專利名稱：一種基于一次成型的組織芯片制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于一次成型的組織芯片制作方法，用于制備組織芯片，屬于組 織芯片技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
組織芯片(tissue chip)是生物芯片技術(shù)的一個(gè)重要分支，可以將數(shù)十個(gè)甚至上 千個(gè)不同個(gè)體的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)的順序排列在一張玻片進(jìn)行分析研究，進(jìn)行同一 指標(biāo)的原位組織學(xué)研究是一種高通量、多樣本的分析工具。組織芯片技術(shù)可以同時(shí)對(duì)幾百 甚至上千種組織樣本同時(shí)進(jìn)行分析，進(jìn)行某一個(gè)或多個(gè)特定的蛋白質(zhì)表達(dá)的研究。該技術(shù) 自1998年問(wèn)世以來(lái)，以其大規(guī)模、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)得到大范圍的推廣應(yīng)用。組織芯片 與基因芯片和蛋白質(zhì)芯片一起構(gòu)成了生物芯片系列，使人類第一次能夠有效利用成百上千 份組織標(biāo)本，在基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組三個(gè)水平上進(jìn)行研究，被譽(yù)為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域 的一次革命。組織芯片技術(shù)可以與其他很多常規(guī)技術(shù)如免疫組織化學(xué)(IHC)、核酸原位雜 交(ISH)、熒光原位雜交(FISH)、原位PCR等結(jié)合應(yīng)用，它的應(yīng)用領(lǐng)域正在不斷地拓展。作 為一項(xiàng)新興的生物學(xué)研究技術(shù)，對(duì)基因和蛋白質(zhì)與疾病關(guān)系的研究，疾病相關(guān)基因的驗(yàn)證、 新藥物的開(kāi)發(fā)與篩選、疾病的分子診斷，治療過(guò)程的追蹤和預(yù)后等方面具有實(shí)際意義和廣 闊的市場(chǎng)前景，組織芯片技術(shù)正以它絕對(duì)的優(yōu)越性展示著自己的潛力。
目前，美國(guó)Clontech等少數(shù)生物技術(shù)公司己開(kāi)展了人及動(dòng)物的組織芯片產(chǎn)品開(kāi) 發(fā)和銷售，但數(shù)量少、價(jià)格高、品種單一，滿足不了醫(yī)學(xué)科研和醫(yī)藥工業(yè)研發(fā)的需要。中國(guó)在 組織芯片技術(shù)方面的研究進(jìn)展迅速，中國(guó)國(guó)家科技部將組織芯片技術(shù)列為“十五”國(guó)家科技 攻關(guān)西部開(kāi)發(fā)重大項(xiàng)目，并己在西安正式立項(xiàng)。該立項(xiàng)分成7個(gè)子項(xiàng)目，包括組織芯片技 術(shù)、組織芯片生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)、自動(dòng)化組織芯片儀、自動(dòng)分析裝置、組織芯片相關(guān)技術(shù)與試 劑、組織芯片實(shí)際應(yīng)用技術(shù)，為中國(guó)與世界相關(guān)技術(shù)同步發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
目前，在組織芯片的制作過(guò)程中，需要制備空白受體蠟塊和組織供體蠟塊。組織芯 片的制備主要依靠機(jī)械化芯片制備儀來(lái)完成。制備儀包括操作平臺(tái)、特殊的打孔采樣裝置 和一個(gè)定位系統(tǒng)。打孔采樣裝置對(duì)供體組織蠟塊進(jìn)行采樣，同時(shí)也可對(duì)受體蠟塊進(jìn)行打孔， 其孔徑與采樣直徑相同，兩者均可精確定位。制備儀的定位裝置可使穿刺針或受體蠟塊線 性移動(dòng)，從而制備出孔徑、孔距、孔深完全相同的組織微陣列蠟塊。通過(guò)切片輔助系統(tǒng)將其 轉(zhuǎn)移并固定到硅化和膠化玻片上即成為組織芯片。根據(jù)樣本直徑(O. 2-2. O mm)不同，在 一張45 mm X 25。的玻片上可以排列40-2000個(gè)以上的組織標(biāo)本。常用組織芯片含有組織 標(biāo)本的數(shù)目在50-800個(gè)之間。根據(jù)研究目的不同，芯片種類可以分成腫瘤組織芯片、正常 組織芯片、單一或復(fù)合、特定病理類型等數(shù)10種組織芯片。
但是，依據(jù)上述方法制備組織芯片有以下不足第一，現(xiàn)有組織芯片制作成本很 高。除特殊的儀器設(shè)備外(數(shù)十萬(wàn)元)，制作I個(gè)組織芯片的費(fèi)用在萬(wàn)元以上，每張切片單 價(jià)在50-100元；第二，僅能在己有的蠟塊上取樣，組織芯片制備受到限制；第三，根據(jù)現(xiàn)有 設(shè)備和方法制備的芯片，切片量?jī)H約50張，因?yàn)槭窃谠邢瀴K上點(diǎn)孔取樣，組織厚度有限；第四，高密度芯片雖然通量大，但由于每枚組織微小，難以提供組織結(jié)構(gòu)的信息；第五，僅在 大型研究單位，才有經(jīng)費(fèi)和條件進(jìn)行組織芯片的相關(guān)研究，難以推廣。
為解決以上問(wèn)題，很多石蠟組織芯片的制作方法涌現(xiàn)出來(lái)。中國(guó)專利ZL02292521 公開(kāi)了 一種制備組織芯片空心蠟?zāi)５哪＞?，采用多孔板和芯柱結(jié)構(gòu)。中國(guó)專利CN 101556224A提供了一種石蠟組織芯片制作方法，將待包埋的組織在融化的石蠟中浸沒(méi)后排 列在蠟?zāi)?nèi)部的一側(cè)，融化的石蠟沿空位處倒入蠟?zāi)?nèi)，直至將組織浸沒(méi)，使石蠟聚合，撤 除蠟?zāi)?。但是，這些模具在澆注蠟?zāi)毯螅局灰兹〕?，容易破壞蠟?zāi)＃斐筛骺酌袒虺?裂，芯柱的長(zhǎng)短不好控制，打孔深度不易精確控制，容易造成蠟?zāi)Ｉ系目壮霈F(xiàn)通孔，為放入 供體組織以及試驗(yàn)過(guò)程造成了困難。同時(shí)這些方法都需要制備空白受體蠟塊和組織供體蠟 塊。
因此，為了克服存在的問(wèn)題，我們提出一種制作石蠟組織芯片的方法，該方法的特 點(diǎn)在于不需要制作受體蠟塊，能夠?qū)崿F(xiàn)石蠟組織芯片的一次成型，并且在制作過(guò)程中不會(huì) 對(duì)成品蠟塊造成損壞，保證在蠟塊均勻，不會(huì)出現(xiàn)毛刺或澈裂，組織定位的深度和精確度容 易控制，從而能夠保證蠟塊的制作質(zhì)量，避免一邊打孔，一邊放入供體組織，在省時(shí)省力的 同時(shí)，提高了工作效率。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)易制作組織芯片的方法，制備低密度和大距離芯片， 兼顧樣本的通量、組織結(jié)構(gòu)和芯片產(chǎn)量等多方面的要求，使組織芯片技術(shù)的作用得到充分 發(fā)揮。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種石蠟組織芯片制作方法，其特 征在于不需要制備供體石蠟和受體石蠟組織塊，組織芯片制備一次成型完成，具體步驟 為第一步將所需要包埋的組織編號(hào)后脫水和浸蠟備用，如果是已有的蠟塊，則標(biāo)記所需 要的組織后編號(hào)；將組織切成所需大??；用電爐使石蠟加熱至60 — 65°C融化；第二步取芯片陣列孔板和包埋管，裝配成鑄?？颍瑢⒔M織按照所需要的大小和切面 放入包埋管中，放置在平板玻璃上，再取包埋框，組合形成組織芯片包埋整體框架，倒入 60-65°C包埋石蠟，在18-25°C靜置10_30min使石蠟聚合成型，然后，去除包埋管周圍的石 蠟，完成第一次包埋成型；第三步取第一步得到的具有包埋組織的鑄模框放置在平板玻璃上，的包埋框中；再 取包埋框，組合形成組織芯片包埋整體框架，倒入60-65°C包埋石蠟，在18-25°C靜置，等待 鑄?？虬窆苤械氖炁c包埋框中的石蠟融合后，向上撤除包埋管，包埋組織冷卻后沿平 行于玻璃板方向切片。
本發(fā)明利用石蠟受熱易溶解、易聚合的特性，先使用包埋管下端的小窗孔讓石蠟 進(jìn)入包埋管中的組織，完成第一次包埋，使組織成型。在第二次包埋中，由于包埋框中的石 蠟溫度高于包埋管中的溫度，通過(guò)包埋管的金屬傳熱作用，使包埋管中的石蠟融化，然后， 向上撤除組織芯片包埋管，留下包埋組織，得到所需要的組織芯片蠟塊。本發(fā)明嚴(yán)格控制組織的位置和包埋的精確度，不會(huì)出現(xiàn)打孔時(shí)的毛刺或歇裂。因此具 有廉價(jià)、方便、高效、省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)，能普及至每一個(gè)病理科及相關(guān)研究單位。制作的組織芯片，組織形狀不受限制，可為長(zhǎng)條形，長(zhǎng)方形，方形，圓柱形，圓筒形或不規(guī)則形；組織大小 可根據(jù)需要而定，在50mmX 25mm的面積上可排列20-300個(gè)組織，能滿足研究需要。組織芯 片的高度也可根據(jù)需要而定，在5mm-20mm厚的組織芯片上可切制500張一2000張切片，遠(yuǎn) 高于現(xiàn)有組織芯片切制50張切片的產(chǎn)量，約為10-40倍；成本遠(yuǎn)低于現(xiàn)有制作方法。


圖1是本發(fā)明所提供的組織芯片包埋框架整體結(jié)構(gòu)示意圖。其中1為包埋框，2 為鑄?？?。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明。
1、準(zhǔn)備制作組織芯片的鑄?？蚝桶窨蛉鐖D1所示，為組織芯片鑄模框示意圖，鑄模框由芯片陣列孔板和包埋管組成。鑄模框 架的四周有支架，通過(guò)螺帽來(lái)控制位置的高低。組織芯片的包埋框由2個(gè)垂直彎折的銅條 組成，長(zhǎng)為70mm,寬為40mm,高為20mm,可以自由分合組裝成為不同內(nèi)經(jīng)的長(zhǎng)方形。
2、組織取樣對(duì)照需要制備的組織，找出并標(biāo)記目的組織區(qū)域，根據(jù)目的區(qū)域大小，選用合適寬度的 平口刀，沿標(biāo)記線，垂直向下切，得到與包埋管口徑大小相當(dāng)?shù)慕M織塊。
3、包埋前準(zhǔn)備將組織切成所需大小，對(duì)其進(jìn)行組織編號(hào)，脫水和浸蠟備用，用電爐使石蠟加熱至60 一 65°C融化；如果是已有的蠟塊，則標(biāo)記所需要的組織后編號(hào)，將組織切成所需大小，放在 燙臺(tái)上，在60-65°C將其上的石蠟融化得到待包埋的組織。
4、用包埋管實(shí)施第一次包埋取芯片陣列孔板和包埋管，裝配成鑄?？颍瑢⒔M織按照所需要的大小和切面放入包 埋管中，放置在平板玻璃上，再取包埋框，組合形成組織芯片包埋整體框架(見(jiàn)圖1)，倒入 60-65°C包埋石蠟，在18-25°C靜置10_30min使石蠟聚合成型，然后，去除包埋管周圍的石 蠟，完成第一次包埋成型。
4、用包埋框整體包埋組織取第一步得到的具有包埋組織的鑄模框放置在平板玻璃上，的包埋框中；再取包埋框， 組合形成組織芯片包埋整體框架，倒入60-65°C包埋石蠟，在18-25°C靜置，等待鑄?？虬?埋管中的石蠟與包埋框中的石蠟融合后，向上撤除包埋管，包埋組織冷卻后沿平行于玻璃 板方向切片。
權(quán)利要求
1.一種基于一次成型的組織芯片制作方法，其特征性的具體步驟為第一步將所需要包埋的組織編號(hào)后脫水和浸蠟備用，如果是已有的蠟塊，則標(biāo)記所需要的組織后編號(hào)；將組織切成所需大?。挥秒姞t使石蠟加熱至60 — 65°C融化；第二步取鑄?？?，將組織按照所需要的大小和切面放入鑄?？虻陌窆苤?，倒入60 一 65°C石蠟包埋，在18-25°C靜置10-30min使石蠟聚合成型，第一次包埋成型；第三步取石蠟包埋框，將第二步得到的具有包埋組織的鑄?？蚍胖迷谄桨宀Ａ系陌窨蛑?，將融化的石蠟倒入石蠟包埋框，在60-65°C靜置3-5min，等待鑄?？蚩坠苤械氖炁c包埋框中的石蠟融合后，撤除包埋框和包埋管，包埋組織冷卻后沿平行于玻璃板方向切片。
2.如權(quán)利要求1所述的一種基于一次成型的組織芯片制作方法，其特征在于，是一種大間距組織芯片制作方法，在孔板上分布有多個(gè)來(lái)源于相同組織的小組織樣本，構(gòu)成不同規(guī)格的微陣列，如4行X8列，4行X5列等，每行中相鄰小組織樣本之間的間距為2-4毫米， 組織為方體狀或圓柱體狀。
3.如權(quán)利要求1所述的大間距組織芯片制作方法，其特征在于不需要制備供體石蠟和受體石蠟組織塊，組織芯片制備一次成型完成，其方法是取鑄?？蚝桶窆埽瑢⒔M織按照所需要的大小和切面放入鑄?？虻陌窆苤校瑢㈣T?？蚍胖萌氚窨蛑校谷氚袷?，讓石蠟通過(guò)包埋金屬管下端的小窗孔浸潤(rùn)進(jìn)入包埋管，靜置一段時(shí)間后，完成組織在包埋管中的聚合成型。
4.如權(quán)利要求1所述的一種基于一次成型的組織芯片制作方法，其方法特征在于，在完成第一次包埋成型后，第二步，取石蠟包埋框，將融化的石蠟倒入放置在玻璃板上的石蠟包埋框，將第一步得到的具有包埋組織的鑄?？蚍胖迷诎窨虻氖炛薪](méi)融化，使鑄?？蚩坠苤械氖炁c包埋框中的石蠟融合，撤除包埋框，包埋組織冷卻后沿平行于玻璃板方向切片。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于一次成型的組織芯片制作方法，其特征在于組織芯片制備一次成型，不需要制備供體石蠟和受體石蠟組織塊。具體步驟為首先取鑄模框，將組織按照所需要的大小和切面放入鑄?？虻陌窆苤?，倒入石蠟包埋，靜置一段時(shí)間，使石蠟聚合成型。然后，再取石蠟包埋框，將第一步得到的具有包埋組織的鑄?？蚍胖迷谄桨宀Ａ系陌窨蛑校瑢⑷诨氖灥谷胧灠窨?，等待鑄模框孔管中的石蠟與包埋框中的石蠟融化后，撤除包埋框，完成組織包埋。本發(fā)明嚴(yán)格控制組織的位置和包埋的精確度，不會(huì)出現(xiàn)打孔時(shí)的毛刺或歇裂，因此，具有廉價(jià)、方便、高效和省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)，能普及至每一個(gè)病理科及相關(guān)研究單位。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102998153SQ20111026937
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月13日
發(fā)明者饒瑩 申請(qǐng)人:饒瑩