專利名稱：一種基于納米金增強的多種肺癌標(biāo)志物的高靈敏檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于納米金增強的多種肺癌標(biāo)志物的高靈敏檢測方法，特別是一種基于微陣列、納米生物復(fù)合探針及納米金增強的高靈敏檢測方法，該方法能同時檢測多種肺癌相關(guān)標(biāo)志物，可用于肺癌的早期檢測、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移監(jiān)測。屬于納米生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
能夠?qū)ι锓肿雍啽?、快捷、高靈敏度地檢測，始終是人們努力的方向，在疾病的早期診斷、快速診斷、衛(wèi)生檢測、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域都具有重要意義。肺癌是全球發(fā)病率最高、 死亡總?cè)藬?shù)最多的惡性腫瘤，肺癌也是預(yù)后最差、容易轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤之一，肺癌起病隱匿，早期無臨床癥狀?，F(xiàn)有影像學(xué)檢測和痰細(xì)胞學(xué)檢查等檢測手段，即使最先進(jìn)的檢測技術(shù)如多層螺旋CT和正電子發(fā)射體層攝影等可以發(fā)現(xiàn)直徑約2-6mm的腫瘤，但檢查過程復(fù)雜， 花費很高，且此時腫瘤已經(jīng)進(jìn)入血管生成期，因此，現(xiàn)有的檢測技術(shù)顯然仍無法用于肺癌早期及轉(zhuǎn)移檢測。隨著分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的深入，出現(xiàn)了許多肺癌標(biāo)志物，主要有癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白、P53蛋白、黏蛋白等?？傮w來說，肺癌標(biāo)志物含量低，單一標(biāo)志物很難同時滿足敏感性和特異性的要求。隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，已可以同時實現(xiàn)多種肺癌標(biāo)志物的高靈敏檢測，這導(dǎo)致早期肺癌及轉(zhuǎn)移肺癌的敏感和特異檢測成為可能。微陣列是利用微電子芯片技術(shù)的集約化和平行處理原理，將大量具有生物學(xué)意義的生物樣品有序地固化在硅襯底或玻璃上，利用微陣列可以快速地獲取或處理大量的生命信息。微陣列的信號標(biāo)記通常采用熒光標(biāo)記檢測法，而熒光試劑價格昂貴、以及生物分子自身熒光干擾、熒光衰減以及讀取所用儀器價格昂貴等缺點，也大大限制了其在醫(yī)學(xué)臨床診斷方面的應(yīng)用。隨著納米科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，納米材料和納米結(jié)構(gòu)取得了引人矚目的成就。納米材料具有傳統(tǒng)材料所不具備的特有的三大效應(yīng)表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)。作為標(biāo)記材料納米材料和納米結(jié)構(gòu)已廣泛應(yīng)用于免疫檢測中。如納米金顆粒對生物分子有很強的吸附功能，可以與蛋白質(zhì)、核酸等非共價結(jié)合，因而在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。納米金顆粒具有高電子密度的特性，在納米金顆粒結(jié)合處，在顯微鏡下可見褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而廣泛應(yīng)用于定性或半定量的快速檢測方法中，但是這類檢測技術(shù)的最大缺點是靈敏度低，檢測蛋白的靈敏度僅為ng/ml，對微量生物分子檢測無能為力(免疫標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)展及納米技術(shù)在其中的應(yīng)用，賈春平等，生命科學(xué)，第20卷，第5期，第749-753 頁)。此外，這類檢測方法大部分適用于試紙條或膜為固相載體的檢測體系中，對于以玻璃等為固相載體的微陣列上的微米甚至納米級的檢測點來說，不經(jīng)過進(jìn)一步的信號放大，一般顯微鏡尤其肉眼根本是檢測不到的，需要進(jìn)一步進(jìn)行納米金信號的放大。本發(fā)明就是在基于以上的需求提出的
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于納米金生物復(fù)合探針、微陣列及納米金增強的高靈敏檢測方法，該方法能同時高靈敏檢測多種肺癌標(biāo)志物。本發(fā)明主要內(nèi)容包括首先將待測蛋白的捕捉抗體點樣到微陣列上，然后在納米金上標(biāo)記待測蛋白的多克隆或單克隆檢測抗體，然后將標(biāo)記好待測蛋白質(zhì)單克隆或多克隆捕捉抗體的蛋白微陣列及納米金生物復(fù)合探針與待測蛋白質(zhì)樣品混合，37°C孵育一段時間，洗去沒有反應(yīng)的納米金探針，加入金增強反應(yīng)液，肉眼或顯微鏡下觀察、或用CCD掃描拍照，根據(jù)灰度值測定相應(yīng)的蛋白濃度。本發(fā)明的方法步驟(1)蛋白抗體微陣列制作用芯片點樣儀將各待檢測蛋白質(zhì)的抗體及質(zhì)控點(二抗)點在醛基修飾的玻璃基片上，具體點樣方法參見專利O00710170613. X)，室溫放置16小時以上，置4°C保存。(2)構(gòu)建納米金生物復(fù)合探針在pH6 9情況下，納米金顆粒水溶液與待測蛋白質(zhì)相對應(yīng)的抗體結(jié)合，根據(jù)膠體金凝集實驗確定各抗體的用量，將各抗體與納米金溶液室溫條件下混勻一段時間，再加入一定濃度(0. -20%)(質(zhì)量/百分?jǐn)?shù)，下同)的聚乙二醇，4°C過夜，離心，洗去未標(biāo)記上的抗體，用納米金重懸液(牛血清白蛋白BSA 0.25-10%、聚乙烯吡咯酮PVP 0. 1_1%、蔗糖 1.5-10%、聚乙二醇PEG0. 01-1%、吐溫Tween20 0.2-1%)重懸標(biāo)記好的納米金生物復(fù)合探針，置4°C保存?zhèn)溆谩?3)免疫反應(yīng)將標(biāo)記好各待測蛋白抗體的芯片及納米金生物復(fù)合探針與待測蛋白質(zhì)樣品混合， 37°C孵育一段時間，然后再洗去沒有反應(yīng)的納米金探針。(4)顯色加入金增強反應(yīng)液(次氯金酸HAuCl · 3H20 0. 1-lOOmM、鹽酸羥胺NH2OH · HCl 0. Ι-lOOmM、明膠Gelatinl-IO % )后，室溫輕搖3-5min,肉眼觀測或用CCD拍照。本發(fā)明提供的檢測方法的優(yōu)點及特點本發(fā)明提供的測試方法最大的特點及優(yōu)點是靈敏度高，檢測方便，耗時短，且能同時檢測多種肺癌標(biāo)志物。(1)背景信號低，檢測靈敏度高本發(fā)明提供的測試方法主要是基于納米金生物復(fù)合探針及納米金增強技術(shù)的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，只有當(dāng)待測蛋白存在時，納米金探針才會結(jié)合在蛋白芯片上，也只在有納米金的地方，才會發(fā)生進(jìn)一步的納米金信號增強，由于納米金增強液的作用，使檢測信號得到級聯(lián)放大；沒有納米金的地方則不會有信號，背景信號很低，提高了信噪比，達(dá)到對微量蛋白質(zhì)的檢測，檢測蛋白質(zhì)的靈敏度達(dá)到pg/mL級。(2)同時可以檢測多種蛋白質(zhì)本發(fā)明利用蛋白芯片可在一次檢測反應(yīng)提供多種信息的優(yōu)點，實現(xiàn)同時檢測多種蛋白標(biāo)記物。(3)操作方便，耗時短本發(fā)明提供的測定方法從檢測標(biāo)本開始，只需要1-1. 5h的時間，就可以得到檢測結(jié)果；另外，本技術(shù)操作步驟少，操作方便、簡單，適于臨床大批量標(biāo)本的快速檢測。


圖1基于納米金增強反應(yīng)的蛋白質(zhì)測定流程示意圖其中A為納米金生物復(fù)合探針構(gòu)建示意圖，B為蛋白微陣列制作流程示意圖，C為免疫反應(yīng)及顯色示意圖。圖2基于納米金增強的CEA(上排)、P53(下排)的檢測結(jié)果，檢測CEA、p53蛋白的靈敏度為180pg/mL。圖3基于銀染的CEA(上排)、P53(下排)的檢測結(jié)果，檢測CEA、p53蛋白的靈敏度為 1. 5ng/mL。圖4肺癌病人正常人血清檢測結(jié)果(a)肺癌標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品CEA、NSE、CK-19及P53蛋白、(b)肺癌病人、(C)正常人血清中檢測結(jié)果。在該肺癌病人血清中，CEA、CK_19、P53均為強陽性，而正常人血清中為陰性。圖5(a)正常人及肺癌轉(zhuǎn)移病人血清檢測結(jié)果肺癌標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品CEA、CK-19及 MUCl蛋白、(b)肺癌轉(zhuǎn)移病人、(c)正常人血清中檢測結(jié)果。在肺癌轉(zhuǎn)移病人血清中，CEA,MUCl均為強陽性，而正常人為陰性。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例1 可用于標(biāo)準(zhǔn)品CEA、P53蛋白的高靈敏檢測方法1蛋白芯片的制作將癌胚抗原(CEA)、P53蛋白的單克隆抗體點樣到醛基修飾的玻璃基片上。室溫過夜，置4°C保存?zhèn)溆谩?納米金生物復(fù)合探針的制備在pH6 9情況下，根據(jù)膠體金凝集實驗確定CEA、P53蛋白的檢測抗體的用量，并將各濃度的抗體與納米金溶液室溫條件下混勻1-5小時，再加入0. 1-20% (質(zhì)量) 的聚乙二醇，4°C過夜，離心，洗去未標(biāo)記上的抗體，用納米金重懸液(牛血清白蛋白BSA 0. 25-10%、聚乙烯吡咯酮PVP 0. 1-1%、蔗糖1.5-10%、聚乙二醇PEG 0.01-1%、吐溫 Tween20 0. 2-1% )重懸標(biāo)記好的納米金生物復(fù)合探針，置4°C保存?zhèn)溆谩?免疫反應(yīng)將標(biāo)記好CEA、P53抗體的蛋白芯片及納米金生物復(fù)合探針與CEA、P53蛋白樣品(樣品濃度均為 100、50、25、12· 5,6. 25,3. 1,1. 5,0. 75,0. 37,0. 18,0. 09、0ng/mL)混合， 37°C孵育30-60分鐘，然后再洗去沒有反應(yīng)的納米金探針。4顯色反應(yīng)加入金增強反應(yīng)液(次氯金酸HAuCl · 3H20 0. 1-lOOmM、鹽酸羥胺NH2OH · HCl 0. Ι-lOOmM、明膠Gelatinl-IO % )后，室溫輕搖3-lOmin，肉眼觀測或用C⑶拍照，有褐色點出現(xiàn)的為陽性結(jié)果。另外作為對比實驗的顯色方法為檸檬酸鹽緩沖液作用下的銀染顯色方法，具體顯色過程參見專利O00710170613. X)。
5結(jié)果分析常規(guī)的銀染方法，檢測CEA、p53蛋白的靈敏度為1. 5ng/mL(圖3)，而采用本發(fā)明中的金增強液顯色方法，檢測CEA、P53蛋白的靈敏度為180pg/mL(圖2)，所以靈敏度得到提尚。實施例2 可用于肺癌早期檢測的測定方法癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen CEA)是一種酸性糖蛋白，血清CEA水平的動態(tài)變化不僅可用于惡性腫瘤的早期診斷，還能反映患者對治療的反應(yīng)和預(yù)后，其測量值進(jìn)行性升高者多預(yù)后不良。細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin) 19在肺癌診斷中有很大價值，是非小細(xì)胞肺癌的重要標(biāo)志物。血清CK19的水平隨腫瘤分期的增加逐漸升高，其還能預(yù)示肺癌預(yù)后，并有助于判定手術(shù)療效。細(xì)胞角蛋白19與CEA聯(lián)合應(yīng)用，診斷非小細(xì)胞肺癌符合率已可達(dá)到78%。神經(jīng)元特異性烯醇酶(Neuron-Specific Enolase NSE)是一種哺乳動物組織中普遍存在的糖酵解酶，是小細(xì)胞肺癌(SCLC)的重要標(biāo)志物，有助于SCLC的診斷及其與非小細(xì)胞肺癌的鑒別診斷。NSE還是肺癌化療效果觀察和隨訪的有效指標(biāo)，對化療產(chǎn)生反應(yīng)后此酶水平會下降，病情完全緩解后其可達(dá)正常水平。因為P53基因是與人類腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的最重要的抑癌基因，約有50%的腫瘤的發(fā)生與其有關(guān)，尤其是對肺癌來說，有高達(dá)70%的肺癌患者有p53基因突變的發(fā)生。P53基因突變往往導(dǎo)致異常p53蛋白的積累， 因此P53蛋白檢測可以預(yù)測p53基因的狀態(tài)及腫瘤發(fā)生及進(jìn)展，是個很好的預(yù)測因子。對以上腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測可以用于肺癌的早期檢測及診斷。1蛋白芯片的制作將癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白(CK-19)、神經(jīng)烯醇化酶(NSE)、P53蛋白的單克隆抗體、質(zhì)控點(抗鼠IgG)點樣到醛基修飾的玻璃基片上。室溫過夜，置4°C保存?zhèn)溆谩?納米金生物復(fù)合探針的制備在pH6 9情況下，根據(jù)膠體金凝集實驗確定CEA、CK-19、NSE、P53各蛋白的檢測抗體的用量，并將各濃度的抗體與納米金溶液室溫條件下混勻1-5小時，再加入0. 1-10% (質(zhì)量)的聚乙二醇，4°C過夜，離心，洗去未標(biāo)記上的抗體，用納米金重懸液(牛血清白蛋白 BSA 0. 25-10%、聚乙烯吡咯酮 PVP0. 1-1%、蔗糖 1. 5-10%、聚乙二醇 PEG 0.01-1%、吐溫Tween200. 2-1% )重懸標(biāo)記好的納米金生物復(fù)合探針，置4°C保存?zhèn)溆谩?免疫反應(yīng)將標(biāo)記好CEA、CK-19、NSE、P53抗體的蛋白芯片及納米金生物復(fù)合探針與CEA、 CK-19、NSE、P53蛋白樣品或病人血樣混合，37°C孵育一段時間，然后再洗去沒有反應(yīng)的納米金探針。4 顯色加入金增強(次氯金酸HAuCl · 3H20 0. 5-lOOmM、鹽酸羥胺 NH2OH · HCll-IOOmM,明膠Gelatinl-10% )反應(yīng)液后，室溫輕搖3-lOmin，肉眼觀測或用C⑶拍照，有褐色點出現(xiàn)的為陽性結(jié)果。5結(jié)果分析在該肺癌病人血清中，CEA、CK_19、P53均為強陽性，而正常人血清中為陰性，表明這個檢測方法可用于肺癌的檢測(圖4)。實施例3 可用于肺癌微轉(zhuǎn)移檢測的測定方法黏蛋白1 (Mucins MUC1)是一種大分子量的糖蛋白，在腫瘤組織中黏蛋白1多出現(xiàn)異常表達(dá)，并與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。MUCl與CEA、CK19聯(lián)合檢測可以用來預(yù)測肺癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后情況。1蛋白芯片的制作將癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白(CK-19)、黏蛋白(MUCl)、質(zhì)控點(抗鼠IgG)點樣到醛基修飾的玻璃基片上。室溫過夜，置4°C保存?zhèn)溆谩?納米金生物復(fù)合探針的制備在pH6 9情況下，根據(jù)膠體金凝集實驗確定CEA、CK_19、MUC1各蛋白的檢測抗體的用量，并將各濃度的抗體與納米金溶液室溫條件下混勻1-5小時，再加入0. 1-10% (質(zhì)量)的聚乙二醇，4°C過夜，離心，洗去未標(biāo)記上的抗體，用納米金重懸液(牛血清白蛋白 BSA 0. 25-10%、聚乙烯吡咯酮 PVP0. 1_1%、蔗糖 1. 5-10 %、聚乙二醇 PEG 0. 01-1 %、吐溫 Tween20 0. 2-1% )重懸標(biāo)記好的納米金生物復(fù)合探針，置4°C保存?zhèn)溆谩?免疫反應(yīng)將標(biāo)記好CEA、CK_19、MUC1抗體的蛋白芯片及納米金生物復(fù)合探針與CEA、CK_19、 MUCl蛋白樣品或病人血樣混合，37°C孵育一段時間，然后再洗去沒有反應(yīng)的納米金探針。4 顯色加入金增強反應(yīng)液(次氯金酸HAuCl · 3H20 0. 5_100mM、鹽酸羥胺NH2OH · HCl Ι-lOOmM、明膠Gelatinl-IO % )后，室溫輕搖3-lOmin，肉眼觀測或用C⑶拍照，有褐色點出現(xiàn)的為陽性結(jié)果。5結(jié)果分析在肺癌轉(zhuǎn)移病人血清中，CEA、MUC1均為強陽性，而正常人為陰性，表明這個檢測方法可用于肺癌的轉(zhuǎn)移檢測(圖5)。
權(quán)利要求
1.一種多種肺癌標(biāo)志物的高靈敏度檢測方法，其特征在于基于納米金生物復(fù)合探針微陣列和納米金增強，進(jìn)行檢測的步驟是首先將待測蛋白的捕捉抗體點樣到微陣列上，然后在納米金上標(biāo)記上待測蛋白的多克隆或單克隆檢測抗體，然后將標(biāo)記好待測蛋白質(zhì)單克隆或多克隆捕捉抗體的蛋白微陣列及納米金生物復(fù)合探針與待測蛋白質(zhì)樣品混合，37°c孵育一段時間，洗去沒有反應(yīng)的納米金探針，加入金增強反應(yīng)液，肉眼或顯微鏡下觀察、或用CCD 掃描拍照，根據(jù)灰度值測定相應(yīng)的蛋白濃度。
2.按權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于具體步驟為(a)蛋白抗體微陣列制作用芯片點樣儀將各檢測蛋白的抗體及質(zhì)控點點在醛基修飾的玻璃基片上，室溫放置16 小時以上，置4°C保存；(b)構(gòu)建納米金生物復(fù)合探針在pH 6 9情況下，納米金顆粒水溶液可與待測蛋白質(zhì)相對應(yīng)的抗體結(jié)合，根據(jù)膠體金凝集實驗確定各抗體的用量，將各抗體與納米金溶液室溫條件下混勻一段時間，再加入質(zhì)量百分濃度為0. 1% -20%的聚乙二醇，4°C過夜，離心，洗去未標(biāo)記上的抗體，用納米金重懸液重懸標(biāo)記好的納米金生物復(fù)合探針，置4°C保存?zhèn)溆茫?c)免疫反應(yīng)將標(biāo)記好各待測蛋白抗體的芯片及納米金生物復(fù)合探針與待測蛋白質(zhì)樣品混合，37°C 孵育一段時間，然后再洗去沒有反應(yīng)的納米金探針；顯色(d)加入金增強反應(yīng)液后，室溫輕搖3-5min，肉眼觀測或用CXD拍照。
3.按權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于步驟(c)中所述重懸液組成為牛血清白蛋白 BSA 0. 25-10%、聚乙烯吡咯酮PVP 0. 1-1 %、蔗糖 1. 5-10%、聚乙二醇PEG 0.01-1%, 吐溫 Tween20 0. 2_1%。
4.按權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于步驟(d)中金增強反應(yīng)液組成為次氯金酸 HAuCl · 3H20 0. 1-lOOmM、鹽酸羥胺 NH2OH · HC10. 1-lOOmM、明膠 Gelatinl-10 %，以上均為質(zhì)量百分濃度。
5.按權(quán)利要求1-4中任一項所述的檢測方法，其特征在于所述的方法適用于肺癌早期檢測和肺癌微轉(zhuǎn)移檢測。
6.按權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于檢測蛋白質(zhì)的靈敏度達(dá)pg/ml級。
全文摘要
本發(fā)明是一種基于納米金增強的多種肺癌標(biāo)志物。高靈敏度檢測方法，檢測步驟為1)先將各待測蛋白質(zhì)的捕捉抗體點樣到醛基修飾的基片上；2)然后在納米金上標(biāo)記上待測蛋白的多克隆或單克隆檢測抗體；3)將標(biāo)記好待測蛋白質(zhì)捕捉抗體的蛋白芯片及納米金生物復(fù)合探針與待測蛋白質(zhì)樣品混合，37℃孵育一段時間，洗去沒有反應(yīng)的納米金探針；4)加入金增強反應(yīng)液，肉眼或顯微鏡下觀察、或用CCD掃描拍照，根據(jù)灰度值測定相應(yīng)的蛋白濃度。本發(fā)明提供的方法可廣泛應(yīng)用于臨床診斷、腫瘤轉(zhuǎn)移監(jiān)測、抗原、抗體、核酸的檢測、衛(wèi)生檢疫、環(huán)境檢測等領(lǐng)域，檢測蛋白質(zhì)的靈敏度達(dá)pg/ml級。
文檔編號G01N33/574GK102313814SQ201110211260
公開日2012年1月11日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者景奉香, 賈春平, 趙建龍, 趙輝, 金慶輝 申請人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所