專利名稱：便潛血檢查方法
技術領域：
本發(fā)明涉及便潛血檢查方法。更詳細地說，本發(fā)明涉及的便潛血檢查方法其特征在于，測定便潛血標志物時補正因采便量的個體差異而造成的便潛血標志物的變化。另外，本發(fā)明涉及便潛血的臨床檢查中所應用的手段及裝置。
上述情況下，便潛血的檢查是以血紅蛋白或運鐵蛋白為標志進行的。但要精確地采取一定量的糞便是這類檢查中最大的問題?，F(xiàn)在人們對市場上出售的采便容器采取了各種辦法，盡力使之能采集一定量的糞便，但是糞便質量的個人差異、每天的差異很大，其含水率等不等，未必能進行準確采便。結果，存在的問題是便潛血的檢查值產(chǎn)生變動，得不到高精確度的檢查值。本發(fā)明的課題是提供與糞便的取樣精度無關、可精確地進行便潛血檢查的方法。
于是采集各種糞便，將其中一部分加熱干燥，通過測定干燥前后的重量測定各糞便的含水率。另外，將同一糞便均一分散到適當?shù)木彌_液或者水中，對其上清中的各種常在物質(固有物質)在單位重量糞便中的濃度進行定量。結果發(fā)現(xiàn)，由于測定的各種常在物質的濃度均與所采集糞便的含水率呈負相關，所以所測定的糞便中常在物質的濃度反映了糞便的干重。
另外，本發(fā)明者們著眼于將采集的糞便懸浮到一定量的水中時，通過光學法測定所得信號與采取的糞便的含水率之間的關系，發(fā)現(xiàn)二者有相關性。
于是，本發(fā)明者們反復進行了刻苦研究，結果發(fā)現(xiàn)，常在于糞便中的物質或者被檢糞便懸濁液的由光學測定所得的信號成為可補正被檢糞便量的指標，結合用作便潛血標志的血紅蛋白和/或運鐵蛋白的測定，測定可作為該指標的物質或光學法測定所得的信號，通過比較換算血紅蛋白和/或運鐵蛋白的測定值，可以進行與糞取樣精度無關、但精確度良好的便潛血檢查。由此，本發(fā)明者們完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明由以下內容構成1.糞便中便潛血的檢查方法，其特征在于，糞便中便潛血的檢查方法中，進行便潛血標志物的測定時，用能補正采集的被檢糞便量的指標作為比較對照。
2.上述1記載的便潛血檢查方法，其特征在于，其中補正被檢糞便量的指標至少包含被檢糞便中的常在物質或由光學法測定被檢糞便懸濁液所得的信號中的任何一種。
3.上述2記載的糞便中便潛血檢查方法，其中常在物質是選自天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酸、淀粉酶、亮氨酸氨肽酶、無機磷、鎂、尿膽素、尿膽原、直接膽紅素、總膽紅素、糞便抗原(NFA)、鐵、CEA、IgA、吲哚、甲基吲哚、氨基酸、無機鹽、肽、糖類、肝素、粘多糖類、總蛋白質中的至少1種成分。
4.上述3記載的糞便中便潛血的檢查方法，其中常在物質至少為尿膽素、尿膽原、總膽紅素、糞便抗原(NFA)、CEA、IgA中的一種成分。
5.上述1-4中任一項記載的糞便中便潛血的檢查方法，其中便潛血標志物至少包含血紅蛋白或運鐵蛋白中的任何一種。
6.確定便潛血標志物數(shù)值的意義的手段，其特征在于，它至少要組合應用以下兩種手段測定便潛血標志物的手段；以及，以能補正所采被檢便的量的指標的測定結果為基礎，換算便潛血標志物量的手段。
7.上述6記載的確定便潛血標志物數(shù)值意義的手段，其特征在于，其中能補正被檢糞便的量的指標至少包含被檢糞便中的常在物質或用光學法測定被檢糞便懸濁液所得的信號的任一種。
8.一種裝置，它至少支持上述6或7中所述的確定便潛血標志物數(shù)值意義的手段。
圖2表示糞便量補正前后血紅蛋白濃度的波動度。
圖3說明免疫色譜用的測定裝置。圖中1為滴加樣品的部分，2為用抗血紅蛋白抗體或抗CEA抗體標記的著色乳膠混合物保持部位，3為硝酸纖維素膜，4為抗血紅蛋白抗體固定帶，5為抗CEA抗體固定帶，6表示吸收墊。
血紅蛋白或運鐵蛋白的測定方法沒有特殊限制，一般采用免疫學法測定。眾所周知的方法有使吸附了對被檢物質特異的抗體的乳膠粒與待檢物反應，通過目測或光學法，測定所產(chǎn)生粒子的凝集的方法；用金屬膠體粒代替乳膠粒，用光學法測定凝集反應的方法；還有應用金屬膠體?；蛑槟z粒標記抗體，通過免疫色譜法進行測定的方法。
本發(fā)明中補正被檢糞便的量的指標是指能反映糞便干重的指標，應用該指標可以補正采集的糞便的量。例如糞便中存在各種常在物質，這些常在物質的測定值反映了采集的糞便的干重，可以補正便量。
本發(fā)明中所說的糞便中的常在物質包括，例如天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、淀粉酶、亮氨酸氨肽酶、無機磷、鎂、尿膽素、尿膽原、直接膽紅素、總膽紅素、糞便抗原(NFA)、鐵、CEA、IgA、吲哚、甲基吲哚、氨基酸、無機鹽、肽、糖類、肝素、粘多糖類、總蛋白質等。除了這些成分以外糞便中若還有以一定量存在的常在物質，其測定值可作為將采集的糞便量換算為一定糞便量的指標。這些常在物質既可單獨應用也可多個聯(lián)合應用。多個指標聯(lián)合應用可以更準確地進行便潛血的檢查。
為了使測定更加簡便，優(yōu)選的常在物質是可用測定便潛血標志物血紅蛋白和/或運鐵蛋白(以下僅稱作“便潛血標志物”)的體系來測定的常在物質。適用于這種測定體系的常在物質有，如尿膽素、尿膽原、膽紅素、糞便抗原(CFA)、CEA、IgA。
常在物質的測定時，可將其看作對象物質，應用固有的眾所周知的測定方法進行測定。
便潛血標志物的測定和常在物質的測定也可應用同一機器或裝置進行。例如，利用乳膠凝集反應，用光學法測定血紅蛋白和/或運鐵蛋白時，也可選擇光學測定法進行常在物質的測定。
另一方面，也可以對用與便潛血標志物的測定原理完全不同的原理所得的測定值進行比較，例如對乳膠凝集法和傳導率或離子選擇電極法的組合應用所得的各測定值進行比較。
也可以利用用光學方法測定糞便懸濁液所得的信號，或測定糞便懸濁液與糞便中的便潛血檢查試劑混合液所得的信號作為補正被檢糞便量的指標。本發(fā)明中所說的用光學法測定所得的信號有吸光度、透過率、反射、散射、熒光等例子，優(yōu)選的有吸光度。例如可在各種波長下測定吸光度，優(yōu)選在波長為200～800nm下、更優(yōu)選在340nm～600nm的波長下所測得的吸光度。另外也可利用由多種波長進行測定所得的吸光度，此外，該信號也可以是由這些測定值演算而得到的。
結合便潛血標志物的測定，同時測定糞便中的常在物質和/或糞便中常在的物質的至少一種，或者測定用光學方法測定糞便懸濁液而得的信號，將其中一種測定值或多種測定值作為補正被檢糞便量的指標，通過換算便潛血標志物的量可進行與糞便的采集精度無關的精確度良好的便潛血檢查。
本發(fā)明通過至少組合應用以下兩種手段即測定便潛血標志物的手段；以及，以能將所取被檢糞便量換算成一定糞便量的指標為基礎，將便潛血標志物的測定值換算成單位糞便量中的便潛血標志物測定值的手段，即可確定便潛血標志物測定值的意義。
作為由常在物質的測定值計算便潛血標志物換算值的手段沒有特別限制，只要以常在物質以一定量存在于糞便中為前提進行換算即可。本發(fā)明提供了一種方法，該方法通過計算便潛血標志物相對于常在物質的存在比來檢查糞便中的便潛血。
另外，作為由光學方法測定糞便懸濁液所得的信號而得到便潛血標志物換算值的手段沒有特別限制，只要以一定糞便中能產(chǎn)生一定量的上述信號為前提進行換算即可。本發(fā)明還提供一種方法，該方法通過計算與上述信號相對應的便潛血標志物的存在比來檢查糞便中的便潛血。
此外，本發(fā)明提供這樣的裝置，它至少支持上述測定便潛血標志物的手段，和測定能補正被檢糞便量的指標的手段，以及以該指標為基礎換算便潛血標志物量的手段。作為本發(fā)明裝置的一種結構，可利用常規(guī)臨床檢查中所應用的自動分析裝置，例如提供這樣的自動分析裝置該自動分析裝置支持以糞便中常在物質的測定結果為基礎換算便潛血標志物量的手段，從測定開始到獲得換算結果均自動進行。
以下使用CEA作為常在物質的實例進行更具體的說明。
使吸附了抗CEA抗體的乳膠粒與待檢體反應，用通常使用的自動分析裝置，通過光學法測定乳膠凝集反應來測定CEA的濃度。用相同的自動分析裝置，應用吸附了抗血紅蛋白抗體的乳膠同樣通過光學法測定來測定血紅蛋白的濃度。測定運鐵蛋白時，同樣可應用吸附了抗運鐵蛋白抗體的乳膠進行測定。
另外，也可以設計成以免疫色譜法原理為基礎，在同一裝置內能測定血紅蛋白、運鐵蛋白和CEA的方案。以血紅蛋白和CEA為例說明免疫色譜法的更具體實施方案。
使著色乳膠?；蚰z體金類的金屬膠體或無機非金屬膠體等吸附抗血紅蛋白抗體，制備抗血紅蛋白抗體標記粒子。另外，使同種的微粒子或不同種類的粒子吸附抗CEA抗體，與血紅蛋白同樣地制備抗CEA抗體標記的粒子。
以適當比例的量將各種制備的標記粒子混合，必要時可通過適當?shù)亩嗫仔灾С治飦肀３衷摿Ｗ印４藭r可與牛血清白蛋白、明膠或酪蛋白等載體蛋白共存。另外，這些標記粒子可與支持物一起以干燥狀態(tài)提供。免疫色譜的支持物可采用有適當孔徑的膜和玻璃濾紙等。
將用于捕獲標記粒子的抗體固定到支持物的適當位置，該例中將抗血紅蛋白抗體和抗CEA抗體成行狀固定到免疫色譜支持物的適當?shù)闹虚g位置。將保持標記粒子的支持物設置在免疫色譜支持物一邊的端側，將待檢樣品液直接或間接供給該標記粒子支持物，標記粒子與被檢樣品中的血紅蛋白和CEA發(fā)生免疫學反應。反應后的標記粒子象層析一樣在免疫色譜支持物上移動，與捕獲抗體反應。用光學法測定反應后出現(xiàn)的反應條帶的強度。
應用著色乳膠粒子作標記粒子時可用可見光測定；用熒光粒子時可用熒光進行測定；用發(fā)光標記時用發(fā)光測定；所應用的標記粒子沒有特殊限制，只要能檢測出目的信號即可。也可應用測定波長不同的2種以上的粒子。
其它常在物質尿膽素、CEA、IgA、肽等的測定方法是測定OD280nm。無機鹽的測定是應用傳導計，以已知濃度的NaCl溶液，以NaCl的相當量求出對象中總無機鹽濃度。
(實驗例1-1)將40例樣品在-80℃冷凍2小時后，用減壓泵在干燥器內減壓干燥，精確稱出干燥后的重量。用干燥前后的重量差除以干燥前的重量，求出各糞便的含水率。結果如表1所示。
表1

(實驗例1-2)加水使40例糞便的濃度分別達0.1g/ml，2～8℃下靜置一晝夜后混懸均勻，2500rpm離心20分鐘，回將上清。用5μm和1.2μm的膜濾器過濾，得到糞便抽提液。測定各糞便抽提液中的各種成分及其在各波長下的吸光度，探討可用于便量補正的指標。
結果表明天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、淀粉酶、亮氨酸氨肽酶、無機磷、鎂、鐵、IgA、CEA、直接膽紅素、總膽紅素和吸光度的測定值與含水率呈負相關，該測定值可用作將被檢糞便量換算成一定糞便量的指標。其中總膽紅素及吸光度與含水率的相關系數(shù)為0.64～0.76，更為適用。以這些指標為例，它們在波長400nm和550nm的吸光度與含水率的相關圖示于

圖1中。(實驗例1-3)用10例的糞便，求出被檢糞便的吸光度與便濃度間的關系式。分別將各便濃度調成1、5、10和17.5mg/dL，各便取100μl溶液與1mL的20mM的磷酸緩沖液(pH＝6.8)混合，測定波長450nm處的吸光度(A)。
結果得到便濃度(C)與吸光度(A)的關系式為A＝0.0188C+0.0022，吸光度與便濃度的關系為一次方程式。由此可以判斷，通過測定吸光度可以進行便量補正。(實施例2)用便潛血陽性3例，用市售的采便容器內(國際試藥社制)分別對各例糞便各采集10次。應用便潛血測定試劑盒(シマ研究所)，按照其使用說明書，通過乳膠比濁法測定各樣品的血紅蛋白濃度。
結果分別為243～512、52～154、857～1997ng/ml。另一方面，以波長450nm的吸光度為基礎，應用實驗例1-3中求出的關系式，補正血紅蛋白濃度，其值分別為134～155、59-90、314～641ng/ml，減小了因采便所造成的誤差。結果如圖2所示。(實施例3)(實驗例3-1)將便潛血陽性患者的糞便混和均勻，用市售的采便容器從10個位置采便，該容器設計成可用2mL緩沖液將10mg的采便量進行稀釋。應用可吸附2種抗人血紅蛋白抗體(單抗)的乳膠試劑，分別測定所采便樣的血紅蛋白(Hb)濃度。同時應用市售的CEA測定EIA試劑盒(國際試藥株式會社)測定CEA。
以所得測定值為基礎求出Hb濃度的平均值、最大值-最小值和變動系數(shù)。求出各Hb測定值與CEA值的比，分別求出平均值、最大值-最小值和變動系數(shù)，結果如表2所示。此外，便潛血陰性者的Hb量(ng/ml)和CEA量(μg/ml)分別為40-3、2.25-0.48，其比較值為10-30。
表2Hb和CEA的測定值

結果，單獨測定血紅蛋白時，即便測定同一例糞便，變動系數(shù)約為50％左右，顯示出非常大的變動，與此相對，以常在物質CEA為指標求出血紅蛋白與CEA的比值，變動系數(shù)達到10％以下，測定精度大幅上升。
(實驗例3-2)如圖3所示，在免疫色譜中應用的硝酸纖維素膜濾器(孔徑0.8μm)上設置抗人血紅蛋白抗體固定帶和抗CEA抗體固定帶，再設置保持抗血紅蛋白抗體標記的著色乳膠(紅色)和抗CEA抗體標記的著色乳膠(藍色)混合物的部位，制成免疫色譜用的檢測裝置。
取約200μl在實驗例3-1中采集的糞便懸濁液滴到該檢測裝置上，反應10分鐘后，通過反射光的測定來測定血紅蛋白墊和CEA墊的光學強度，求出其強度比。結果如表3所示。
結果表明單獨測定Hb時變動系數(shù)為52.8％，但通過求其與CEA的比值，變動系數(shù)為11.4％，大幅度增加了測定精度。
表3用免疫色譜法測定Hb和CEA的結果

工業(yè)上利用的可能性以上結果表明，進行便潛血標去物的測定時，通過能補正所采集被檢糞便量的指標來補正糞便量，可以進行與糞便的采取精確度無關的、精確度良好的便潛血檢查。
權利要求
1.一種糞便中便潛血的檢查方法，其特征在于，在糞便中便潛血的檢查方法中，進行便潛血標志物的測定時，用能補正所采集的被檢糞便的量的指標作為比較對照。
2.權利要求1所述的便潛血檢查方法，其特征在于，能補正被檢糞便的量的指標至少包含被檢糞便中的常在物質、或通過光學法測定被檢糞便懸濁液所得的信號的任何一種。
3.權利要求2所述的糞便中便潛血的檢查方法，其中，常在物質是選自天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、淀粉酶、亮氨酸氨基肽酶、無機磷、鎂、尿膽素、尿膽原、直接膽紅素、總膽紅素、糞便抗原(NFA)、鐵、CEA、IgA、吲哚、甲基吲哚、氨基酸、無機鹽、肽、糖類、肝素、粘多糖類、總蛋白質的至少一種成分。
4.權利要求3所述的糞便中便潛血的檢查方法，其中，常在物質至少是尿膽素、尿膽原、總膽紅素、糞便抗原(NFA)、CEA、IgA中的一種成分。
5.權利要求1～4中的任一項所述的糞便中便潛血的檢查方法，其中便潛血標志物至少包含血紅蛋白或運鐵蛋白的任一種。
6.一種確定便潛血標志物數(shù)值的意義的手段，其特征在于，它至少組合了測定便潛血標志物的手段、以及以能補正所采集的被檢糞便的量的指標的測定結果為基礎換算便潛血標志物量的手段。
7.權利要求6所述的確定便潛血標志物數(shù)值的意義的手段，其特征在于，能補正被檢糞便量的指標至少包含被檢糞便中的常在物質或用光學法測定被檢糞便懸濁液所得的信號的任一種。
8.一種裝置，它至少支持權利要求6或7中所述的便潛血標志物數(shù)值的意義的確定手段。
全文摘要
提供與糞便的采集精確度無關的，可以進行精確度良好的便潛血檢查的方法。測定便潛血標志物血紅蛋白和/或運鐵蛋白時，通過應用能補正所采集的被檢糞便量的指標而補正糞便量來完成上述課題。也就是說，結合便潛血標志物的測定，測定作為上述指標的被檢糞便中常在物質的量，和/或用光學法測定被檢糞便懸濁液所得的信號，通過對照該指標的測定值，換算便潛血標志物的測定值即完成本課題。
文檔編號G01N33/72GK1401077SQ01805174
公開日2003年3月5日 申請日期2001年2月13日 優(yōu)先權日2000年2月16日
發(fā)明者上村八尋, 日裹久英, 永松剛, 落合浩二 申請人:國際試藥株式會社