專利名稱：一種高靈敏度免疫芯片檢測系統(tǒng)及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)及其使用方法，屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)代血清學檢測技術(shù)中，除了 ELISA法之外，還經(jīng)常采用放免法以及化學發(fā)光法等。ELISA法在臨床實驗室已得到普遍的應(yīng)用，特別是用于各型肝炎標志物的檢測。但 ELISA法由于操作程序復(fù)雜，時間較長，且需要價格昂貴的酶標儀等實驗室非通用設(shè)備。 ELISA法需時較長的主要原因，是由于液相中的抗原(或抗體)需經(jīng)擴散才能與固相上的抗原或抗體反應(yīng)不適當?shù)乜s短反應(yīng)時間，將使靈敏度降至臨床要求以下。一步法快速檢測試劑盒，雖可提高檢測速度，但有出現(xiàn)假陰性結(jié)果的弊端。放免法只能進行單一指標的檢測， 單個指標檢測也需要2 4h，也需要價格昂貴的R-計數(shù)器等專用設(shè)備，且存在著放射性衰減和污染?；瘜W發(fā)光檢測時間短且靈敏度高，但仍是標記方法的間接判讀結(jié)果，未引入分子量等更為客觀的結(jié)果判讀體系，檢測正確度易受影響，對每種指標的檢測需專供設(shè)計，如多種抗體的檢測存在檢測時間長、成本較高的問題，不利于基層臨床檢驗活動的開展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于檢測時具有檢測速度快、靈敏度高的優(yōu)點，它不需要熒光掃描儀等昂貴的設(shè)備，不需復(fù)雜的操作，不受實驗條件的限制，在操作完成后即可直接或間接觀察結(jié)果，大大縮短檢測時間和勞動強度。本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的
一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，它包括芯片反應(yīng)系統(tǒng)和顯色系統(tǒng)；芯片反應(yīng)系統(tǒng)包括載體、反應(yīng)液和洗滌液；顯色系統(tǒng)包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結(jié)合的探針點陣或質(zhì)控點； 反應(yīng)液包括兩種，一種為能與生物學指標結(jié)合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈霉親和素的復(fù)合物；或者
反應(yīng)液為過氧化物辣根酶標記的能與生物學指標相結(jié)合的物質(zhì)； 終止液為0. 01 10. 0 (w/v) %的疊氮鈉溶液。本發(fā)明上述技術(shù)方案中，與生物學指標可特異性結(jié)合的物質(zhì)可以是抗原、抗體、 SPA蛋白、羊抗檢測樣本來源種屬IgG、鼠抗檢測樣本來源種屬IgG、其他動物免疫的抗檢測樣本來源種屬IgG、生物學指標的多克隆抗體等。本發(fā)明上述技術(shù)方案中，所述載體可以是羧基化等修飾后的載體，一般未修飾的載體其連接方式是物理吸附，修飾后的載體其連接方式是共價鍵結(jié)合；但無論是物理吸附和共價鍵結(jié)合均不會對本發(fā)明的檢測產(chǎn)生本質(zhì)影響。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述洗滌液的配方如下0. 1 10( v/v)%的TWEEN-20、
50. 01 0. 2摩爾每升pH6 8的PB緩沖液、0. 1 20 (ν/ν) %的proclin300。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述檢測液包括pH4 7的A液和pH2 7的B液，A 液包括H202和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中， H2O2濃度為0. 005 0. 5 (v/v)%、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 01 0. 2摩爾每升； 檸檬酸鈉濃度為0. 01 0. 1摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 01 1. 0毫克每毫升。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述載體為孔徑在0. 1 12微米的多孔性微孔濾膜。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述多孔性微孔濾膜為纖維素類微孔濾膜、尼龍類微孔濾膜或聚氟乙烯類微孔濾膜。所述纖維素類微孔濾膜是指硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、醋酸纖維素與硝酸纖維素的混合物制成的膜、纖維素膜、玻璃纖維素膜等。所述聚氟乙烯類微孔濾膜是指具偏氟乙烯膜和具四氟乙烯膜等。作為上述技術(shù)方案的另一種優(yōu)選，所述載體還可以是聚乙烯、聚苯乙烯、硅橡膠或玻璃材料制成的各種可用于生物學檢測的承載體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)的使用方法，它包括以下步驟
1)蛋白反應(yīng)芯片的制作
用點樣儀將一種或多種能與生物學指標結(jié)合的探針溶液或質(zhì)控點以點陣的形式固化于載體上，室溫干燥，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配制
配制濃度為0. 01 0. 5摩爾每升的PB緩沖液，其中含有濃度為0. 01 20%的水溶性色素；
3)封閉液的配制
封閉液的配方如下濃度為1 10 (w/v)%的BSA溶液、濃度為1 10 (w/v)%的蔗糖溶液、濃度為0. 1 10 (ν/ν) %的TWEEN-20、0. 1 20 (ν/ν)的proclin300、度為 0. 01 0. 2摩爾每升pH為6 8的PB緩沖液；
4)洗滌液的配制
洗滌液的配方如下0. 1 10% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 01 0. 2摩爾每升pH6 8的 PB 緩沖液、0. 1 20 (ν/ν) % 的 proclin300 ；
5)能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)的生物素標記
①用無水DMSO配置1 20毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀酰亞胺酯溶液；
②用濃度為0.01 0. 2摩爾每升pH6 9的硼酸鹽緩沖液為溶劑配制濃度至少為 0. 5 5毫克每升的能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)溶液；
③按10 200微克每毫克的比率將生物素酯加入上述能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)溶液中，混合均勻后并在室溫下孵育1 h 乩；
④按每100 500微克生物素酯內(nèi)加入1 100微升的濃度為0.5 2. 0摩爾每升的氯化銨，室溫孵育5 60min ；
⑤將經(jīng)過步驟③的能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)溶液用0.01 0.2摩爾每升的PBS、 CBS、醋酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液透析2 4 進行純化，或再用蛋白A 或蛋白G層析柱再次純化能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)；6)鏈霉親和素能可與生物學探針結(jié)合物質(zhì)與過氧化物辣根酶的復(fù)合物標記
①新鮮配制1.0 10. 0毫克每毫升的HRP溶液；
②向HRP溶液中加入0.1 1. Oml新鮮配制的0. 01 2. 0摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②制得的溶液裝入透析袋中，用1 10毫摩每升的pH為4 7的醋酸鈉緩沖液進行透析，2 6°C靜置或攪拌；
④向步驟③制得的溶液中加入10 100微升0.1 1. 0摩爾每升的pH為7 10碳酸鹽緩沖液；
⑤向步驟④制得的溶液中加入0.1 10毫克的鏈霉親和素或能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)，室溫避光輕輕攪拌1 6小時；
⑥向步驟⑤制得的溶液中加0.1 1. 0毫升新鮮配制的濃度為1 10毫克每毫升的 NaBH 4溶液混勻，2 6°C靜置1 6小時；
⑦將步驟⑥制得的溶液裝入透析袋中，用0.01 0. 2摩爾每升pH為6 8的PBS溶液進行透析，2 6°C，過夜。 ⑧將步驟⑦制得的透析液，在1000 10000 rpm條件下離心去沉淀，上清液為含 HRP-鏈霉親和素或HRP-能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合物；
7)檢測液的配制
檢測液包括PH4 7的A液和pH2 7的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 005 0. 5 (ν/ν) %、 檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 01 0. 2摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 01 0. 1摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 01 1. 0毫克每毫升；
8)終止液的配制
配制濃度為0. 01 10. 0 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
具體操作如下
首先將檢測樣本加到蛋白芯片上，通過搖床溫育的方式，使樣本溶液中多種生物學指標與芯片載體上包被的對應(yīng)探針進行特異性的反應(yīng)結(jié)合，然后將反應(yīng)完成的載體用洗滌液進行洗滌，以減少其它干擾物質(zhì)的非特性結(jié)合；接下來加入步驟5)制備的生物素標記好的能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)和步驟6)制備好的過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物或 HRP-能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-探針-生物學指標-步驟5)制備的生物素標記的能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)-鏈霉親和素-過氧化物辣根酶的復(fù)合物或載體-探針-生物學指標-能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)-過氧化物辣根酶的復(fù)合物，再將反應(yīng)完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入檢測液A液與B液的混合液以及終止液，完成整個芯片的反應(yīng)過程，最后棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成后通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統(tǒng)完成對顏色點陣的信號讀取后與檢測儀中設(shè)置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測；
或
首先將封閉液滴加蛋白芯片中，再將檢測樣本加入蛋白芯片中，使樣本溶液中的生物學指標與芯片載體上包被的對應(yīng)探針進行特異性的反應(yīng)結(jié)合，然后將反應(yīng)完成的膜面滴加洗滌液進行洗滌，以減少其它干擾物質(zhì)的非特性結(jié)合，接下來加入步驟5)制備的生物素標記好的能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)和步驟6)制備好的過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物或HRP-能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-探針-生物學指標-步驟5)制備的生物素標記的能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)-鏈霉親和素-過氧化物辣根酶的復(fù)合物或載體-探針-生物學指標-能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)-過氧化物辣根酶的復(fù)合物，再將反應(yīng)完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入檢測液A液與B液的混合液以及終止液，完成整個芯片的反應(yīng)過程，最后棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成后通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統(tǒng)完成對顏色點陣的信號讀取后與檢測儀中設(shè)置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果
1、本發(fā)明參照膠體金免疫滲濾法和生物芯片的主要技術(shù)優(yōu)勢和實現(xiàn)方式，最大限度的發(fā)揮檢測快速、操作簡單、檢測時間短和勞動強度低等等優(yōu)勢；
2、選用合適的載體以及修飾后的載體，載體上可同時包被一種、兩種或多種與生物學指標可特異性結(jié)合的探針，以實現(xiàn)檢測多元化，最大程度發(fā)揮此平臺并行檢測的優(yōu)勢，為臨床檢測提供更為豐富的數(shù)據(jù)用于醫(yī)院、基層衛(wèi)生服務(wù)站等醫(yī)療機構(gòu)的大規(guī)模篩查、監(jiān)測或輔助判斷；
3、目前蛋白芯片無法在探針包被階段使每個點陣有顏色顯示，因為這樣最終的顯色會受到點陣顏色的直接的干擾，降低了產(chǎn)品的靈敏度和準確度；而本發(fā)明采用水溶性的色素對包被階段的探針點陣進行著色，而在封閉操作后顏色徹底消失，這樣不僅有利于在探針包被和產(chǎn)品裝配階段對產(chǎn)品質(zhì)量進行方便、有效的控制，而且還不會對最終的檢測結(jié)果進行任何干擾；
4、本發(fā)明引入生物素-親和素信號放大系統(tǒng)，進一步提高免疫芯片檢測方法的檢測靈敏度，進一步拓寬蛋白芯片系統(tǒng)的檢測范圍，以適應(yīng)目前臨床檢測不斷發(fā)展的要求；
5、本發(fā)明將膠體金蛋白芯片檢測方法和化學發(fā)光檢測方法相結(jié)合，摒棄了膠體金作為蛋白芯片方法的顯色系統(tǒng)，采用了化學發(fā)光檢測中的HRP-TMB顯色系統(tǒng)，同時TMB溶液采用優(yōu)化后的方法進行自行配制，進一步提高的免疫芯片檢測方法的檢測靈敏度；
6、本發(fā)明采用的終止液為自制配方，本法可長時間保存免疫滲濾芯片顯色后的點陣， 避免了膠體金顯色點陣時間久置后顏色消失而導致不利于檢測結(jié)果的保存、復(fù)核和追溯的問題；
7、本發(fā)明在反應(yīng)顯色后，既可采用肉眼直接比對的方式，也可采用自制的檢測儀器，對顯色后的各顯色點信號進行自動讀取，進一步豐富了判讀方式，增加了判讀方式的可選擇性和靈活性，提高了檢測的準確性。
具體實施例方式本具體實施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護。實施例一
一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，它包括芯片反應(yīng)系統(tǒng)和顯色系統(tǒng)；芯片反應(yīng)系統(tǒng)包括載體、反應(yīng)液和洗滌液；顯色系統(tǒng)包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結(jié)合的探針點陣或質(zhì)控點； 反應(yīng)液包括兩種，一種為能與生物學指標結(jié)合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈霉親和素的復(fù)合物；
所述檢測液包括PH4的A液和pH2的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液， B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2A濃度為0. 005 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 01摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 01摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0.01毫克每升；
所述洗滌液的配方如下0. 1 (v/v)%的TWEEN-20、0. 01摩爾每升pH6的PB緩沖液、 0. 1 (v/v)% 的 proclin300 ；
終止液為0. 01 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
所述載體為孔徑在0. 1微米的多孔性硝酸纖維素微孔濾膜。下面通過一種高靈敏度I型糖尿病多種抗體試劑盒(免疫滲濾法)的設(shè)計來闡述本發(fā)明。包括以下步驟
1)免疫滲濾反應(yīng)芯片的制作
用點樣儀將確定濃度的谷氨酸脫羧酶-65、ICA、胰島素、酪氨酸磷酸酶、&1T8A、羧基肽酶_H、HSP65、抗胰島受體共8種或其中的幾種抗原溶液和質(zhì)控點以點陣的形式固化于硝酸纖維素膜上，室溫干燥2小時，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配制
配制濃度為0. 01摩爾每升的PB緩沖液，其中含有濃度為0. 01的水溶性色素莧菜紅；
3)封閉液的配制
封閉液的配方如下濃度為1 (w/v)%的BSA溶液、濃度為1%的蔗糖溶液、濃度為0. 1% 的TWEEN-20、0. 1的proclin300、濃度為0. 01摩爾每升pH為6的PB緩沖液；
4)洗滌液的配制
洗滌液的配方如下0. 1 (ν/ν)的TWEEN-20、0. 01摩爾每升pH6的PB緩沖液、0. 1 (ν/ ν)% 的 proclin300 ；
5)抗體標記
①用無水DMSO配置1 20毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀酰亞胺酯溶液；
②用濃度為0.01摩爾每升pH6的硼酸鹽緩沖液為溶劑配制濃度至少為0. 5毫克每升的抗體溶液；
③按10微克每毫克的比率將生物素酯加入上述抗體溶液中，混合均勻后并在室溫下孵育1 h ；
④按每100微克生物素酯內(nèi)加入1微升的濃度為0.5摩爾每升的氯化銨，室溫孵育 5min ；
⑤將經(jīng)過步驟③的抗體溶液用0.01摩爾每升的PBS、CBS、醋酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液透析池進行純化，或再用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體；
6)過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物標記 ①新鮮配制1. 0毫克每毫升的HRP溶液；②向HRP溶液中加入0.Iml新鮮配制的0. 01摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②制得的溶液裝入透析袋中，用1毫摩每升的PH為4的醋酸鈉緩沖液進行透析，2°C靜置或攪拌；
④向步驟③制得的溶液中加入10微升0.1摩爾每升的pH為7碳酸鹽緩沖液；
⑤向步驟④制得的溶液中加入0.1毫克的鏈霉親和素，室溫避光輕輕攪拌1小時；
⑥向步驟⑤制得的溶液中加0.1毫升新鮮配制的濃度為1毫克每毫升的NaBH 4溶液混勻，2°C靜置1小時；
⑦將步驟⑥制得的溶液裝入透析袋中，用0.01摩爾每升pH為6的PBS溶液進行透析， 2°C，過夜。⑧將步驟⑦制得的透析液，在1000 rpm條件下離心去沉淀，上清液為含HRP-鏈霉親和素的結(jié)合物；
7)檢測液的配制
檢測液包括PH4的A液和pH2的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2A濃度為0. 005 (v/v)%、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 01摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 01摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為 0.01毫克每毫升；
8)終止液的配制
配制濃度為0. 01 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
首先將封閉液滴加免疫滲濾芯片中，再將檢測樣本加入免疫滲濾芯片中，通過滲濾的方式，使樣本溶液中的抗體與芯片載體上包被的對應(yīng)抗原進行特異性的反應(yīng)結(jié)合，然后將反應(yīng)完成的膜面滴加洗滌液進行洗滌，以減少其它干擾物質(zhì)的非特性結(jié)合，接下來加入步驟5)制備的生物素標記好的抗體和步驟6)制備好的過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-抗原-抗體-步驟5)制備的標記好的抗體IgG-鏈霉親和素-過氧化物辣根酶的復(fù)合物，再將反應(yīng)完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入TMB A液與B液的混合液以及終止液，完成整個芯片的反應(yīng)過程，最后棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成后通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統(tǒng)完成對顏色點陣的信號讀取后與檢測儀中設(shè)置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。實施例二
一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，它包括芯片反應(yīng)系統(tǒng)和顯色系統(tǒng)；芯片反應(yīng)系統(tǒng)包括載體、反應(yīng)液和洗滌液；顯色系統(tǒng)包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結(jié)合的探針點陣或質(zhì)控點；
反應(yīng)液包括兩種，一種為能與生物學指標結(jié)合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈霉親和素的復(fù)合物；
所述檢測液包括PH5的A液和pH3的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液， B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 01 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 04摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 02摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 02毫克每毫升；所述洗滌液的配方如下0. 5 (v/v)%的TWEEN-20、0. 04摩爾每升pH6的PB緩沖液、1 (v/v)% 的 proclin300 ；
終止液為0. 05 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
所述載體為孔徑在0. 1 1微米的多孔性醋酸纖維素膜微孔濾膜。下面通過一種高靈敏度I型糖尿病多種抗體檢測試劑盒(免疫滲濾法)的設(shè)計來闡述本發(fā)明。包括以下步驟
1)免疫滲濾反應(yīng)芯片的制作
用點樣儀將將確定濃度的谷氨酸脫羧酶-65、ICA、胰島素、酪氨酸磷酸酶、&1T8A、羧基肽酶_H、HSP65、抗胰島受體共8種或其中的幾種抗原溶液和質(zhì)控點以點陣的形式固化于載體上，室溫干燥，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配制
配制濃度為0. 05摩爾每升的PB緩沖液，其中含有濃度為1%的水溶性色素胭脂紅；
3)封閉液的配制
封閉液的配方如下濃度為2 (w/v)%的BSA溶液、濃度為2 (w/v)%的蔗糖溶液、濃度為 0. 5 (ν/ν) % 的 TWEEN-20、1 (ν/ν)的 proclin300、濃度為 0. 04 摩爾每升 pH 為 6 的 PB 緩沖液；
4)洗滌液的配制
洗滌液的配方如下0. 5% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 04摩爾每升pH6的PB緩沖液、1 (ν/ ν)% 的 proclin300 ；
5)抗體標記
①用無水DMSO配置2毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀酰亞胺酯溶液；
②用濃度為0.04摩爾每升pH7的硼酸鹽緩沖液為溶劑配制濃度至少為1毫克每升的抗體溶液；
③按40微克每毫克的比率將生物素酯加入上述抗體溶液中，混合均勻后并在室溫下孵育濁；
④按每200微克生物素酯內(nèi)加入10微升的濃度為0.8摩爾每升的氯化銨，室溫孵育 IOmin ；
⑤將經(jīng)過步驟③的抗體溶液用0.04摩爾每升的PBS、CBS、醋酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液透析IOh進行純化，或再用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體；
6)過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物標記
①新鮮配制2毫克每毫升的HRP溶液；
②向HRP溶液中加入0.2ml新鮮配制的0. 05摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②制得的溶液裝入透析袋中，用2毫摩每升的pH為5的醋酸鈉緩沖液進行透析，3°C靜置或攪拌；
④向步驟③制得的溶液中加入20微升0.2摩爾每升的pH為7碳酸鹽緩沖液；
⑤向步驟④制得的溶液中加入0.5毫克的鏈霉親和素，室溫避光輕輕攪拌2小時；
⑥向步驟⑤制得的溶液中加0.2毫升新鮮配制的濃度為2毫克每毫升的NaBH 4溶液混
11勻，3°C靜置2小時；
⑦將步驟⑥制得的溶液裝入透析袋中，用0. 04摩爾每升pH為6的PBS溶液進行透析， 3°C，過夜。⑧將步驟⑦制得的透析液，在2000 rpm條件下離心去沉淀，上清液為含HRP-鏈霉親和素的結(jié)合物；
7)檢測液的配制
檢測液包括PH5的A液和pH3的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 01 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 04摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 02摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為 0. 02毫克每毫升；
8)終止液的配制
配制濃度為0. 5 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
首先將封閉液滴加免疫滲濾芯片中，再將檢測樣本加入免疫滲濾芯片中，通過滲濾的方式，使樣本溶液中的抗體與芯片載體上包被的對應(yīng)抗原進行特異性的反應(yīng)結(jié)合，然后將反應(yīng)完成的膜面滴加洗滌液進行洗滌，以減少其它干擾物質(zhì)的非特性結(jié)合，接下來加入步驟5)制備的標記好的抗體和步驟6)制備好的過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-抗原-抗體-步驟5)制備的標記好的抗體IgG-鏈霉親和素-過氧化物辣根酶的復(fù)合物，再將反應(yīng)完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入TMB A液與B液的混合液以及終止液，完成整個芯片的反應(yīng)過程，最后棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成后通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統(tǒng)完成對顏色點陣的信號讀取后與檢測儀中設(shè)置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。實施例三
一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，它包括芯片反應(yīng)系統(tǒng)和顯色系統(tǒng)；芯片反應(yīng)系統(tǒng)包括載體、反應(yīng)液和洗滌液；顯色系統(tǒng)包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結(jié)合的探針點陣或質(zhì)控點； 反應(yīng)液包括兩種，一種為能與生物學指標結(jié)合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈霉親和素的復(fù)合物；
所述檢測液包括PH5的A液和pH4的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液， B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 05 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 08摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 04摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 05毫克每毫升；
所述洗滌液的配方如下1 (ν/ν) %的TWEEN-20、0. 08摩爾每升pH7的PB緩沖液、2 (ν/ν) % 的 proclin300。終止液為1 (w/v) %的疊氮鈉溶液。所述載體為孔徑在0. 1 12微米的多孔性聚偏氟乙烯微孔濾膜。下面通過一種高靈敏度I型糖尿病多種抗體檢測試劑盒(免疫滲濾法)的設(shè)計來闡述本發(fā)明。包括以下步驟1)免疫滲濾反應(yīng)芯片的制作
用點樣儀將確定濃度的谷氨酸脫羧酶-65、ICA、胰島素、酪氨酸磷酸酶、&1T8A、羧基肽酶_H、HSP65、抗胰島素共8種或其中的幾種抗原溶液和質(zhì)控點以點陣的形式固化于多孔性聚偏氟乙烯微孔濾膜上，室溫干燥，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配制
配制濃度為0. 1摩爾每升的PB緩沖液，其中含有濃度為m的水溶性色素亮藍；
3)封閉液的配制
封閉液的配方如下濃度為4 (w/v)%的BSA溶液、濃度為4 (w/v)%的蔗糖溶液、濃度為 1 (v/v)% 的 TWEEN-20、2 (ν/ν)的 proclin300、濃度為 0. 08 摩爾每升 pH 為 7 的 PB 緩沖液；
4)洗滌液的配制
洗滌液的配方如下1% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 08摩爾每升pH7的PB緩沖液、2 (v/v)% 的 proclin300 ；
5)抗體標記
①用無水DMSO配置5毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀酰亞胺酯溶液；
②用濃度為0.08摩爾每升pH7的硼酸鹽緩沖液為溶劑配制濃度至少為2毫克每升的抗體溶液；
③按80微克每毫克的比率將生物素酯加入上述抗體溶液中，混合均勻后并在室溫下孵育；^ ；
④按每300微克生物素酯內(nèi)加入20微升的濃度為1.2摩爾每升的氯化銨，室溫孵育 20min ；
⑤將經(jīng)過步驟③的抗體溶液用0.08摩爾每升的PBS、CBS、醋酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液透析20h進行純化，或再用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體；
6)過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物標記
①新鮮配制4.0毫克每毫升的HRP溶液；
②向HRP溶液中加入0.4ml新鮮配制的0. 1摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②制得的溶液裝入透析袋中，用4毫摩每升的pH為5的醋酸鈉緩沖液進行透析，4°C靜置或攪拌；
④向步驟③制得的溶液中加入40微升0.4摩爾每升的pH為8的碳酸鹽緩沖液；
⑤向步驟④制得的溶液中加入1毫克的鏈霉親和素，室溫避光輕輕攪拌3小時；
⑥向步驟⑤制得的溶液中加0.4毫升新鮮配制的濃度為4毫克每毫升的NaBH 4溶液混勻，4°C靜置3小時；
⑦將步驟⑥制得的溶液裝入透析袋中，用0.08摩爾每升pH為7的PBS溶液進行透析， 4°C，過夜。 ⑧將步驟⑦制得的透析液，在4000 rpm條件下離心去沉淀，上清液為含HRP-鏈霉親和素的結(jié)合物；
7)檢測液的配制
檢測液包括PH5的A液和pH4的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 05 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 08摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 04摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為 0. 05毫克每毫升； 8)終止液的配制
配制濃度為1 (w/v)%的疊氮鈉溶液；
首先將封閉液滴加免疫滲濾芯片中，再將檢測樣本加入免疫滲濾芯片中，通過滲濾的方式，使樣本溶液中的抗體與芯片載體上包被的對應(yīng)抗原進行特異性的反應(yīng)結(jié)合，然后將反應(yīng)完成的膜面滴加洗滌液進行洗滌，以減少其它干擾物質(zhì)的非特性結(jié)合，接下來加入步驟5)制備的標記好的抗體和步驟6)制備好的過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-抗原-抗體-步驟5)制備的標記好的抗體IgG-鏈霉親和素-過氧化物辣根酶的復(fù)合物，再將反應(yīng)完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入TMB A液與B液的混合液以及終止液，完成整個芯片的反應(yīng)過程，最后棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成后通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統(tǒng)完成對顏色點陣的信號讀取后與檢測儀中設(shè)置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。實施例四
一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，它包括芯片反應(yīng)系統(tǒng)和顯色系統(tǒng)；芯片反應(yīng)系統(tǒng)包括載體、反應(yīng)液和洗滌液；顯色系統(tǒng)包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結(jié)合的探針點陣或質(zhì)控點； 反應(yīng)液包括兩種，一種為能與生物學指標結(jié)合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈霉親和素的復(fù)合物；
所述檢測液包括PH6的A液和pH5的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液， B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2A濃度為0. 1 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 12摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 06摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為 0. 1毫克每毫升；
所述洗滌液的配方如下2 (ν/ν) %的TWEEN-20、0. 12摩爾每升pH7的PB緩沖液、5 (v/v)% 的 proclin300。終止液為2 (w/v) %的疊氮鈉溶液。所述載體為玻片。下面通過一種高靈敏度結(jié)核分枝桿菌多種抗體蛋白芯片檢測系統(tǒng)的設(shè)計來進一步闡述本發(fā)明。包括以下步驟
1)免疫反應(yīng)芯片的制作
用點樣儀將確定濃度的 LAM、ESAT-6、Ag85A、Ag85B、16kDa、38kDa、CFP10、MPT63、 MPT64、MPT70、MPT53、MPT81、MPT84、CFP32、Mtb8、Mtb8. 4、Mtbl6. 3、CFP10_ESAT6 融合蛋白、 MPT63-MPT70融合蛋白、16kDa-38kDa融合蛋白共20種或其中的幾種抗原溶液和質(zhì)控點以點陣的形式固化于活化后的羧基化玻片上，進行多人份裝配和封閉操作，再室溫干燥，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配制配制濃度為0. 2摩爾每升的PB緩沖液，其中含有濃度為5%的水溶性色素果綠；
3)封閉液的配制
封閉液的配方如下濃度為6 (w/v)%的BSA溶液、濃度為6 (w/v)%的蔗糖溶液、濃度為 2 (v/v)% 的 TWEEN-20、5 (ν/ν)的 proclin300、濃度為 0. 12 摩爾每升 pH 為 7 的 PB 緩沖液；
4)洗滌液的配制
洗滌液的配方如下2% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 12摩爾每升pH7的PB緩沖液、5 (v/v)% 的 proclin300 ；
5)抗體標記
①用無水DMSO配置10毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀酰亞胺酯溶液；
②用濃度為0.12摩爾每升pH8的硼酸鹽緩沖液為溶劑配制濃度至少為3毫克每升的抗體溶液；
③按120微克每毫克的比率將生物素酯加入上述抗體溶液中，混合均勻后并在室溫下孵育4h ；
④按每300微克生物素酯內(nèi)加入40微升的濃度為1.4摩爾每升的氯化銨，室溫孵育 30min ；
⑤將經(jīng)過步驟③的抗體溶液用0.12摩爾每升的PBS、CBS、醋酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液透析2 進行純化，或再用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體；
6)過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物標記
①新鮮配制6.0毫克每毫升的HRP溶液；
②向HRP溶液中加入0.6ml新鮮配制的0. 5摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②制得的溶液裝入透析袋中，用6毫摩每升的pH為6的醋酸鈉緩沖液進行透析，4°C靜置或攪拌；
④向步驟③制得的溶液中加入60微升0.6摩爾每升的pH為8碳酸鹽緩沖液；
⑤向步驟④制得的溶液中加入2毫克的鏈霉親和素，室溫避光輕輕攪拌4小時；
⑥向步驟⑤制得的溶液中加0.6毫升新鮮配制的濃度為6毫克每毫升的NaBH 4溶液混勻，4°C靜置4小時；
⑦將步驟⑥制得的溶液裝入透析袋中，用0.12摩爾每升pH為7的PBS溶液進行透析， 4°C，過夜。 ⑧將步驟⑦制得的透析液，在6000rpm條件下離心去沉淀，上清液為含HRP-鏈霉親和素的結(jié)合物；
7)檢測液的配制
檢測液包括PH6的A液和pH5的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中, 濃度為0. 1 (v/v)%、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 12摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 06摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 1 毫克每毫升；
8)終止液的配制
配制濃度為2 Cw/v) %的疊氮鈉溶液；首先將檢測樣本加到蛋白芯片上，通過搖床溫育的方式，使樣本溶液中多種抗體與芯片載體上包被的對應(yīng)抗原探針進行特異性共價的反應(yīng)結(jié)合，然后將反應(yīng)完成的載體用洗滌液進行洗滌，以減少其它干擾物質(zhì)的非特性結(jié)合；接下來加入步驟5)制備的標記好的抗體和步驟6)制備好的過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-抗原-抗體-步驟5)制備的標記好的抗體IgG-鏈霉親和素-過氧化物辣根酶的復(fù)合物，再將反應(yīng)完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入TMB A液與B液的混合液以及終止液，完成整個芯片的反應(yīng)過程，最后棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成后通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統(tǒng)完成對顏色點陣的信號讀取后與檢測儀中設(shè)置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。實施例五
一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，它包括芯片反應(yīng)系統(tǒng)和顯色系統(tǒng)；芯片反應(yīng)系統(tǒng)包括載體、反應(yīng)液和洗滌液；顯色系統(tǒng)包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結(jié)合的探針點陣或質(zhì)控點； 反應(yīng)液包括兩種，一種為能與生物學指標結(jié)合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈霉親和素的復(fù)合物；
所述檢測液包括PH6的A液和pH6的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液， B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 2 (w/v) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 16摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 08摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為 0. 5毫克每毫升；
所述洗滌液的配方如下5 (ν/ν) %的TWEEN-20、0. 16摩爾每升pH8的PB緩沖液、10 (v/v)% 的 proclin300。終止液為5 (w/v) %的疊氮鈉溶液。所述載體為硅橡膠片。下面通過一種高靈敏度結(jié)核分枝桿菌多種抗體蛋白芯片檢測系統(tǒng)的設(shè)計來進一步闡述本發(fā)明。包括以下步驟
1)免疫反應(yīng)芯片的制作
載體上我們選用羧基化的硅橡膠片，用點樣儀將確定濃度的LAM、ESAT-6、Ag85A、 Ag85B、16kDa、38kDa、CFP10、MPT63、MPT64、MPT70、MPT53、MPT81、MPT84、CFP32、Mtb8、 Mtb8. 4、Mtbl6. 3、CFP10_ESAT6 融合蛋白、MPT63-MPT70 融合蛋白、16kDa_38kDa 融合蛋白共 20種或其中的幾種抗原溶液和質(zhì)控點以點陣的形式固化于活化后的羧基化硅橡膠片上，進行多人份裝配和封閉操作，再室溫干燥，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配制
配制濃度為0. 3摩爾每升的PB緩沖液，其中含有濃度為10%的水溶性色素牛奶巧克力
棕；
3)封閉液的配制
封閉液的配方如下濃度為8 (w/v)%的BSA溶液、濃度為8 (w/v)%的蔗糖溶液、濃度為 5 (ν/ν) % 的 TWEEN-20、10 (ν/ν)的 proclin300、濃度為 0. 16 摩爾每升 pH 為 8 的 PB 緩沖液；4)洗滌液的配制
洗滌液的配方如下5% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 16摩爾每升pH8的PB緩沖液、10 (ν/ ν)% 的 proclin300 ；
5)SPA抗體標記
①用無水DMSO配置15毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀酰亞胺酯溶液；
②用濃度為0.16摩爾每升pH8的硼酸鹽緩沖液為溶劑配制濃度至少為4毫克每升的 SPA抗體溶液；
③按160微克每毫克的比率將生物素酯加入上述SPA抗體溶液中，混合均勻后并在室溫下孵育釙；
④按每400微克生物素酯內(nèi)加入60微升的濃度為1.6摩爾每升的氯化銨，室溫孵育 40min ；
⑤將經(jīng)過步驟③的SPA抗體溶液用0.16摩爾每升的PBS、CBS、醋酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液透析3 進行純化，或再用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化SPA 抗體；
6)過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物標記
①新鮮配制8毫克每毫升的HRP溶液；
②向HRP溶液中加入0.8ml新鮮配制的1. 0摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②制得的溶液裝入透析袋中，用8毫摩每升的pH為6的醋酸鈉緩沖液進行透析，5°C靜置或攪拌；
④向步驟③制得的溶液中加入80微升0.8摩爾每升的pH為9碳酸鹽緩沖液；
⑤向步驟④制得的溶液中加入5毫克的鏈霉親和素，室溫避光輕輕攪拌5小時；
⑥向步驟⑤制得的溶液中加0.8毫升新鮮配制的濃度為8毫克每毫升的NaBH 4溶液混勻，5°C靜置5小時；
⑦將步驟⑥制得的溶液裝入透析袋中，用0.16摩爾每升pH為8的PBS溶液進行透析， 5°C，過夜。 ⑧將步驟⑦制得的透析液，在8000 rpm條件下離心去沉淀，上清液為含HRP-鏈霉親和素的結(jié)合物；
7)檢測液的配制
檢測液包括PH6的A液和pH6的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2A濃度為0. 2 (w/v)%、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 16摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 08摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 5 毫克每毫升；
8)終止液的配制
配制濃度為5 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
首先將檢測樣本加到蛋白芯片上，通過搖床溫育的方式，使樣本溶液中多種抗體與芯片載體上包被的對應(yīng)抗原探針進行特異性的共價反應(yīng)結(jié)合，然后將反應(yīng)完成的載體用洗滌液進行洗滌，以減少其它干擾物質(zhì)的非特性結(jié)合；接下來加入步驟5)標記好的SPA生物素化抗體和步驟6)制備好的過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-抗原-抗體-SPA生物素化抗體IgG-鏈霉親和素-過氧化物辣根酶的復(fù)合物，再將反應(yīng)完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入TMB A液與B液的混合液以及終止液，完成整個芯片的反應(yīng)過程，最后棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成后通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統(tǒng)完成對顏色點陣的信號讀取后與檢測儀中設(shè)置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。實施例六
一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，它包括芯片反應(yīng)系統(tǒng)和顯色系統(tǒng)；芯片反應(yīng)系統(tǒng)包括載體、反應(yīng)液和洗滌液；顯色系統(tǒng)包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結(jié)合的探針點陣或質(zhì)控點； 反應(yīng)液為過氧化物辣根酶標記的能與生物學指標相結(jié)合的物質(zhì)； 所述檢測液包括PH7的A液和pH7的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液， B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 5 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 2摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 1摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為 1.0毫克每毫升；
所述洗滌液的配方如下10 (ν/ν)%的TWEEN-20、0. 2摩爾每升pH8的PB緩沖液、20 (v/v)% 的 proclin300。終止液為10. 0 (w/v) %的疊氮鈉溶液。所述載體為尼龍膜。下面通過一種高靈敏度結(jié)核分枝桿菌多種抗體蛋白芯片檢測系統(tǒng)的設(shè)計來進一步闡述本發(fā)明。包括以下步驟
1)免疫反應(yīng)芯片的制作
載體上我們選用尼龍膜，用點樣儀將確定濃度的LAM、ESAT-6、Ag85A、Ag85B、16kDa、 38kDa、CFP10、MPT63、MPT64、MPT70、MPT53、MPT81、MPT84、CFP32、Mtb8、Mtb8. 4、Mtbl6. 3、 CFP10-ESAT6融合蛋白、MPT63-MPT70融合蛋白、16kDa_38kDa融合蛋白共20種或其中的幾種抗原溶液和質(zhì)控點以點陣的形式固化于尼龍膜片上，進行多人份裝配和封閉操作，再室溫干燥，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配制
配制濃度為0. 5摩爾每升的PB緩沖液，其中含有濃度為20%的水溶性色素(葡萄紫)；
3)封閉液的配制
封閉液的配方如下濃度為10 (w/v)%的BSA溶液、濃度為10 (w/v)%的蔗糖溶液、濃度為 10 (v/v)% 的 TWEEN-20.20 (ν/ν)的 proclin300、濃度為 0. 2 摩爾每升 pH 為 8 的 PB 緩沖液；
4)洗滌液的配制
洗滌液的配方如下10% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 2摩爾每升pH8的PB緩沖液、20 (ν/ ν)% 的 proclin300 ；
5)過氧化物辣根酶標記羊抗人IgG
①新鮮配制10.0毫克每毫升的HRP溶液；
②向HRP溶液中加入1.Oml新鮮配制的2. 0摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②制得的溶液裝入透析袋中，用10毫摩每升的pH為7的醋酸鈉緩沖液進行透析，6°C靜置或攪拌；
④向步驟③制得的溶液中加入100微升1.0摩爾每升的pH為10碳酸鹽緩沖液；
⑤向步驟④制得的溶液中加入10毫克的羊抗人IgG，室溫避光輕輕攪拌6小時；
⑥向步驟⑤制得的溶液中加1.0毫升新鮮配制的濃度為10毫克每毫升的NaBH4溶液混勻，6°C靜置6小時；
⑦將步驟⑥制得的溶液裝入透析袋中，用0.2摩爾每升pH為8的PBS溶液進行透析， 6°C，過夜。 ⑧將步驟⑦制得的透析液，在10000 rpm條件下離心去沉淀，上清液為含HRP-羊抗人IgG的結(jié)合物；
6)檢測液的配制
檢測液包括PH7的A液和pH7的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中, 濃度為0. 5 (v/v)%、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 2摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 1摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為1. 0毫克每毫升；
7)終止液的配制
配制濃度為10. 0 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
首先將檢測樣本加到蛋白芯片上，通過搖床溫育的方式，使樣本溶液中多種抗體與芯片載體上包被的對應(yīng)抗原探針進行特異性的反應(yīng)結(jié)合，然后將反應(yīng)完成的載體用洗滌液進行洗滌，以減少其它干擾物質(zhì)的非特性結(jié)合；接下來加入步驟5)制備好的HRP-羊抗人IgG 復(fù)合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-抗原-抗體-HRP-羊抗人IgG的復(fù)合物，再將反應(yīng)完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入TMB A液與B液的混合液以及終止液，完成整個芯片的反應(yīng)過程，最后棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成后通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統(tǒng)完成對顏色點陣的信號讀取后與檢測儀中設(shè)置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。
權(quán)利要求
1.一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，其特征在于它包括芯片反應(yīng)系統(tǒng)和顯色系統(tǒng)； 芯片反應(yīng)系統(tǒng)包括載體、反應(yīng)液和洗滌液；顯色系統(tǒng)包括檢測液和終止液；所述載體上包被有能與生物學指標特異性結(jié)合的探針點陣或質(zhì)控點；反應(yīng)液包括兩種，一種為能與生物學指標結(jié)合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈霉親和素的復(fù)合物；或者反應(yīng)液為過氧化物辣根酶標記的能與生物學指標相結(jié)合的物質(zhì)；終止液為0. 01 10. 0 (w/v) %的疊氮鈉溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述洗滌液的配方如下0. 1 10 (v/v)%的TWEEN-20、0. 01 0. 2摩爾每升pH6 8的PB緩沖液、 0. 1 20 (ν/ν)% 的 proclin300。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，其特征在于所述檢測液包括PH4 7的A液和pH2 7的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2A濃度為0. 005 0. 5 (v/v)%、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0.01 0.2摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0.01 0. 1摩爾每升，B液中 TMB-HCl的濃度為0. 01 1. 0毫克每毫升。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，其特征在于所述載體為孔徑在0. 1 12微米的多孔性微孔濾膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，其特征在于所述多孔性微孔濾膜為纖維素類微孔濾膜、尼龍類微孔濾膜或聚氟乙烯類微孔濾膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)，其特征在于所述載體為聚乙烯、聚苯乙烯、硅橡膠或玻璃材料制成的各種可用于生物學檢測的承載體。
7.一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)的使用方法，包括以下步驟1)蛋白反應(yīng)芯片的制作用點樣儀將一種或多種能與生物學指標結(jié)合的探針溶液或質(zhì)控點以點陣的形式固化于載體上，室溫干燥，2 8°C密封保存；2)點樣稀釋液的配制配制濃度為0. 01 0. 5摩爾每升的PB緩沖液，其中含有濃度為0. 01 20%的水溶性色素；3)封閉液的配制封閉液的配方如下濃度為1 10 (w/v) %的BSA溶液、濃度為1 10 (w/v) %的蔗糖溶液、濃度為0. 1 10 (ν/ν) %的TWEEN-20、0. 1 20 (ν/ν)的proclin300、濃度為 0. 01 0. 2摩爾每升pH為6 8的PB緩沖液；4)洗滌液的配制洗滌液的配方如下0. 1 10% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 01 0. 2摩爾每升pH6 8的 PB 緩沖液、0. 1 20 (ν/ν) % 的 proclin300 ；5)能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)的生物素標記①用無水DMSO配置1 20毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀酰亞胺酯溶液；②用濃度為0.01 0. 2摩爾每升pH6 9的硼酸鹽緩沖液為溶劑配制濃度至少為 0. 5 5毫克每升的能與生物學探針結(jié)合的物質(zhì)的溶液；③按10 200微克每毫克的比率將生物素酯加入上述能與生物學探針結(jié)合的物質(zhì)的溶液中，混合均勻后并在室溫下孵育1 h 他；④按每100 500微克生物素酯內(nèi)加入1 100微升的濃度為0.5 2. 0摩爾每升的氯化銨，室溫孵育5 60min ；⑤將經(jīng)過步驟③的能與生物學探針結(jié)合的物質(zhì)的溶液用0.01 0. 2摩爾每升的 PBS、CBS、醋酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液透析2 4 進行純化，或再用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)；6)鏈霉親和素或能與生物學探針結(jié)合的物質(zhì)與過氧化物辣根酶的復(fù)合物標記①新鮮配制1.0 10. 0毫克每毫升的HRP溶液；②向HRP溶液中加入0.1 1. Oml新鮮配制的0. 01 2. 0摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；③將步驟②制得的溶液裝入透析袋中，用1 10毫摩每升的pH為4 7的醋酸鈉緩沖液進行透析，2 6°C靜置或攪拌；④向步驟③制得的溶液中加入10 100微升0.1 1. 0摩爾每升的pH為7 10碳酸鹽緩沖液；⑤向步驟④制得的溶液中加入0.1 10毫克的鏈霉親和素或能與生物學探針結(jié)合的物質(zhì)，室溫避光輕輕攪拌1 6小時；⑥向步驟⑤制得的溶液中加0.1 1. 0毫升新鮮配制的濃度為1 10毫克每毫升的 NaBH 4溶液混勻，2 6°C靜置1 6小時；⑦將步驟⑥制得的溶液裝入透析袋中，用0.01 0. 2摩爾每升pH為6 8的PBS溶液進行透析，2 6°C，過夜；⑧將步驟⑦制得的透析液，在1000 10000rpm條件下離心去沉淀，上清液為含 HRP-鏈霉親和素或HRP-能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合物；7)檢測液的配制檢測液包括PH4 7的A液和pH2 7的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 005 0. 5 (ν/ν) %、 檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 01 0. 2摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 01 0. 1摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 01 1. 0毫克每毫升；8)終止液的配制配制濃度為0. 01 10. 0 (w/v) %的疊氮鈉溶液；具體操作如下首先將檢測樣本加到蛋白芯片上，通過搖床溫育的方式，使樣本溶液中多種生物學指標與芯片載體上包被的對應(yīng)探針進行特異性的反應(yīng)結(jié)合，然后將反應(yīng)完成的載體用洗滌液進行洗滌，以減少其它干擾物質(zhì)的非特性結(jié)合；接下來加入步驟5)制備的生物素標記好的能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)和步驟6)制備好的過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物或 HRP-能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-探針-生物學指標-步驟5)制備的生物素標記的能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)-鏈霉親和素-過氧化物辣根酶的復(fù)合物或載體-探針-生物學指標-能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)-過氧化物辣根酶的復(fù)合物，再將反應(yīng)完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入檢測液A液與B液的混合液以及終止液，完成整個芯片的反應(yīng)過程，最后棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成后通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統(tǒng)完成對顏色點陣的信號讀取后與檢測儀中設(shè)置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測；或首先將封閉液滴加蛋白芯片中，再將檢測樣本加入蛋白芯片中，使樣本溶液中的生物學指標與芯片載體上包被的對應(yīng)探針進行特異性的反應(yīng)結(jié)合，然后將反應(yīng)完成的膜面滴加洗滌液進行洗滌，以減少其它干擾物質(zhì)的非特性結(jié)合，接下來加入步驟5)制備的生物素標記好的能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)和步驟6)制備好的過氧化物辣根酶和鏈霉親和素的復(fù)合物或HRP-能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-探針-生物學指標-步驟5)制備的生物素標記的能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)-鏈霉親和素-過氧化物辣根酶的復(fù)合物或載體-探針-生物學指標-能與生物學探針結(jié)合物質(zhì)-過氧化物辣根酶的復(fù)合物，再將反應(yīng)完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入檢測液A液與B液的混合液以及終止液，完成整個芯片的反應(yīng)過程，最后棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成后通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統(tǒng)完成對顏色點陣的信號讀取后與檢測儀中設(shè)置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高靈敏度蛋白芯片檢測系統(tǒng)及其使用方法，屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域。它包括芯片反應(yīng)系統(tǒng)和顯色系統(tǒng)；芯片反應(yīng)系統(tǒng)包括載體、反應(yīng)液和洗滌液；顯色系統(tǒng)包括檢測液和終止液；所述載體上包被有能與生物學指標特異性結(jié)合的探針點陣或質(zhì)控點；反應(yīng)液包括兩種，一種為能與生物學指標結(jié)合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈霉親和素的復(fù)合物；或者反應(yīng)液為過氧化物辣根酶標記的能與生物學指標相結(jié)合的物質(zhì)；終止液為0.01～10.0(w/v)%的疊氮鈉溶液。本發(fā)明具有檢測速度快、靈敏度高的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/535GK102338801SQ20111022406
公開日2012年2月1日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者張燦 申請人:張燦