專利名稱：一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種電極材料，尤其是涉及一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)PH的微電極及其制備方法。
背景技術(shù)：
pH值是細(xì)胞最基礎(chǔ)、最重要的生理參數(shù)之一。細(xì)胞周圍環(huán)境PH值的變化，對(duì)細(xì)胞狀態(tài)影響十分重要。通過檢測(cè)細(xì)胞及其周圍環(huán)境的PH值，可了解pH與細(xì)胞的不同生理狀態(tài)之間的關(guān)系。目前使用最廣泛的PH檢測(cè)電極為玻璃pH電極，它一般采用玻璃膜作為氫離子的敏感膜，極為脆弱。此外玻璃PH電極的尺寸較大，難以微型化，使用壽命較短的特點(diǎn)也限制它在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。金屬/金屬氧化物電極機(jī)械強(qiáng)度高，可塑性強(qiáng)，可用于極端環(huán)境下測(cè)試，并且易于微型化的特點(diǎn)，越來越受到人們關(guān)注而成為研究的熱點(diǎn)。許多金屬都可以作為基材用以制備金屬/金屬氧化物電極，其中W/W0x電極具有良好的pH響應(yīng)、良好的生物相容性，同時(shí)相對(duì)于其他貴金屬氧化物PH電極，ff/W0x電極價(jià)格低廉，易于制備。因此W/W03電極是一種比較理想的用于生物體系pH值測(cè)量的材料。制備測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極的關(guān)鍵是電極的微型化和氫離子敏感氧化物膜的形成。對(duì)于金屬電極，微型化的主要方法主要是化學(xué)刻蝕法。它的設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單，易于控制，是獲得小尺寸電極尖端的成熟技術(shù)。而在表面形成對(duì)氫離子敏感的氧化物膜，目前常用的方法包括灼燒法(參見文獻(xiàn)1.苗方文，郭義，張艷軍等，復(fù)合針型鎢/氧化鎢微PH 傳感器的研制，傳感器技術(shù)，1995，4 33-36 ；)、濺射法(參見文獻(xiàn)2. K. Aguir, C. Lemire, D.B. B. Lollman. Electrical Properties of Reactively Sputtered W03 Thin Films as Ozone Gas Sensor. Sensors and Actuators，2002，B84 :1-5 ；)、溶膠-凝膠法(參見文獻(xiàn)3.陳東初，賴閱騰，李文芳，氧化鎢pH電化學(xué)傳感器的H+響應(yīng)行為研究，微納電子技術(shù)，2007 (Zl) :397-399 ；)、電化學(xué)循環(huán)伏安法(參見文獻(xiàn)4. Katsunobu Yamamoto, Guoyue Shi, Tianshu Zhou et al, Solid-state pH ultramicrosensor based on a tungstic oxide film fabricated on a tungsten nanoelectrode and its application to the study of endothelial cells, Analytica Chimica Acta 2003,480 :109-117)。
學(xué)循環(huán)伏安法制備氫離子敏感氧化物膜未見報(bào)道，與其它對(duì)氫離子敏感的氧化物膜的制備方法相比，電化學(xué)循環(huán)伏安法具有以下優(yōu)點(diǎn)1)設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，條件參數(shù)精確可控；2)可以在形貌復(fù)雜的表面制備對(duì)氫離子敏感的氧化物膜；

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)參數(shù)精確可控，可以在任何形狀的表面制備對(duì)氫離子敏感的活性氧化鎢膜，獲得的PH電極體積小，響應(yīng)速度較快，檢測(cè)靈敏度較高，特別適用于對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行PH檢測(cè)的測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極及其制備方法。
所述測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極設(shè)有金屬基底，所述金屬基底表面覆蓋有一層對(duì)氫離子敏感的活性氧化鎢膜，所述活性氧化鎢膜是前驅(qū)體經(jīng)過電化學(xué)循環(huán)伏安法形成的 WOx (X = 1 3)活性氧化鎢膜。所述測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極的制備方法包括以下步驟1)將鎢絲清洗，以除去表面的有機(jī)雜質(zhì)，晾干后在NaOH中以石墨為對(duì)電極進(jìn)行刻蝕，獲得尖端尺寸在1 μ m以下的鎢絲；2)使用熱熔膠包封鎢絲，得pH電極，電極的尖端部分裸露；3)在H2SO4中，以包封后的pH電極為工作電極，鉬絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，進(jìn)行循環(huán)伏安活化表面氧化物^^層，其中X = 1 3，獲得對(duì)氫離子敏感的氧化物膜；4)將活化之后的鎢絲pH電極尖端部分懸空浸泡在中，以穩(wěn)定表面活性氧化物膜對(duì)氫離子的吸脫附速率，得測(cè)量細(xì)胞內(nèi)PH的微電極。在步驟1)中，所述鎢絲的直徑可為0. 1 0. 3mm，所述清洗可將鎢絲分別在丙酮、 無水乙醇、去離子水中超聲清洗5 30min ；所述NaOH可采用1 IOM NaOH ；所述刻蝕的條件可控制交流電位5 50V，刻蝕20 120s。在步驟3)中，所述H2SO4可采用1 5M H2SO4 ；所述進(jìn)行循環(huán)伏安活化表面氧化物 WOx層的條件可為相對(duì)開路電位的掃描電位范圍為1. 0 2. 0V，掃描圈數(shù)為20 30，掃描速度為20 50mV/s。在步驟4)中，所述H2SO4可采用2M H2SO4 ；所述浸泡的時(shí)間可為12 72h。本發(fā)明利用刻蝕法獲得尖端尺寸小于1 μ m，錐度小于1/10的鎢絲，制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉；利用電化學(xué)循環(huán)伏安法制備對(duì)氫離子敏感的活性氧化鎢膜，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)參數(shù)精確可控，可以在任何形狀的表面制備對(duì)氫離子敏感的活性氧化鎢膜。獲得的PH電極體積小，響應(yīng)速度快，檢測(cè)靈敏度高，特別適用于對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行PH檢測(cè)。


圖1為經(jīng)過刻蝕、包封之后的鎢絲的SEM照片。在圖1中，標(biāo)尺為lOOnm。圖2為表面氧化物WOx(X= 1 3)膜層在2M H2SO4中的電化學(xué)循環(huán)伏安圖。在圖 2中，橫坐標(biāo)為電位/V，縱坐標(biāo)為電流/pA ；循環(huán)數(shù)曲線a為2，曲線b為8，曲線c為20。圖3為W/W0X pH微電極在磷酸緩沖溶液中的工作曲線。在圖3中，橫坐標(biāo)為pH， 縱坐標(biāo)為電位E/mV ；線性響應(yīng)方程為E = -25. 95-60. 94XpH(R = -0. 995)。圖4為pH微電極測(cè)量單個(gè)Hela細(xì)胞pH的光學(xué)顯微鏡照片。在圖4中，標(biāo)尺為 100 μ m0圖5為pH微電極測(cè)量單個(gè)Hela細(xì)胞的pH_時(shí)間關(guān)系曲線，參比電極微Ag/AgCl。 在圖5中，橫坐標(biāo)為時(shí)間time/s，縱坐標(biāo)為pH。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明使用的金屬基材為化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的鎢絲。鎢絲韌性好，硬度高，價(jià)格低廉， 易于取材和加工，在保證足夠機(jī)械強(qiáng)度的前提下，選取直徑小的鎢絲，在加工時(shí)可以盡量降低能源消耗和節(jié)約操作時(shí)間，選取直徑在0. 1 0. 3mm的鎢絲最為合適。
將長(zhǎng)度合適的鎢絲截取后，分別在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲清洗5 30min,以除去鎢絲表面的有機(jī)雜質(zhì)，晾干后，在5M NaOH，控制交流電位5 50V，刻蝕20 120s獲得尖端尺寸在1 μ m以下的鎢絲。本發(fā)明所測(cè)量的對(duì)象為尺寸在10 100 μ m的細(xì)胞，因此必須對(duì)刻蝕獲得的鎢絲進(jìn)行包封，使其露出的尖端直徑在Iym以下。具體做法是控制U型電烙鐵溫度在120 160°C，將熱熔膠涂附在電烙鐵上，等待3 ^保證熱熔膠充分軟化。保持鎢絲尖端朝上，并且自下而上穿過軟化的熱熔膠，熱熔膠自動(dòng)包封鎢絲，同時(shí)鎢絲尖端露出(參見圖1)。本發(fā)明的測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極的關(guān)鍵在于金屬基體上對(duì)氫離子敏感的活性氧化鎢膜的制備。在1 5M H2SO4中，以包封后的pH電極為工作電極，鉬絲為對(duì)電極，Ag/AgCl 電極為參比電極，進(jìn)行循環(huán)伏安活化表面氧化物W0x(X = 1 ；3)層，獲得對(duì)氫離子敏感的氧化物膜，掃描電位范圍控制在1. 0 2. OV (相對(duì)開路電位)，掃描圈數(shù)為20 30，掃描速度為20 50mV/s。電化學(xué)活化表面氧化鎢膜，是通過電場(chǎng)加速表面氧化鎢膜與氫離子相互作用的過程，表面反應(yīng)如下
WOx+nH++ne - HnWOx隨著反應(yīng)的進(jìn)行，表面氧化鎢膜與溶液界面的氫離子交換速率接近平衡狀態(tài)，循環(huán)伏安的電流值逐漸減小(參見圖2)。將活化之后的pH電極尖端部分，懸空浸泡在2M H2SO4 中12 72h，以穩(wěn)定表面活性氧化物膜對(duì)氫離子的吸脫附速率。將制備的W/W0xpH微電極浸泡在系列磷酸緩沖溶液中，可以獲得其工作曲線如圖3，由圖3可知，pH微電極對(duì)于氫離子有良好的線性響應(yīng)E/mV = -25. 95-60. 94XpH(R =-0. 995)，證明該電極可以用于pH的檢測(cè)。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用進(jìn)一步詳細(xì)說明。1)取直徑為0. 3mm鎢絲分別在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲清洗5min，以除去表面的有機(jī)雜質(zhì)，晾干后在5M NaOH中以石墨為對(duì)電極，控制交流電位45V，刻蝕30s獲得尖端尺寸在Ιμπι以下的鎢絲；2)控制U型電烙鐵溫度在120 160°C，將熱熔膠涂附在電烙鐵上，等待3 k 保證熱熔膠充分軟化。保持鎢絲尖端朝上，并且自下而上穿過軟化的熱熔膠，熱熔膠自動(dòng)包封鎢絲，同時(shí)鎢絲尖端露出；3)在2M H2SO4中，以包封后的pH電極為工作電極，鉬絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，進(jìn)行循環(huán)伏安活化表面氧化物WOx(X = 1 ；3)層，獲得對(duì)氫離子敏感的氧化物膜，掃描電位范圍控制在1. 0-2. 0V(相對(duì)開路電位)，掃描圈數(shù)為20，掃描速度為20mV/s ；4)將活化之后的pH電極尖端部分，懸空浸泡在2M H2SO4中Mh，以穩(wěn)定表面活性氧化物膜對(duì)氫離子的吸脫附速率；5)將正常培養(yǎng)的Hela細(xì)胞的培養(yǎng)液吸走，首先使用0. OlM PBS潤(rùn)洗，再更換為 25 μ MPBS作為測(cè)量體系。使用微操作系統(tǒng)將pH微電極由緩沖液刺入單個(gè)Hela細(xì)胞如圖 4，并且實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)獲得pH-時(shí)間關(guān)系曲線如圖5，由圖可知，當(dāng)微電極刺入細(xì)胞(約IOOs時(shí)刻)后，測(cè)量的PH值由原先的逐漸增大向逐漸減小轉(zhuǎn)變，證明Hela細(xì)胞內(nèi)部有較多的偏酸性(pH < 5. 9)的物質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)PH的微電極，其特征在于設(shè)有金屬基底，所述金屬基底表面覆蓋有一層對(duì)氫離子敏感的活性氧化鎢膜，所述活性氧化鎢膜是前驅(qū)體經(jīng)過電化學(xué)循環(huán)伏安法形成的WOx活性氧化鎢膜，其中X = 1 3。
2.如權(quán)利要求1所述的一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)PH的微電極的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)將鎢絲清洗，以除去表面的有機(jī)雜質(zhì)，晾干后在NaOH中以石墨為對(duì)電極進(jìn)行刻蝕， 獲得尖端尺寸在1 μ m以下的鎢絲；2)使用熱熔膠包封鎢絲，得PH電極，電極的尖端部分裸露；3)在H2SO4中，以包封后的pH電極為工作電極，鉬絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，進(jìn)行循環(huán)伏安活化表面氧化物WOx層，其中X = 1 3，獲得對(duì)氫離子敏感的氧化物膜；4)將活化之后的鎢絲pH電極尖端部分懸空浸泡在中，以穩(wěn)定表面活性氧化物膜對(duì)氫離子的吸脫附速率，得測(cè)量細(xì)胞內(nèi)PH的微電極。
3.如權(quán)利要求2所述的一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極的制備方法，其特征在于在步驟 1)中，所述鎢絲的直徑為0. 1 0. 3mm。
4.如權(quán)利要求2所述的一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極的制備方法，其特征在于在步驟 1)中，所述清洗是將鎢絲分別在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲清洗5 30min。
5.如權(quán)利要求2所述的一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極的制備方法，其特征在于在步驟 1)中，所述NaOH采用1 IOM NaOH0
6.如權(quán)利要求2所述的一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極的制備方法，其特征在于在步驟 1)中，所述刻蝕的條件為控制交流電位5 50V，刻蝕20 120s。
7.如權(quán)利要求2所述的一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極的制備方法，其特征在于在步驟 3)中，所述H2SO4采用1 5M H2SO4。
8.如權(quán)利要求2所述的一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述進(jìn)行循環(huán)伏安活化表面氧化物WOx層的條件為相對(duì)開路電位的掃描電位范圍為 1. 0 2. 0V,掃描圈數(shù)為20 30，掃描速度為20 50mV/s。
9.如權(quán)利要求2所述的一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述H2SO4 采用 2M H2SO4。
10.如權(quán)利要求2所述的一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)PH的微電極的制備方法，其特征在于在步驟 4)中，所述浸泡的時(shí)間為12 72h。
全文摘要
一種測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH的微電極及其制備方法，涉及一種電極材料。微電極設(shè)有金屬基底，金屬基底表面覆蓋有一層對(duì)氫離子敏感的活性氧化鎢膜。將鎢絲清洗，晾干后在NaOH中以石墨為對(duì)電極進(jìn)行刻蝕，得尖端尺寸在1μm以下的鎢絲；使用熱熔膠包封鎢絲，得pH電極，電極的尖端部分裸露；在H2SO4中，以包封后的pH電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，進(jìn)行循環(huán)伏安活化表面氧化物WOX層，X＝1～3，獲得對(duì)氫離子敏感的氧化物膜；鎢絲pH電極尖端懸空浸泡在H2SO4中，即得。工藝簡(jiǎn)單，成本低，操作簡(jiǎn)單，可在任何形狀的表面制備對(duì)氫離子敏感的活性氧化鎢膜，電極體積小，響應(yīng)速度快，靈敏度高。
文檔編號(hào)G01N27/333GK102539501SQ20111036223
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者林昌健, 林龍翔, 胡仁, 黃巧玲 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)