專利名稱：超高效液相色譜測定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于一種超高效液相色譜測定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法。
背景技術：
一般而言，必需氨基酸種類和含量齊全并能提供人體需要的蛋白質可以稱為優(yōu)質蛋白質，也叫完全蛋白質。必需氨基酸是指人體必需但自身不能合成，必須從食物中攝取的氨基酸。在植物蛋白質中只有大豆蛋白屬于完全蛋白質，但是大豆蛋白在吸收上不及優(yōu)質的動物蛋白。乳清蛋白屬于優(yōu)質的完全蛋白質，也是動物性蛋白。它含有人體必需的8種氨基酸，且配比合理，接近人體的需求比例，是人體生長、發(fā)育、抗衰老等生命活動不可缺少的精華物質。在各種蛋白質中，乳清蛋白的營養(yǎng)價值是最高的，它較易被消化吸收，母乳中乳清蛋白含60%，酪蛋白含40%，故喝母乳的嬰兒糞便較軟，量也較少。另外，乳清中富含半胱氨酸和蛋氨酸，它們能維持人體內(nèi)抗氧化劑的水平。還有許多實驗研究都證明，服用乳清蛋白濃縮物能促進體液免疫和細胞免疫，刺激人體免疫系統(tǒng)，阻止化學誘發(fā)性癌癥的發(fā)生。 所以乳清蛋白又是一種非常好的增強免疫力的蛋白。從營養(yǎng)學的角度來看，經(jīng)動物性蛋白質來源的食物中含有對人體有害的過量飽和脂肪、膽固醇等有害物質，過量食用易導致人體脂肪和膽固醇升高，從而導致心血管疾病的發(fā)生。乳清蛋白中脂肪、乳糖含量低，但它含有β _乳球蛋白、α -乳白蛋白、免疫球蛋白，還有其他多種活性成分。正是這些活性成分使乳清蛋白具備了有益于人體的諸多保健功能， 因此它被認為是人體所需的優(yōu)質蛋白質來源之一。乳清蛋白是一類營養(yǎng)價值高、易消化吸收、含有多種活性成分的蛋白質，尤其適合嬰幼兒、老年人、運動人群和術前術后病人。在食品工業(yè)中被越來越廣泛地應用，如兒童營養(yǎng)蛋白粉、嬰兒配方奶粉等。然而，對乳清蛋白的檢測方法還相當局限，一種簡便、快速、有效且檢測成本相對低廉的檢測方法應時代的需求而應運而生。乳清蛋白是牛奶中的主要蛋白質，乳清蛋白主要包括α-牛乳白蛋白 (B α -Lactalbumin, B α -La)、β -牛乳球蛋白(B β -Lactoglbulin，B β _Lg)、蛋白酶-胨和牛血清白蛋白等，前兩者是乳清蛋白的主要成分，分別占其總量的10-20%和40-50%，β -牛乳球蛋白包括B β b-Lg和B β a-Lg兩個遺傳變異體。在《中華人民共和國食品安全國家標準》“嬰幼兒食品和乳品中乳清蛋白的測定 (征求意見稿)”改進“GB/T 5413. 2-1997《嬰幼兒配方食品和乳粉乳清蛋白的測定》”， 論述了 第一法高效液相色譜-質譜聯(lián)用法，采用1.7 ym硅烷基C18柱，質荷比(m/z) 1-3000質荷比(m/z);分辨率為0.1原子質量單位的液相色譜-質譜聯(lián)用儀系統(tǒng)，使α _乳白蛋白、0b-乳球蛋白和i3a-乳球蛋白的檢出限為5 mg/100g，定量測定范圍均為5-50 mg/100g;第二法凝膠滲透色譜法，適用于嬰幼兒食品和乳品中α-乳白蛋白的測定，檢出限為50 mg/100g。由于國標法中所用的3000質核比的質譜儀價格昂貴，和凝膠滲透色譜法檢測的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠快速檢測奶粉和牛奶中的牛乳清蛋白含量的超高效液相色譜方法。本發(fā)明的目 的是實現(xiàn)所述的利用超高效液相色譜，測定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法，具體步驟為
在待測的奶粉或牛奶中加入含Triton X-100的鹽酸提取液、超聲溶解，用乙酸鈉水溶液調(diào)整PH在4. 4-4. 6之間，用水定容、均質，室溫靜置后過濾，上ACQUITY UPLC BEH300 C18 色譜柱，采用ACQUITY UPLC-TUV超高效液相色譜系統(tǒng)測定奶粉或牛奶中B α -La、B β b_Lg 和B β a-Lg三種牛乳清蛋白的含量。含Triton X-100的鹽酸提取液優(yōu)選0. 2% Triton X-100的0. lmol/L鹽酸提取液。所述的色譜柱為ACQUITY UPLC BEH300 C18 2. ImmX 100mm, 1. 7 μ m;液相系統(tǒng)為沃特世ACQUITY UPLC 配ACQUITY TUV紫外檢測器；色譜柱的柱溫35°C，流動相A: 0.1% 三氟乙酸乙腈溶液；流動相B: 0.1%三氟乙酸水溶液；采用梯度洗脫，流速為0.2 mL/min; 檢測波長280 nm ；分析時間15 min ；通過外標法測定B α -La、B β b_Lg和B β a-Lg三種牛乳清蛋白的含量。上述％為重量百分比。所述的色譜柱優(yōu)選采用Waters孔徑為300A的ACQUITY UPLC BEH300 C18色譜柱進行分離。本發(fā)明的檢測方法的主要特點
本發(fā)明參考國標方法，采用更為簡便的前處理方法，及改進的流動相與檢測方式，以 "ACQUITY UPLC BEH300 C18色譜柱，ACQUITY UPLC-TUV超高效液相色譜系統(tǒng)”測定奶粉和牛奶中三種牛乳清蛋白(α-牛乳白蛋白(Ba-Lactalbumin，Βα-La)、β-牛乳球蛋白 (B^-Lactoglbulin,B^-Lg))的含量。在滿足牛乳、奶粉等樣品檢出限為1 mg/kg要求的前提下力求簡單、快速、成本低并能夠高通量處理樣品，通過方法優(yōu)化，使三種牛乳清蛋白的檢出限達到0. 1 mg/100g，定量測定范圍0. 1-10 mg/100g，更有利于低濃度含量的樣品中三種牛乳清蛋白的定量測定，所處理的樣品在辛烷磺酸鈉緩沖鹽甲醇的流動相體系中還可測定維生素B6、煙酸的檢測，有利于生產(chǎn)檢測中的廣泛運用。本發(fā)明優(yōu)點為本發(fā)明建立了用ACQUITY UPLC-TUV系統(tǒng)檢測奶粉和牛奶實際樣品中B α -La、B β b_Lg和B β a-Lg三種牛乳清蛋白的定量分析方法，減少了實驗初期在實驗試劑、儀器設備等方面的資金投入的同時，運用相對簡單高效的純化步驟進行操作，實現(xiàn) B α -La、B β b_Lg和B β a-Lg,的分離，保證了定量精度，并有效去除酪蛋白質和脂類等雜質干擾，提高了最終檢測的靈敏度。方法的檢出限為ι μ g/g，相較同類高效液相色譜一質譜聯(lián)用法，在檢出限上有所提高，更有效地確保實驗數(shù)據(jù)的準確度，有利于乳清蛋白含量相對較低的樣品檢測。鹽酸與氫氧化鈉混合生成氯化鈉，有利于乳清蛋白的提取，免去同類型的檢測方法中，氯化鈉藥品的添加。


圖1為本發(fā)明的α-La牛乳白蛋白紫外光譜圖。圖2為本發(fā)明的β b-Lg牛乳白蛋白紫外光譜圖。圖3為本發(fā)明的β a-Lg牛乳白蛋白紫外光譜圖。
圖4為三種乳清蛋 白280nm波長檢測色譜圖。圖5為選擇1-4四種流動相梯度方法下得到的四張色譜圖。圖6為本發(fā)明的前處理方法的pH選擇實驗圖。圖7為本發(fā)明的α -La標準曲線圖。圖8為本發(fā)明的β b-Lg標準曲線圖。
圖9為本發(fā)明的β a-Lg標準曲線圖。圖10為1. 000 mg/L三種乳清蛋白標準色譜圖。圖11為奶粉樣品A色譜圖。圖12為奶粉樣品B色譜圖。圖13為液態(tài)牛奶樣品色譜圖。圖14為標準品、實際樣品和樣品提取液空白重疊色譜圖。圖15為牛奶樣品和牛奶樣品最后添加標準品的色譜圖。圖16為兩種定溶液標準品的重疊色譜圖。圖17為B6、煙酸樣品加標的重疊色譜圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細說明實驗方法
材料、試劑和儀器
乙腈(色譜純)，三氟乙酸(優(yōu)級純)，Triton X-100，氯化鈉(優(yōu)級純)，鹽酸(優(yōu)級純)，氫氧化鈉(分析純)，實驗用水為超純水(18 ΜΩ·αιι, TOC 3 ppb)，牛乳清蛋白標準品B α-La 、Β β b-Lg和 B β a-Lg ；ACQUITY UPLC 超高效液相色譜系統(tǒng)，配Acquity TUV檢測器、FILTER MIXER (425 μ L, Ρ/Ν 205000403)。試驗用試劑
1.0. 1%三氟乙酸乙腈溶液吸取1 mL三氟乙酸用乙腈稀釋至1000 mL ；
2.0. 1%三氟乙酸水溶液吸取1 mL三氟乙酸用水稀釋至1000 mL ；
3.0.1 mol/L鹽酸吸取9 mL鹽酸，用水用水稀釋至1000 mL，加入2 g Triton X-100，超聲溶解；
4.氫氧化鈉溶液稱取50 g氫氧化鈉，溶解于1000 mL水中。5.三種乳清蛋白標準均用超純水稀釋，配制成不同濃度的標樣進行檢測，可得到較好色譜峰形，并且配制簡單。6.標準物質
1)牛乳α-乳白蛋白，純度不低于85%;
2)牛乳β -乳球蛋白，純度不低于90%。其中的β b-乳球蛋白和β 乳球蛋白應經(jīng)液相色譜分離，在波長280 nm處檢測吸收強度。根據(jù)色譜峰的面積，由面積歸一法分別確定各自的含量比。前處理方法
稱取1. 00 g奶粉樣品或10 mL牛奶樣品，添加30 mL (對于牛奶添加20 mL)0. 1 mol/ L的鹽酸溶液溶解，超聲15 min，冷卻至室溫后用乙酸鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至4.5士0. 1，用水定容至50 mL，靜置5 min，室溫靜置后過濾，濾液通過0.2 μ m濾膜，上機檢測。試驗中發(fā)現(xiàn)鹽酸溶液采用含Triton X-100的鹽酸提取液，含Triton X-100對乳清蛋白的提取和穩(wěn)定效果較好，優(yōu)選0. 2% Triton X-100的0. lmol/L鹽酸提取液。色譜條件
權利要求
1.一種超高效液相色譜測定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法，其特征在于在待測的奶粉或牛奶中加入含Triton X-100的鹽酸提取液、超聲溶解，用乙酸鈉水溶液調(diào)整pH 在4. 4-4. 6之間，用水定容、均質，室溫靜置后過濾，濾液通過濾膜，上ACQUITY UPLC BEH300 C18色譜柱，采用ACQUITY UPLC-TUV超高效液相色譜系統(tǒng)測定奶粉或牛奶中B α -La、 B β b-Lg和B β a-Lg三種牛乳清蛋白的含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的超高效液相色譜測定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法， 其特征在于所述濾液通過0. 2 μ m濾膜，所述的色譜柱為ACQUITY UPLC BEH300 C18 2. ImmX 100mm, 1. 7 μ m ；ACQUITY UPLC-TUV 超高效液相色譜系統(tǒng)為沃特世 ACQUITY UPLC 配ACQUITY TUV紫外檢測器；色譜柱的柱溫35°C，流動相A: 0.1%三氟乙酸乙腈溶液； 流動相B 0. 1%三氟乙酸水溶液，采用梯度洗脫，流速為0. 2 mL/min ；檢測波長280 nm ； 分析時間15 min ；通過外標法測定Ba-La、B β b-Lg和B β a-Lg三種牛乳清蛋白的含量。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的超高效液相色譜測定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法，其特征在于所述的色譜柱采用Waters孔徑為300A的ACQUITY UPLC BEH300 C18色譜柱進行分離。
全文摘要
本發(fā)明公開一種超高效液相色譜測定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法，其特點是在待測的奶粉和牛奶中加入含TritonX-100的鹽酸提取液、超聲溶解，用乙酸鈉水溶液調(diào)整pH在4.4-4.6之間，用水定容、均質，室溫靜置后過濾，濾液通過濾膜，上ACQUITYUPLCBEH300C18色譜柱，采用ACQUITYUPLC-TUV超高效液相色譜系統(tǒng)測定奶粉和牛奶中Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三種牛乳清蛋白的含量。運用相對簡單高效的純化步驟進行操作，實現(xiàn)Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg，的分離，保證了定量精度，并有效去除酪蛋白質和脂類等雜質干擾，提高了最終檢測的靈敏度。方法的檢出限為1μg/g。
文檔編號G01N30/60GK102331471SQ20111028326
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權日2011年9月22日
發(fā)明者林玉宙, 陳光耀 申請人:明一(福建)嬰幼兒營養(yǎng)品有限公司