專利名稱：過(guò)濾染色計(jì)數(shù)細(xì)胞的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)量裝置，具體地說(shuō)，是關(guān)于細(xì)胞計(jì)數(shù)的裝置。
背景技術(shù)：
細(xì)胞計(jì)數(shù)是在生命科學(xué)研究，尤其是在細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)中經(jīng)常使用的技術(shù)。現(xiàn)有細(xì)胞計(jì)數(shù)方法各有局限經(jīng)典的血球計(jì)數(shù)板法及其系列衍生方法(如申請(qǐng)?zhí)枮?01213605.0的中國(guó)專利所述細(xì)胞計(jì)數(shù)方法)雖然測(cè)量直觀，但由于細(xì)胞分散不利或檢測(cè)人員的熟練程度等原因會(huì)產(chǎn)生計(jì)數(shù)誤差，且單個(gè)樣本計(jì)數(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法同時(shí)對(duì)大量樣本進(jìn)行操作，降低了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平行性；染色法雖然可以滿足批量操作的要求，但是往往僅適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞(如日本專利W02006003696)，對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞還需若干操作才能完成，從而影響了計(jì)數(shù)的批處理程度，降低了計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度不高、不易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)單，主觀度數(shù)因素少，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化批處理的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括洗滌液容器、染色液容器、脫色液容器、廢液容器、 過(guò)濾裝置、泵系統(tǒng)、比色裝置、三通閥和計(jì)算機(jī)。實(shí)驗(yàn)組及標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液通過(guò)三通閥分別與洗滌液容器、染色液容器相連通，之后通過(guò)三通閥與脫色液容器相連通至過(guò)濾裝置，過(guò)濾裝置的輸出口通過(guò)泵系統(tǒng)與比色裝置相連，比色裝置將測(cè)量數(shù)據(jù)反饋于計(jì)算機(jī)。待檢測(cè)完成后，由和比色裝置相連的導(dǎo)管將廢液排除到廢液容器中。在上述各個(gè)環(huán)節(jié)中，由計(jì)算機(jī)控制各個(gè)三通閥、泵系統(tǒng)以及比色裝置工作。所述的洗滌液采用細(xì)胞懸液2倍以上體積的磷酸鹽緩沖液。所述的染色液采用細(xì)胞懸液1倍以上體積的濃度為0. 的結(jié)晶紫溶液，采用水、生理鹽水或PBS緩沖液作為溶劑配制。所述的脫色液采用細(xì)胞懸液1倍以上體積的濃度為3% 30%的醋酸溶液。本發(fā)明工作時(shí)包括以下步驟1.準(zhǔn)備好需要計(jì)數(shù)的未知數(shù)量的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和至少4組已知數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液，所述細(xì)胞懸液可由懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞直接使用，或貼壁細(xì)胞經(jīng)過(guò)消化步驟形成，各組細(xì)胞懸液的體積相同；2.每個(gè)細(xì)胞懸液樣品對(duì)應(yīng)一個(gè)過(guò)濾裝置，分別將各組細(xì)胞懸液通過(guò)過(guò)濾裝置，使細(xì)胞截留在濾膜之上；3.分別使用細(xì)胞懸液2倍以上體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗截留在過(guò)濾裝置上的細(xì)胞；4.分別加入細(xì)胞懸液1倍以上體積的濃度為0. 的結(jié)晶紫溶液于過(guò)濾裝置中浸泡細(xì)胞10分鐘 1小時(shí)；5.分別吸去結(jié)晶紫溶液，用細(xì)胞懸液5倍以上體積PBS清洗過(guò)濾裝置中的細(xì)胞；[0014]6.分別排出過(guò)濾裝置中殘存液體；7.分別用細(xì)胞懸液1倍以上體積的濃度為3% 30%的醋酸溶液沖洗過(guò)濾裝置， 收集濾液；8.分別將所得濾液經(jīng)稀釋3倍體積以上后，使用可見(jiàn)分光光度計(jì)，測(cè)量570nm波長(zhǎng)處光密度；9.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲
線計(jì)算得知；10.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞樣品的光密度計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量，即(I
實(shí)驗(yàn)/a。本發(fā)明的有益效果是由于采用過(guò)濾裝置對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行過(guò)濾，截留細(xì)胞，已過(guò)濾裝置中的濾膜作為固相支持載體，對(duì)其上細(xì)胞進(jìn)行染色、沖洗、脫色等處理，最終利用結(jié)晶紫洗脫液的光密度來(lái)計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明體現(xiàn)了減少主觀度數(shù)因素對(duì)結(jié)果的影響，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化批處理，以提高測(cè)定精度及結(jié)果平行性的有益效果。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。

圖1是本發(fā)明的方法流程圖；圖2是本發(fā)明的裝置示意圖；圖中，1-實(shí)驗(yàn)組及標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液，2-洗滌液容器，3-染色液容器，4-脫色液容器，5-過(guò)濾裝置，6-泵系統(tǒng)，7-比色裝置，8-廢液容器，9-計(jì)算機(jī)，10-三通閥b，11-三通閥
a,12-三通閥C。
具體實(shí)施方式
裝置實(shí)施例本發(fā)明同時(shí)設(shè)計(jì)用于過(guò)濾染色計(jì)數(shù)細(xì)胞方法的裝置。裝置包括洗滌液容器、染色液容器、脫色液容器、廢液容器、過(guò)濾裝置、泵系統(tǒng)、比色裝置、三通閥、計(jì)算機(jī)。具體說(shuō)明如下實(shí)驗(yàn)組及標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液通過(guò)三通閥b分別與用于細(xì)胞洗滌、染色的容器相連通，此過(guò)程通過(guò)三通閥b與三通閥a(連接洗滌液與染色液的容器)的連接實(shí)現(xiàn)；同時(shí)，三通閥b與用于染色后細(xì)胞脫色的容器相連通，此過(guò)程通過(guò)三通閥b與三通閥c (連接脫色液的容器)的連接實(shí)現(xiàn)。此外，三通閥c連接過(guò)濾裝置，過(guò)濾裝置與泵系統(tǒng)相連通；同時(shí)泵系統(tǒng)與比色裝置相連，比色裝置將測(cè)量數(shù)據(jù)反饋于計(jì)算機(jī)。待檢測(cè)完成后，由和比色裝置相連的導(dǎo)管將廢液排除到盛放廢液的容器中。在上述各個(gè)環(huán)節(jié)中，由計(jì)算機(jī)控制三通閥a、三通閥
b、三通閥C、泵系統(tǒng)以及比色系統(tǒng)的啟動(dòng)與否。方法實(shí)施例1 使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行人白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞計(jì)數(shù)1、準(zhǔn)備人白血病細(xì)胞系K562以未知密度(實(shí)驗(yàn)組)及已知密度(標(biāo)準(zhǔn)組)每毫升 8X105、4X105、2X105、1X105、0. 5X105、0. 25X 105 個(gè)細(xì)胞；2、將0.2毫升的各組樣品混勻后分別注入過(guò)濾裝置5，使細(xì)胞截留于過(guò)濾裝置5之
4上； 3、開(kāi)啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2，分別注入1毫升洗滌液容器2中的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗過(guò)濾裝置5上的細(xì)胞；4、開(kāi)啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2加入0.5毫升染色液容器3中的濃度為0. 的結(jié)晶紫溶液于過(guò)濾裝置中浸泡細(xì)胞1小時(shí)；5、使用泵系統(tǒng)6吸去結(jié)晶紫溶液，開(kāi)啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2并用 10毫升洗滌液容器2中的PBS清洗過(guò)濾裝置5中的細(xì)胞；6、通過(guò)泵系統(tǒng)6排出過(guò)濾裝置5中殘存液體；7、開(kāi)啟三通閥cl2，用0. 5毫升脫色液裝置4中的10%的醋酸溶液浸泡過(guò)濾裝置 5上的細(xì)胞，使之脫色，收集脫色液；8、將所得濾液經(jīng)3倍稀釋后，使用比色裝置7如可見(jiàn)分光光度計(jì)，測(cè)量570nm波長(zhǎng)處光密度，并將數(shù)據(jù)傳入計(jì)算機(jī)9 ；9、結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲
線計(jì)算得知；10、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞樣品的光密度計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量，即Ni9s= (I實(shí)
驗(yàn) /aD11、結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量Nia的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得知；12、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞樣品的光密度計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量，即Ni9s= (I實(shí)
驗(yàn) /aD方法實(shí)施例2 使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行人骨樣細(xì)胞系ML0-Y4細(xì)胞計(jì)數(shù)1.準(zhǔn)備人骨樣細(xì)胞系ML0-Y4以未知密度(實(shí)驗(yàn)組)及已知密度(標(biāo)準(zhǔn)組)每毫升 4Χ105、2Χ105、1Χ105、0. 5Χ105、0· 25X IO5 個(gè)細(xì)胞；2.將0. 3毫升的各組樣品混勻后分別注入過(guò)濾裝置5，使細(xì)胞截留于過(guò)濾裝置5 之上；3.開(kāi)啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2，分別注入1. 5毫升洗滌液容器2中的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗過(guò)濾裝置5上的細(xì)胞；4.開(kāi)啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2加入1毫升染色液容器3中的濃度為0. 的結(jié)晶紫溶液于過(guò)濾裝置中浸泡細(xì)胞1小時(shí)；5.使用泵系統(tǒng)6吸去結(jié)晶紫溶液，開(kāi)啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2并用 12毫升洗滌液容器2中的PBS清洗過(guò)濾裝置5中的細(xì)胞；6.通過(guò)泵系統(tǒng)6排出過(guò)濾裝置5中殘存液體；7.開(kāi)啟三通閥cl2，用1毫升脫色液裝置4中的10%的醋酸溶液浸泡過(guò)濾裝置5 上的細(xì)胞，使之脫色，收集脫色液；8.將所得濾液經(jīng)5倍稀釋后，使用比色裝置7如可見(jiàn)分光光度計(jì)，測(cè)量570nm波長(zhǎng)處光密度，并將數(shù)據(jù)傳入計(jì)算機(jī)9 ；9.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度Iia與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得知；10.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞樣品的光密度計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量，即(I
實(shí)驗(yàn)/a。11.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得知；12.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞樣品的光密度計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量，即(I
實(shí)驗(yàn)/a。方法實(shí)施例3 使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行人成骨肉瘤細(xì)胞系MG-63細(xì)胞計(jì)數(shù)1、準(zhǔn)備人成骨肉瘤細(xì)胞系MG-63以未知密度(實(shí)驗(yàn)組)及已知密度(標(biāo)準(zhǔn)組)每毫升 8X105、4X105、2X 105、1X 105、0. 5X IO5 個(gè)細(xì)胞；2、將0.5毫升的各組樣品混勻后分別注入過(guò)濾裝置5，使細(xì)胞截留于過(guò)濾裝置5之上；3、開(kāi)啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2，分別注入2毫升洗滌液容器2中的磷酸鹽緩沖液(PBQ清洗過(guò)濾裝置5上的細(xì)胞；4、開(kāi)啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2加入1. 5毫升染色液容器3中的濃度為0. 的結(jié)晶紫溶液于過(guò)濾裝置中浸泡細(xì)胞1小時(shí)；5、使用泵系統(tǒng)6吸去結(jié)晶紫溶液，開(kāi)啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2并用 15毫升洗滌液容器2中的PBS清洗過(guò)濾裝置5中的細(xì)胞；6、通過(guò)泵系統(tǒng)6排出過(guò)濾裝置5中殘存液體；7、開(kāi)啟三通閥cl2，用1. 5毫升脫色液裝置4中的10%的醋酸溶液浸泡過(guò)濾裝置 5上的細(xì)胞，使之脫色，收集脫色液；8、將所得濾液經(jīng)2倍稀釋后，使用比色裝置7如可見(jiàn)分光光度計(jì)，測(cè)量570nm波長(zhǎng)處光密度，并將數(shù)據(jù)傳入計(jì)算機(jī)9 ；9、結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲
線計(jì)算得知；10、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞樣品的光密度計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量，即Nf5s= (Ii
驗(yàn) /aD11、結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得知；12、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞樣品的光密度計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量，即Nf5s= (Ii
驗(yàn) /aD采用本發(fā)明所述的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，在線性范圍廣(0. 25X IO5 8X IO5)，數(shù)據(jù)結(jié)果平行性好，根據(jù)所得一元方程及測(cè)量樣本的570nm處光密度，可以快速、準(zhǔn)確的計(jì)算出樣本中的細(xì)胞數(shù)目。
權(quán)利要求1.一種過(guò)濾染色計(jì)數(shù)細(xì)胞的裝置，包括洗滌液容器、染色液容器、脫色液容器、廢液容器、過(guò)濾裝置、泵系統(tǒng)、比色裝置、三通閥和計(jì)算機(jī)，其特征在于實(shí)驗(yàn)組及標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液通過(guò)三通閥分別與洗滌液容器、染色液容器相連通，之后通過(guò)三通閥與脫色液容器相連通至過(guò)濾裝置，過(guò)濾裝置的輸出口通過(guò)泵系統(tǒng)與比色裝置相連，比色裝置將測(cè)量數(shù)據(jù)反饋于計(jì)算機(jī)；待檢測(cè)完成后，由和比色裝置相連的導(dǎo)管將廢液排除到廢液容器中；在上述各個(gè)環(huán)節(jié)中，由計(jì)算機(jī)控制各個(gè)三通閥、泵系統(tǒng)以及比色裝置工作。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)濾染色計(jì)數(shù)細(xì)胞的裝置，其特征在于所述的洗滌液采用細(xì)胞懸液2倍以上體積的磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)濾染色計(jì)數(shù)細(xì)胞的裝置，其特征在于所述的染色液采用細(xì)胞懸液1倍以上體積的濃度為0. 的結(jié)晶紫溶液，采用水、生理鹽水或PBS緩沖液作為溶劑配制。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過(guò)濾染色計(jì)數(shù)細(xì)胞的裝置，其特征在于所述的脫色液采用細(xì)胞懸液1倍以上體積的濃度為3% 30%的醋酸溶液。
專利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了一種過(guò)濾染色計(jì)數(shù)細(xì)胞的裝置，實(shí)驗(yàn)組及標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液通過(guò)三通閥分別與洗滌液容器、染色液容器相連通，之后通過(guò)三通閥與脫色液容器相連通至過(guò)濾裝置，過(guò)濾裝置的輸出口通過(guò)泵系統(tǒng)與比色裝置相連，比色裝置將測(cè)量數(shù)據(jù)反饋于計(jì)算機(jī)；待檢測(cè)完成后，由和比色裝置相連的導(dǎo)管將廢液排除到廢液容器中；在上述各個(gè)環(huán)節(jié)中，由計(jì)算機(jī)控制各個(gè)三通閥、泵系統(tǒng)以及比色裝置工作。本實(shí)用新型體現(xiàn)了減少主觀度數(shù)因素對(duì)結(jié)果的影響，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化批處理，以提高測(cè)定精度及結(jié)果平行性的有益效果。
文檔編號(hào)G01N15/14GK202075202SQ201120119330
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者商澎, 李亞楠, 李京寶, 騫愛(ài)榮 申請(qǐng)人:西北工業(yè)大學(xué)