再用卵清蛋白偶聯(lián)物包被的酶聯(lián)板進(jìn)行阻斷間接ELISA。將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2X 10_3mol/L呋喃西林代謝物溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶標(biāo)板中。另外用PBS (O. 01mol/L、pH7. 4)替代呋喃西林代謝物溶液作對照，其余步驟同上。若呋喃西林代謝物阻斷后的OD值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經(jīng)2 3次檢測都呈陽性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。、[0038]體外培養(yǎng)將克隆化的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)5 X 105/mL時停止換液，細(xì)胞全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內(nèi)誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細(xì)胞株IO7個細(xì)胞，7天后抽取腹水3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在IOOmL去離子水中加入ImL 1%檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImL 1%氯金酸，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，4°C下保存?zhèn)溆谩?.膠體金標(biāo)記抗呋喃西林代謝物單克隆抗體的制備取已制備好的IOOmL膠體金溶液，用O. lmol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8.0。邊攪拌邊加入I. 5mg抗呋喃西林代謝物單抗,攪拌20min,再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20，OOOrpm 離心 15min,棄上清液，加入 IOmL pH7. 4PBS 緩沖液(含O. 4mol/LPEG)清洗2次。將沉淀用5mL含2% BSA的PBS緩沖液(pH7. 4)溶解，用
O.22 μ m無菌過濾器過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?.呋喃西林代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝參照圖1，用點膜機(jī)把適當(dāng)濃度的載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和控制線，37°C烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標(biāo)記呋喃西林代謝物單克隆抗體包被在膠體金結(jié)合墊上。檢測試劑組成為PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用切割機(jī)將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測試劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。6.呋喃西林代謝物免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施操作方法6. I樣品制備取一定量的去脂肪組織樣本，用剪刀剪碎，稱取2g剪碎樣本于50mL離心管中，并加入4mL去離子水,O. 5mL lmol/L的鹽酸,O. ImL樣本衍生化試劑,充分混合3min ;60°C水浴條件下孵育lh，取出后加入5mL O. lmol/L的磷酸氫二鉀，O. 4mL lmol/L的氫氧化鈉，6mL提取劑，充分混合lmin,4000r/min,離心5mm,移取上層溶液3mL于5mL離心管中，60°C下空氣吹干，向吹干的試管中加入ImL凈化劑，加蓋振蕩lmin，然后加入0. 3mL復(fù)溶液，充分混勻，4000r/min,離心Imin (或靜置至明顯分層)，吸取0. I μ L下層溶液,待檢。6. 2檢測步驟從包裝袋中取出試劑板，吸取待檢樣品溶液100 μ L滴加到加樣孔中，加樣后開始計時；結(jié)果應(yīng)在3 5min讀取，其他時間判讀無效。觀察時，試劑板水平放置于觀察者正面。6. 3結(jié)果判讀讀取結(jié)果時，將試劑板水平置于觀察者正面，如圖2右側(cè)所示。陰性(一)T線顯色比C線深或一樣深，表示樣品中呋喃西林代謝物殘留含量低于0. 5ppb或不含呋喃西林代謝物殘留。如圖3. a所示。陽性⑴T線顯色比C線淺，或T線無顯色，表示樣品中呋喃西林代謝物殘留含量高于0. 5ppb ^線顯色比C線越淺，表示樣品中呋喃西林代謝物殘留含量越高。如圖3. b所
/Jn ο無效未出現(xiàn)C線，可能是操作不當(dāng)或試劑板已失效。應(yīng)再次閱讀說明書，并用新的試劑板重新測試。 如圖3. c所示。
權(quán)利要求1.一種檢測水產(chǎn)品中呋喃西林代謝物的試劑板，其特征在于試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，試劑板背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有1-2_的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求I所說的試劑板，其特征在于試劑板的硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。
3.如權(quán)利要求I所說的試劑板，其特征在于膠體金顆粒的平均大小為30nm。
4.如權(quán)利要求I所說的試劑板，其特征在于，樣品墊由玻璃纖維制成，膠體金結(jié)合墊由聚酯膜制成，吸水墊為濾紙。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測水產(chǎn)品中呋喃西林代謝物的試劑板，可用于檢測水產(chǎn)品中的呋喃西林代謝物。本發(fā)明試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，可將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。該試劑板可進(jìn)行半定量直觀檢測，整個操作過程僅需2小時左右，且無需任何昂貴實驗設(shè)備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合檢驗檢疫機(jī)構(gòu)、海洋與漁業(yè)局、水產(chǎn)質(zhì)量檢測部門等對水產(chǎn)品中非法使用呋喃西林藥物進(jìn)行大規(guī)模快速檢測。
文檔編號G01N33/558GK202362303SQ201120411008
公開日2012年8月1日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者葉紅梅, 張少恩, 張素青, 桑麗雅 申請人:農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(天津), 杭州南開日新生物技術(shù)有限公司