專利名稱：一種人肺腺癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物Flotillin-1的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用作人肺腺癌標(biāo)志物的質(zhì)膜蛋白FlOtillin-I的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
肺癌是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率已居惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅人類健康。作為肺癌的一類，肺腺癌在各類肺癌中約占20…30%。近年來(lái)，人肺腺癌的發(fā)病率呈逐步上升，且病人的死亡率高，預(yù)后差。臨床上，肺腺癌發(fā)病較隱匿，在早期一般沒有明顯的臨床癥狀，大多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)生癌細(xì)胞的侵襲或轉(zhuǎn)移，且無(wú)有效判斷肺腺癌癌變的標(biāo)志物。因此，尋找肺腺癌的有效標(biāo)志物，準(zhǔn)確判斷肺腺癌的臨床分期和預(yù)后成為廣大醫(yī)學(xué)研究者的迫切任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中的Floti 11 in-Ι是脂筏的一種標(biāo)記蛋白。人Floti 11 in_l基因(Genebank 登錄號(hào)ID 10211)位于染色體6p21. 3區(qū)段，全長(zhǎng)151Λ，由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成。 flotillins 蛋白被認(rèn)為是屬于 SPFH(stomatins, prohibitins, flotillins, HflK/C)蛋白家族。人Flotillin-I蛋白由427個(gè)氨基酸組成，(蛋白質(zhì)登錄號(hào)075955，www. expasy. org)它在體內(nèi)廣泛表達(dá)，而且高度保守，這就提示著它可能在不同的組織和細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著不同的作用，但其在肺腺癌中確切的功能不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人肺腺癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物Flotillin-I的應(yīng)用方法；為有效判斷肺腺癌癌變進(jìn)程提供科學(xué)依據(jù)。一種人肺腺癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物Flotillin-I用于制備診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查人肺腺癌的制劑；特別是用于制備診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查人肺腺癌的試劑盒。一種人肺腺癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物Flotillin-I還可以用于制備診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查人肺腺癌癌細(xì)胞擴(kuò)散、肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肺腺癌臨床分期、肺腺癌患者復(fù)發(fā)的制劑；特別是用于制備診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查人肺腺癌癌細(xì)胞擴(kuò)散、肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肺腺癌臨床分期、肺腺癌患者復(fù)發(fā)的試劑盒。本發(fā)明提供了一個(gè)用于區(qū)分人肺腺癌組織以及癌旁正常肺組織、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織的質(zhì)膜蛋白標(biāo)志物Flotillin-Ι，利用該標(biāo)志物制備判斷人肺腺癌、肺腺癌擴(kuò)散，肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、肺腺癌患者復(fù)發(fā)和預(yù)后的制劑。 本發(fā)明為有效判斷人肺腺癌癌變進(jìn)程提供科學(xué)依據(jù)。


圖1是人肺腺癌組織質(zhì)膜純度鑒定圖。其中I-A是質(zhì)膜純化后透射電鏡圖譜，I-B 是Wfestern blotting檢測(cè)質(zhì)膜純化前后Na+/K+ATPase (質(zhì)膜標(biāo)志蛋白)和ftx)hibitin (細(xì)粒體標(biāo)志蛋白)表達(dá)情況，I-C是質(zhì)膜純化前后Na+zTAIPase和ftOhibitin表達(dá)水平直方
3圖。WTL表示總組織裂解液，PM表示純化后的質(zhì)膜。圖2是兩次iTRQA試劑標(biāo)記，LC-MS/MS分析鑒定Flotillin-I的肽序列和定量比例圖。圖2-A是114和116試劑標(biāo)記癌旁正常肺組織質(zhì)膜蛋白，115和117試劑標(biāo)記肺腺癌組織質(zhì)膜蛋白，質(zhì)譜鑒定Flotillin-I的肽序列(VTGEVLDILR，m/z = 680.4019，ζ = 2) 和比例圖。圖2-B是115和117試劑標(biāo)記癌旁正常肺組織質(zhì)膜蛋白，114和116試劑標(biāo)記肺腺癌組織質(zhì)膜蛋白，質(zhì)譜鑒定Flotillin-I的肽序列LAEAEKOOSQLIMQAEAEAASVR，m/z = 845. 1227，ζ = 3)和定量比例圖。這兩個(gè)序列都Flotillin-I蛋白序列中的一段，兩次質(zhì)譜分析時(shí)分別檢測(cè)得到的，通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息學(xué)鑒定均為Flotillin-1。圖3是Wfestern blot檢測(cè)Flotillin-Ι在人肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中表達(dá)。圖34是狗計(jì)吐11 blot檢測(cè)Flotillin-I在肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中表達(dá)，(N 表示人肺腺癌癌旁正常組織，T表示人肺腺癌組織；PNLT表示癌旁正常肺組織，AdC表示人肺腺癌組織；GAPDH蛋白作為組織內(nèi)參；圖3-B是Flotillin-I在人肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中表達(dá)水平直方圖。圖4是免疫組化檢測(cè)Flotillin-I在癌旁正常肺組織，無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)肺腺癌組織和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺肺腺癌組織中表達(dá)。4-A是Flotillin-I在癌旁正常肺組織中免疫組化圖，4-B是Flotillin-I在無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)肺腺癌組織中免疫組化圖，4-C是Flotillin-I在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺肺腺癌組織中免疫組化圖。圖5是Kaplan-Meier曲線分析Flotillin-1的表達(dá)與肺腺癌復(fù)發(fā)及患者生存的關(guān)系圖。5-A是Flotillin-1的表達(dá)與肺腺癌復(fù)發(fā)Kaplan-Meier曲線分析圖，5_B 是Flotillin-1的表達(dá)與肺腺癌患者生存Kaplan-Meier曲線分析圖。Relapse-free Probability表示無(wú)復(fù)發(fā)率，Overall Survival表示) 、體生存率。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，而不會(huì)限制本發(fā)明。實(shí)施例1質(zhì)膜純化人肺(腺癌)組織在組織勻漿器勻碎，紗布過(guò)濾，余下粗的組織加HEPS 液在液氮中研磨，再過(guò)濾，合并濾液3200g離心10分鐘，去沉淀，IOOOOOg離心1小時(shí)，取沉淀為粗質(zhì)膜。粗質(zhì)膜再用HEPS懸浮，再加6. 4% Detran/PEG體系混勻750g離心10分鐘， 取上層，下層繼續(xù)用新的6. 4% Detran/PEG體系混勻750g離心10分鐘。合并兩次上層，在 ImM NaHCO3溶液中100000離心1小時(shí)，收集沉淀，分別用電鏡和Wiesterb blot進(jìn)行質(zhì)膜純度鑒定。圖I-A是質(zhì)膜純化后透射電鏡圖譜顯示本方法提取的質(zhì)膜沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)粒體等其他細(xì)胞器的污染；圖I-B和圖I-C說(shuō)明質(zhì)膜純化后質(zhì)膜標(biāo)志蛋白Na+zTATPase的表達(dá)比全細(xì)胞裂解液富集了 12倍，而細(xì)粒體的標(biāo)志蛋白ftOhibitin的表達(dá)比全細(xì)胞裂解液減少了 10 倍。由此說(shuō)明這種純化人肺(腺癌)組織質(zhì)膜的方法有效，且純化的質(zhì)膜純度較高。實(shí)施例2iTRQA標(biāo)記與質(zhì)譜分析本方法對(duì)兩組樣品進(jìn)行了兩次不同的iTRQA標(biāo)記和質(zhì)譜分析。第一次標(biāo)記，質(zhì)膜蛋白質(zhì)精確定量后，等量蛋白質(zhì)經(jīng)胰酶酶解后分別用114和116試劑標(biāo)記癌旁正常肺組織質(zhì)膜酶解肽段，而115和117試劑標(biāo)記肺腺癌組織質(zhì)膜酶解肽段，在 Qstar XL液質(zhì)聯(lián)用儀上進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜分析。圖2-A和圖2-B是Flotillin-1前后兩次標(biāo)記的質(zhì)譜圖，從圖中可以得到Flotillin-I在肺腺癌組織中表達(dá)升高。同時(shí)兩次質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理分析結(jié)果(見表1)亦發(fā)現(xiàn)Flotillin-I在肺腺癌組織中表達(dá)升高。表1. iTRQA標(biāo)記分析Flotillin-I在肺腺癌和癌旁正常組織中的差異表達(dá)
蛋白質(zhì)腫瘤/正常
登陸號(hào)蟲白質(zhì)名(第一次)
114 115
075955 Flotillin-I 2.2802實(shí)施例3蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證為驗(yàn)證Flotillin-I在人肺腺癌和癌旁正常組織中的差異，我們采用Western blot檢測(cè)了 Flotillin-I在18對(duì)肺腺癌和配對(duì)癌旁正常組織中表達(dá)水平。操作流程如下1)收集18對(duì)人肺腺癌和配對(duì)癌旁正常肺組織樣本。2)蛋白質(zhì)抽提先在液氮中將肺腺癌組織和正常肺肺組織研磨，分別加入難溶組織裂解液(0. 375mol/L Tris-HCl pH 8. 8,1% SDS, 50m mmol/L DTT,25% Glycerol, ImM PMSF, 25 μ g/mL Aprotinin, 25 μ g/mL Leup印tin)，冰上裂解 lh, 12000rpm、4°C離心 30min 后取上清即為組織細(xì)胞總蛋白，Bradford方法測(cè)定蛋白濃度。3) SDS-PAGE電泳50 μ g總蛋白進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離， 蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(PVDF)上。4)印跡膜用5%脫脂牛奶室溫封閉池或4°C封閉過(guò)夜。5)印跡膜與Flotillin-I特異性的抗體l(abcam公司購(gòu)買，ab50671)(濃度 0. 55 μ g/mL)室溫孵育池或4°C孵育過(guò)夜，然后TBS-T緩沖液洗膜3次，每次lOmin。6)將膜與HR標(biāo)記的第二抗體(兔抗IgG)室溫孵育lh，TBS-T緩沖液洗膜3次， 每次IOmin。7)ECL試劑發(fā)光、顯影和定影。以GAPDH為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次圖3是5對(duì)典型的肺腺癌組織和配對(duì)癌旁正常肺組織Flotillin-I的表達(dá)情況。 3圖結(jié)果顯示Flotillin-I在肺腺癌組織中表達(dá)升高。實(shí)施例4免疫組織化學(xué)分析Flotillin-I在肺腺癌組織中表達(dá)的臨床意義我們以Flotillin-I特異性抗體2 (abeam公司購(gòu)買，ab41927)聯(lián)合邁新S-P免疫組化試劑盒(福建邁新公司)組成我們的診斷試劑盒，免疫組織化學(xué)染色按簡(jiǎn)要步驟如下1)石蠟組織芯片切片用100% 二甲苯脫蠟2次，每次20-40min，至完全脫蠟干凈；2)用100%、95%、90%、75%梯度酒精水化后，用PBS液(PH6. 0)沖洗3次，每次 3min ；3)抗原修復(fù)將處理好的切片置于切片架，放入含有IOOOml枸櫞酸鹽緩沖液的燒杯中，電爐直接加熱至沸騰，用小火繼續(xù)煮沸15min ；
腫瘤/正常腫瘤/正常 (第一次)(第二次)
116 117115 114
2.29872.2902
腫瘤/正常
,笛一、於、平均值
(第一次) 117 116
2.2564 2.2814±0.0183
4)將燒杯離開火源，自然冷卻至室溫，雙蒸水沖洗兩次，PBS液沖洗兩次；5)每張切片加一滴過(guò)氧化物酶阻斷溶液(邁新試劑盒試劑A)，室溫下孵育lOmin。 PBS沖洗三次，每次;3min ；6)除去PBS液，加一滴正常非免疫動(dòng)物血清(邁新試劑盒試劑B)，室溫下孵育 IOmin ；7)除去血清，分別加入Flotillin-I特異性抗體2 (abeam公司購(gòu)買，ab41927) (12yg/mL)4°C過(guò)夜。用PBS代替一抗為陰性對(duì)照；8) PBS沖洗三次，每次:3min。除去PBS液，每張切片加一滴生物標(biāo)記的二抗(邁新試劑盒試劑C)，室溫下孵育lOmin。PBS沖洗三次，每次^iin ；9)除去PBS液，每張切片加一滴鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液(邁新試劑盒試劑D)，室溫下孵育lOmin。PBS沖洗三次，每次^iin ；10)除去PBS液，每張切片加二滴新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察3-lOmin ；11)自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗返藍(lán)；12)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。我們對(duì)存檔的石蠟包埋的組織標(biāo)本包括42例癌旁正常肺組織、46例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織以及62例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織用免疫組織化學(xué)染色分析。染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下隨機(jī)選取至少10個(gè)高倍鏡視野(X 200)，至少計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞數(shù)，以積分法計(jì)算結(jié)果。即根據(jù)每張切片的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比率進(jìn)行聯(lián)合計(jì)分。著色強(qiáng)度無(wú)色O分；淺黃色1分；棕黃色2分；棕色3分。著色細(xì)胞比率無(wú)著色分；< 30%為1分；30% 60% 為2分；> 60%為3分。著色強(qiáng)度和著色細(xì)胞比率的兩種評(píng)分相加，O 2分者為低表達(dá)， 3 4分者為中等表達(dá)，5 6分者為高表達(dá)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分采用SPSS13.0軟件進(jìn)行。結(jié)果如下1 免疫組織化學(xué)分析Flotillin-I在癌旁正常肺組織、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織的表達(dá)。圖4-A是Flotillin-I在癌旁正常肺組織表達(dá)的典型圖片，為低表達(dá)(陰性)；4-B是Flotillin-I在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織中表達(dá)的典型圖片，為中度表達(dá)；4-C是Flotillin-I在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織中表達(dá)的典型圖片，為高表達(dá)(強(qiáng)陽(yáng)性)。表1結(jié)果顯示Flotillin-I在癌旁正常肺組織、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織的表達(dá)兩兩之間存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)上差異。 Flotillin-I在癌旁正常肺組織中表達(dá)大部分呈低表達(dá)(陰性率88% )，而Flotillin-I在肺腺癌組織組織中大部分陽(yáng)性表達(dá)(陽(yáng)性率67% )，并且Flotillin-I在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織中比無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織中表達(dá)的明顯要高，存在顯著性差異(P < 0. 05)。表2 =Flotillin-I癌旁正常肺組織，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織中表達(dá)差異例數(shù)得分
低中高P
Flotillin-I
癌旁正常組織 4237320.000*a
無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 462320
肺腺癌組織
有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 62131633
肺腺癌組織a表示癌旁正常組織和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織兩者之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，b表示無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織兩者之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比 較；*p < 0. 05。2 =Flotillin-I在肺腺癌組織中表達(dá)水平與肺腺癌臨床病理因素的關(guān)系利用單因素方差(Kruskal-ffallis test)分析Flotillin-1在肺腺癌組織中 表達(dá)水平與肺腺癌患者的臨床病理因素變量包括年齡(age)、性別(gender)、腫瘤分化 (Differentiation)、腫瘤大小(pT stage)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)(pN stage)以及臨床分期 (Clinical stage)之間的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見表3) =Flotillin-I在肺腺癌組織中表 達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)(P < 0. 05)，F(xiàn)lotillin-I高表達(dá)的肺腺癌病人更容易發(fā) 生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，具有較晚的臨床分期。而Flotillin-I在肺腺癌組織中表達(dá)與年齡、性別、 腫瘤分化以及腫瘤大小均無(wú)顯著相關(guān)性。表3. Flotillin-I在肺腺癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系
Flotillin-I
例數(shù) 低(0-2) 中(3-4)高(5-6)ρ
年齡0.763
<5020758
>5088293128
性別0.637
男60172419
女48191217
分化0.837
好225107
φ23689
差63251820臨床分期I其月42299II 期24418III-IV 期4239*p<0.05
3 =Flotillin-I表達(dá)水平與肺腺癌病人復(fù)發(fā)的關(guān)系
采用Kaplan-Meier法與回歸分析Flotillin-Ι表達(dá)水平與肺腺癌病人復(fù)發(fā)的關(guān)系，Kaplan-Meier曲線分析結(jié)果顯示，隨著肺腺癌組織中Flotillin-I表達(dá)水平增加，其無(wú)復(fù)發(fā)率(Relapse-free probability)明顯降低(見圖5-A)，即復(fù)發(fā)率明顯升高。單變量 Cox回歸分析結(jié)果顯示(見表4左欄)與肺腺癌復(fù)發(fā)有關(guān)的因素有肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期和Flotillin-I的表達(dá)水平(ρ <0.05)；多變量回歸分析結(jié)果顯示(見表5左欄) 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床分期和Flotillin-I的高表達(dá)是肺腺癌復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因子(ρ < 0. 05)。
表4 單變量分析肺腺癌病人復(fù)發(fā)和預(yù)后的相關(guān)因子
權(quán)利要求
1.一種人肺腺癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物FlOtillin-I的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的標(biāo)志物用于制備診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查人肺腺癌的制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的標(biāo)志物用于制備診斷、預(yù)測(cè)、 檢測(cè)或篩查人肺腺癌的試劑盒。
3.一種人肺腺癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物Flotillin-I的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的標(biāo)志物用于制備診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查人肺腺癌癌細(xì)胞擴(kuò)散、肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肺腺癌臨床分期、肺腺癌患者復(fù)發(fā)的制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的標(biāo)志物用于制備診斷、預(yù)測(cè)、 檢測(cè)或篩查人肺腺癌癌細(xì)胞擴(kuò)散、肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肺腺癌臨床分期、肺腺癌患者復(fù)發(fā)的試齊U盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人肺腺癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物Flotillin-1的應(yīng)用方法，用于制備診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查肺腺癌的制劑；還可以用于制備診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查肺腺癌癌細(xì)胞擴(kuò)散、肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肺腺癌臨床分期、肺腺癌患者復(fù)發(fā)的制劑。本發(fā)明為有效判斷肺腺癌癌變進(jìn)程提供科學(xué)依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N33/574GK102539758SQ20111044069
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者張鵬飛, 彭芳, 易紅, 李茂玉, 李萃, 肖志強(qiáng), 陳主初 申請(qǐng)人:中南大學(xué)