專利名稱：一種用CCl₄誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)藥物的篩選方法，具體涉及一種用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法。
背景技術(shù)：
近年來，由于環(huán)境污染，高蛋白、高脂肪或霉變飼料的使用、抗生素和殺蟲劑的濫用等因素所造成的魚類肝膽綜合癥在全國許多地區(qū)頻繁發(fā)生，造成了鯉、鯽、草魚、團(tuán)頭魴和青魚等多種魚類的大面積死亡，死亡率高達(dá)60-90%，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。魚類肝膽綜合癥的病因多樣，但其共性都是造成魚類肝組織損傷，進(jìn)而引起代謝紊亂并引發(fā)細(xì)菌和病毒感染而造成魚類的死亡。各種抗生素、殺蟲劑和抗病毒藥物都不能有效地控制魚類肝膽綜合癥，該病目前還沒有有效的治療方法。哺乳動(dòng)物抗肝損傷藥物的篩選通常選用小鼠(或大鼠)急性肝損傷模型，其中 CCi4S導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型是最經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型，被廣泛應(yīng)用于保肝藥物的研究和開發(fā)。魚類是變溫動(dòng)物，藥物在魚體內(nèi)與其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的代謝有所不同，因此用小鼠急性肝損傷模篩選出的保肝藥物對(duì)魚類未必適用。中國專利201010170675. 2公開了一種用模式生物斑馬魚篩選抗肝損傷藥物的方法，該專利雖然用水產(chǎn)動(dòng)物斑馬魚作為模型生物，但是篩選出的抗肝損傷藥物對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚類肝病的預(yù)防并不適用。首先，該發(fā)明先用CCl4浸泡斑馬魚誘導(dǎo)肝損傷，然后將受試藥物加入水中浸泡肝損傷的斑馬魚3天，因此該發(fā)明實(shí)際上是篩選肝損傷治療藥物而非預(yù)防藥物，而水產(chǎn)動(dòng)物病害的防治是以預(yù)防為主；其次，該發(fā)明給藥的方式是藥物浸泡3天，在生產(chǎn)上如果也通過浸泡的方式給藥且全池使用，勢(shì)必需要很大的藥量，如果將池塘中的魚集中用藥浸泡長(zhǎng)達(dá)3天，雖然可以降低用藥量，但操作難度極大，極易引起魚類缺氧死亡， 實(shí)用性不強(qiáng)；另外，由于斑馬魚小，長(zhǎng)度只有3-4厘米，體重不足1克，抽血難度極大，不能通過測(cè)量血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)的變化來評(píng)價(jià)受試藥物的抗肝損傷活性，只能檢測(cè)肝勻漿中的GPT和GOT，這樣就必須將斑馬魚處死，取出其很小的肝臟，制成肝勻漿，操作難度大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中日趨嚴(yán)重的以肝損傷為主要特征的魚類肝膽綜合癥，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以肝膽綜合癥的主要危害對(duì)象鯉魚為模型生物篩選預(yù)防魚類肝損傷藥物的方法。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，具體包括以下步驟(1)取具有相同遺傳背景的鯉魚，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、CCl4模型對(duì)照組、受試藥物組，每組魚的數(shù)量相同，飼養(yǎng)在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，正常對(duì)照組和CCl4模型對(duì)照組投喂鯉魚顆粒飼料，受試藥物組投喂添加了受試藥物的鯉魚顆粒飼料，日投喂量為魚體重的3%， 連續(xù)投喂1-2月。(2)用藥投喂1-2月后，按照每IOg魚體重注射0. 05mL濃度為25-30% (ν/ν)的 CCl4植物油溶液，對(duì)CCl4模型對(duì)照組、受試藥物組進(jìn)行腹腔注射，正常對(duì)照組按照同樣的劑量注射植物油，48-72h后，將試驗(yàn)魚麻醉，每條魚尾靜脈采血，離心分離血清，檢測(cè)血清中的 GPT、G0T和LDH水平，根據(jù)GPT、G0T和LDH的變化評(píng)價(jià)受試藥物的保肝功效，篩選魚類保肝藥物。作為優(yōu)選方案，以上所述的用CCl4S導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其中步驟(2)用CCl4造模時(shí)，其濃度為25-30%的植物油溶液。因?yàn)镃Cl4的濃度如果太高，會(huì)對(duì)試驗(yàn)魚造成嚴(yán)重的毒性，導(dǎo)致試驗(yàn)魚的死亡，從而使造模失??；如果CCl4的濃度如果太低，不足以造成對(duì)試驗(yàn)魚的肝損傷，也不能得到符合要求的肝損傷模型，本發(fā)明通過對(duì)不同濃度的CCl4濃度進(jìn)行篩選，以試驗(yàn)魚肝功能(血清中的GPT、G0T和LDH水平)為指標(biāo)，得出最佳造模所需的CCl4濃度為30%的植物油溶液。作為優(yōu)選方案，以上所述的用CCl4S導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其中步驟(2)所述的造模時(shí)間為48-72小時(shí)，因?yàn)槿绻炷r(shí)間短，試驗(yàn)魚血液中的肝功能指標(biāo)沒有發(fā)生變化，不符合造模要求，但是如果造模時(shí)間太長(zhǎng)，試驗(yàn)魚會(huì)出現(xiàn)耐受，血液中的肝功能指標(biāo)會(huì)恢復(fù)，也不符合造模要求，本發(fā)明通過對(duì)不同的造模時(shí)間進(jìn)行篩選，確定CCl4造模的最佳時(shí)間為72小時(shí)。作為優(yōu)選方案，以上所述的用CCl4S導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其中步驟(2)所述的注射計(jì)量為每IOg魚體重注射0.05mL 30%的CCl4植物油溶液，因?yàn)槿绻⑸鋭┝刻?，注射液容易溢出，且大量的植物油在試?yàn)魚體內(nèi)也會(huì)增加試驗(yàn)魚的代謝負(fù)擔(dān)，如果注射劑量太小，注射時(shí)的誤差偏大，也會(huì)影響造模的準(zhǔn)確性。作為優(yōu)選方案，以上所述的用CCl4S導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其中步驟( 所述的檢測(cè)血清中的GPT、GOT和LDH水平而不是肝勻漿中的GPT、GOT和 LDH水平。因?yàn)橹苽溲甯奖?，而且不必處死試?yàn)魚。作為優(yōu)選方案，以上所述的用CCl4S導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其中步驟( 所述的尾靜脈采血量為1.5mL，因?yàn)槿绻裳刻?，?huì)導(dǎo)致魚的死亡，如果采血量太少，血清量不足以檢測(cè)GPT、GOT和LDH三個(gè)指標(biāo)。作為優(yōu)選方案，以上所述的用CCl4S導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其中步驟(1)中的鯉魚大小相近、飼養(yǎng)環(huán)境相同。作為優(yōu)選方案，以上所述的用CCl4S導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其中步驟(1)所述的受試藥物用少量植物油均勻攪拌在顆粒飼料的外表，對(duì)照組投喂的顆粒飼料用相同劑量的植物油攪拌在其表面，風(fēng)干后保存于4°c。作為優(yōu)選方案，以上所述的用CCl4S導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其中步驟(1)受試藥物包括多種，每種受試藥物設(shè)2-3個(gè)劑量梯度，每種受試藥物的每個(gè)劑量對(duì)應(yīng)一個(gè)受試藥物組，對(duì)每一個(gè)受試藥物組投喂添加了對(duì)應(yīng)劑量的受試藥物的鯉魚顆粒飼料。作為優(yōu)選方案，以上所述的用CCl4S導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其中步驟(1)所述的用MS222(100mg/L)麻醉后采血可有效降低應(yīng)激對(duì)試驗(yàn)魚血液學(xué)指標(biāo)的影響，并可降低試驗(yàn)魚的痛苦。作為優(yōu)選方案，以上所述的用CCl4S導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其中步驟(1)所述的受試藥物可為化學(xué)藥品、中草藥或其提取物、中草藥或其提取物復(fù)方。受試藥物用少量植物油均勻攪拌在顆粒飼料的外表(20克植物油/kg飼料)，通過飼喂的方式給藥，操作方便，實(shí)用性強(qiáng)。本發(fā)明提供的CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供的CC14誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法的制備方法， 以生產(chǎn)上肝膽綜合癥的主要危害對(duì)象鯉魚為模型生物，針對(duì)性強(qiáng)；試驗(yàn)魚個(gè)體大，不僅造模成功率高，而且抽血容易，可以利用血清中肝功能指標(biāo)的變化作為肝損傷和藥物保肝功效的評(píng)價(jià)指標(biāo)，不必制備肝勻漿，因而不必處死試驗(yàn)魚，操作方便簡(jiǎn)單；通過飼喂口服給藥，克服了浸泡給藥的弊端，實(shí)用性強(qiáng)，可操作性強(qiáng)；通過先給藥后損傷的方法篩選魚類預(yù)防肝損傷藥物，符合水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治以防為主的方針；可成批量進(jìn)行篩選，效率高。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1急性肝損傷造模篩選實(shí)驗(yàn)1、誘導(dǎo)鯉魚急性肝損傷模型所用CCl4濃度的選擇取50條體重150克左右的鯉魚，隨機(jī)分為對(duì)照組和不同濃度CCl4組(12. 5%、 25 %、30 %和50 % )，共5組，每組10條，飼養(yǎng)在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)5個(gè)水族箱中，每個(gè)水族箱的水量為150升。飼養(yǎng)2周后，用濃度為0、12. 5%、25%、30%和50% (ν/ν)的CCl4植物油溶液分別腹腔注射對(duì)照組和不同濃度CCl4組，劑量為0. 05mL/10g魚體重。注射72小時(shí)后， 各組魚用3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽MS222(100mg/L)麻醉，每條魚尾靜脈采血1. 5mL, 離心分離血清，用南京建成生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)血清中的GPT、GOT和乳酸脫氫酶(LDH)水平。具體結(jié)果如表1所示。
表1不同濃度CCl4對(duì)鯉魚血清GPT、GOT和LDH影響(平均值士 S. D.，樣本數(shù)η = 10
或7)
CCl4植物油溶液的濃度(％)注射后死亡率(％)GPT (IU/L)GOT (IU/L)LDH對(duì)照組014.08±2.3415.40±2.203265.60± 112.6912.5018.63±3.8920.11±3.183347.38 ±152.2625059.49±6.74**43.08±4.74**3762.15±206.84**30064.37±10.16**46.36±4.35**3906.33 ±294.43**503073.09±11.93**56.54±5.76**4213.84±260.06** 與正常對(duì)照組比較，t-檢驗(yàn)，*P < 0. 05，**P < 0.01o
5
由表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)CCl4的濃度為12. 5%時(shí)，試驗(yàn)魚血清中的GPT、GOT和LDH 與正常對(duì)照組沒有顯著差異；當(dāng)CCl4的濃度為50%時(shí)，有30%的魚注射后死亡；當(dāng)CCl4的濃度為25 30%時(shí)，試驗(yàn)魚血清中的GPT、G0T和LDH與正常對(duì)照組有顯著差異，且沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。作為最佳選擇，本發(fā)明在用CCl4S導(dǎo)鯉魚肝損傷模型時(shí)，選用30%的014植物油溶液。2、用CCl4誘導(dǎo)鯉魚急性肝損傷模型造模時(shí)間的選擇取120條體重150克左右的鯉魚，飼養(yǎng)在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)12個(gè)水族箱中，每個(gè)水族箱水量為150升，飼養(yǎng)10條。隨機(jī)分為對(duì)照組(6個(gè)水族箱)和濃度為30%的CCl4組 (6個(gè)水族箱)。飼養(yǎng)2周后，用植物油和濃度為30%的CCl4植物油溶液分別腹腔注射對(duì)照組和CCl4組，劑量為0. 05mL/10g魚體重。注射24，48，72，96，120，144小時(shí)后，取對(duì)照組和 CCl4組魚用MS222 (100mg/L)麻醉，每條魚尾靜脈采血1. 5mL,離心分離血清，用南京建成生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)血清中的GPT、GOT和LDH水平。具體結(jié)果如表2所示。
表2CC14注射鯉魚后不同時(shí)間對(duì)血清GPT、GOT和LDH的影響(平均值士S. D.，樣本數(shù) η = 10)
權(quán)利要求
1.一種用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其特征在于，包括(1)取具有相同遺傳背景的鯉魚，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、CCl4模型對(duì)照組、受試藥物組， 每組魚的數(shù)量相同，飼養(yǎng)在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，正常對(duì)照組和CCl4模型對(duì)照組投喂鯉魚顆粒飼料，受試藥物組投喂添加了受試藥物的鯉魚顆粒飼料，日投喂量為魚體重的3%，連續(xù)投喂1-2月；(2)用藥投喂1-2月后，按照每IOg魚體重注射0.05mL濃度為25-30%的CCl4植物油溶液，對(duì)CCl4模型對(duì)照組、受試藥物組進(jìn)行腹腔注射，正常對(duì)照組按照同樣的劑量注射植物油，48-7 后，將試驗(yàn)魚麻醉，每條魚尾靜脈采血，離心分離血清，檢測(cè)血清中的GPT、G0T和 LDH水平，根據(jù)GPT、GOT和LDH的變化評(píng)價(jià)受試藥物的保肝功效，篩選魚類保肝藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其特征在于，步驟(1)所述的鯉魚大小相近、飼養(yǎng)環(huán)境相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其特征在于，步驟(1)所述的連續(xù)投喂1-2月可根據(jù)藥物功效的不同延長(zhǎng)或縮短。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其特征在于，步驟(1)所述的受試藥物用少量植物油均勻攪拌在顆粒飼料的外表，對(duì)照組投喂的顆粒飼料用相同劑量的植物油攪拌在其表面，風(fēng)干后保存于4°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其特征在于，步驟(2)用CCl4造模的最佳濃度為30%的植物油溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其特征在于，步驟(2)所述的最佳造模時(shí)間為72小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其特征在于，步驟( 所述的試驗(yàn)魚采血前用MS-222麻醉。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其特征在于，在步驟(1)中，受試藥物包括多種，每種受試藥物設(shè)2-3個(gè)劑量梯度，每種受試藥物的每個(gè)劑量對(duì)應(yīng)一個(gè)受試藥物組，對(duì)每一個(gè)受試藥物組投喂添加了對(duì)應(yīng)劑量的受試藥物的鯉魚顆粒飼料。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其特征在于，步驟(1)所述的受試藥物包括中草藥、其提取物或其提取物復(fù)方。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，其特征在于，所述受試藥物包括黃芪多糖和當(dāng)歸提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，該方法將受試藥物添加到鯉魚飼料中，口服給藥1-2個(gè)月后，用優(yōu)選的濃度為25-30％的CCl4植物油溶液，按每10g魚體重注射0.05mL的劑量，腹腔注射，48-72小時(shí)后，用血清GPT、GOT和LDH活性的變化來評(píng)價(jià)不同受試藥物的保肝活性。本發(fā)明以生產(chǎn)上肝膽綜合癥的主要危害對(duì)象鯉魚為模型生物，針對(duì)性強(qiáng)；口服給藥，方便實(shí)用；通過血液肝功能指標(biāo)變化評(píng)價(jià)受試藥物的保肝活性，不必處死試驗(yàn)魚，可操作性強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的用CCl4誘導(dǎo)鯉魚肝損傷模型篩選魚類保肝藥物的方法，結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)性強(qiáng)，成本低，應(yīng)用范圍廣，可成批量進(jìn)行篩選，效率高。
文檔編號(hào)G01N33/96GK102360017SQ20111026088
公開日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者曹麗萍, 殷國俊, 賈睿 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心