專利名稱：一種乙型肝炎病毒表面抗原的檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎表面抗原HBsAg的檢測(cè)試劑及其檢測(cè)HBsAg的方法，特別涉及一種水溶性A3B型金屬卟啉標(biāo)記乙型肝炎表面抗體HBsAb作為HBsAg的檢測(cè)試劑及其檢測(cè)HBsAg的方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎(乙肝)病毒感染是一個(gè)全球性的問題，并且嚴(yán)重威脅到人類的健康，乙肝病毒是引起急慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的重要致病因素。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) —直是乙肝病毒感染的檢測(cè)中最為重要的標(biāo)記物，是乙肝的早期診斷指標(biāo)之一。目前國內(nèi)最常用的HBsAg測(cè)定方法有膠體金免疫層析法(GICA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)前者具有快速方便的優(yōu)點(diǎn)，更適用于醫(yī)療衛(wèi)生單位和血站、出入境檢驗(yàn)檢疫部門用于HBsAg的現(xiàn)場(chǎng)初篩，以節(jié)約時(shí)間和降低成本，但不適合日常門診住院患者的檢測(cè)，更不適合血站實(shí)驗(yàn)室內(nèi)HBsiVg的檢查，因?yàn)槠湓诘蜐舛葧r(shí)常發(fā)生漏檢；后者測(cè)定HBsiVg常用的是雙抗體夾心法，該法分為一步法和二分法一步法簡(jiǎn)單、方便、快速，靈敏度較高，特異性較好，但在臨床實(shí)踐中常會(huì)出現(xiàn)一些假陽性或假陰性結(jié)果，以及時(shí)陰時(shí)陽現(xiàn)象，給診斷帶來嚴(yán)重的影響；兩步法雖然靈敏度沒有一步法高，檢測(cè)速度也沒一步法快，但是其反應(yīng)卻更為穩(wěn)定，重復(fù)性也更好，兩步法更適用于醫(yī)院住院、門診患者和獻(xiàn)血員的血清HBsAg檢測(cè)，是目前醫(yī)院和血站實(shí)驗(yàn)室的最佳選擇。ELISA試劑具有靈敏度高、成本低、可大規(guī)模操作等優(yōu)點(diǎn)， 是目前免疫市場(chǎng)的主流，但其高分子量所帶來的非特異吸附本底信號(hào)會(huì)降低其特異檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)還具有標(biāo)記率低、穩(wěn)定性差、與生物分子耦合方法復(fù)雜、純化困難等缺點(diǎn)。卟啉類化合物是生物體系中廣泛存在的一類多種酶活性中心，其在生物體系中具有重要的生物功能，如氧化還原、電子傳遞，光合成及烴氧化等。卟啉類化合物對(duì)光具有高穩(wěn)定性，對(duì)可見光的高消光系數(shù)及獨(dú)特的激發(fā)態(tài)特性，使它們成為光電化學(xué)應(yīng)用中的首選材料。1982年，Uarlyama等以氯化血紅素代替辣根過氧化酶(HR)，用碳二亞胺法將其標(biāo)記在人體血清白蛋白(HSA)上，結(jié)合固體酶免疫分析技術(shù)，對(duì)HSA的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)試進(jìn)行了初步探討。他們這一開創(chuàng)性的研究，為金屬卟啉在酶免疫分析中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 1984年，Hara等將鐵卟啉配合物標(biāo)記于HSA抗體上用于檢測(cè)HSA，并將這一體系應(yīng)用于分析化學(xué)中，該體系是構(gòu)建在流動(dòng)注射分析設(shè)備上的，不利于應(yīng)用到醫(yī)學(xué)診斷及環(huán)境監(jiān)測(cè)等。 1992年，Adam等對(duì)鐵卟啉和錳卟啉的催化機(jī)理進(jìn)行的研究，并與辣根過氧化酶的催化發(fā)光效應(yīng)進(jìn)行了比較。1993年和1994年，Motsenbocker等用光敏劑和金屬卟啉標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)。在國內(nèi)，慈云祥、孫淑聲等課題組對(duì)于金屬卟啉催化劑替代辣根過氧化酶催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)也進(jìn)行了一些探索。目前，沒有將金屬卟啉配合物作為標(biāo)記物檢測(cè)HBsAg的研究及報(bào)道。本發(fā)明結(jié)合ELISA技術(shù)，首次提出采用水溶性々IBB型金屬卟啉配合物作為標(biāo)記物構(gòu)建化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)HBsAg的方法，該方法集合了化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)及酶標(biāo)方法的優(yōu)點(diǎn)，克服了酶標(biāo)方法高非特異吸附本底信號(hào)及低標(biāo)記率的缺陷，簡(jiǎn)便、快速，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化， 不僅具有免疫反應(yīng)的特異性、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏性，而且還具有化學(xué)標(biāo)記物的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種水溶性A3B型金屬卟啉標(biāo)記乙型肝炎表面抗體HBsAb檢測(cè) HBsAg的方法，該方法集合了化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)及酶標(biāo)方法的優(yōu)點(diǎn)，克服了酶標(biāo)方法高非特異吸附本底信號(hào)及低標(biāo)記率的缺陷。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的檢測(cè)試劑，所述的檢測(cè)試劑是以水溶性A3B 型金屬卟啉標(biāo)記乙肝病毒表面抗體HBsAb得到的的金屬卟啉標(biāo)記HBsAb，所述的水溶性A3B 型金屬卟啉如式(I)所示
權(quán)利要求
1. 一種乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的檢測(cè)試劑，其特征在于所述的檢測(cè)試劑是以水溶性A3B型金屬卟啉標(biāo)記乙肝病毒表面抗體HBsAb得到的的金屬卟啉標(biāo)記HBsAb，所述的水溶性A3B型金屬卟啉如式(I)所示
2.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的檢測(cè)試劑，其特征在于所述的式(I)中η為O。
3.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的檢測(cè)試劑，其特征在于所述的檢測(cè)試劑按如下方法制得將N-羥基琥珀酰亞胺加入濃度為5mg/mL的水溶性A3B型金屬卟啉水溶液中，在10 30°C下攪拌10 30min，然后加入含有HBsAb的水溶液，繼續(xù)在10 30°C下攪拌3 5h，反應(yīng)產(chǎn)物在O 10°C下離心分離兩次，合并上清液并用硫酸銨進(jìn)行鹽析，將鹽析后的沉淀用PH 7. O 7. 5的磷酸鹽緩沖液透析1 3h，至透過液為無色，冷凍干燥，從而分離出金屬卟啉標(biāo)記的HBsAb，即為乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的檢測(cè)試劑； 所述的含有HBsAb的水溶液中HBsAb的質(zhì)量以N-羥基琥珀酰亞胺質(zhì)量計(jì)為0. 1 0. 5mg/ mg，含有HBsAb的水溶液的濃度為0. 1 0. 5mg/mL。
4.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的檢測(cè)試劑，其特征在于所述的檢測(cè)試劑檢測(cè)HBsAg的方法為(1)將HBsAb包被于固相載體上，制成包被HBsAb的微孔板，所述固相載體為96聚苯乙烯微孔板；(2)取步驟(1)制得的包被HBsAb的微孔板，分別加入HBsiVg標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測(cè)的HBsAg 樣品，經(jīng)過4°C放置過夜或37°C孵育30 60min，使待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中的HBsAg分別與 HBsAb結(jié)合，洗滌，除去未結(jié)合的HBsAg，得到結(jié)合HBsAg標(biāo)準(zhǔn)抗原的微孔板和結(jié)合HBsAg待測(cè)抗原的微孔板；(3)加標(biāo)記抗體將乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的檢測(cè)試劑用磷酸緩沖液配制成濃度為1.0 5.(^8/!^檢測(cè)試劑溶液，將步驟(2)得到的結(jié)合HBsAg標(biāo)準(zhǔn)抗原的微孔板和結(jié)合HBsAg待測(cè)抗原的微孔板中分別加入體積為200 μ L所述的檢測(cè)試劑溶液，37°C孵育 30 60min，洗板，得到結(jié)合金屬卟啉標(biāo)記HBsAb的HBsAg標(biāo)準(zhǔn)抗原微孔板和結(jié)合金屬卟啉標(biāo)記HBsAb的HBsAg待測(cè)抗原微孔板；(4)檢測(cè)于步驟(3)得到的結(jié)合金屬卟啉標(biāo)記HBsAb的HBsAg標(biāo)準(zhǔn)抗原微孔板和結(jié)合金屬卟啉標(biāo)記HBsAb的HBsAg待測(cè)抗原微孔板中分別加入新鮮配制的發(fā)光底物工作液， 10 30°C靜置5 lOmin，檢測(cè)420nm處的發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算出待測(cè)樣品中HBsAg的濃度；所述發(fā)光底物工作液為0. 1 0. 5mol/L 3-氨基鄰苯二甲酰胼50 100 μ L和質(zhì)量濃度為、0. 1. 0%過氧化氫50 100 μ L。
5.如權(quán)利要求4所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的檢測(cè)試劑，其特征在于所述的檢測(cè)試劑檢測(cè)HBsiVg的方法中所述的發(fā)光底物為0. lmol/L 3-氨基鄰苯二甲酰胼和質(zhì)量濃度1.0%過氧化氫。
6.如權(quán)利要求4所述的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的檢測(cè)試劑，其特征在于所述的檢測(cè)試劑檢測(cè)HBsAg的方法按以下步驟進(jìn)行(1)包被用pH7. 0 7. 5,0. 1 0. 5mol/L的磷酸鹽緩沖液與HBsAb水溶液配制、1.0 2. 5 μ g/mL的HBsAb包被液，每孔100 μ L加入96聚苯乙烯微孔板中，4°C放置過夜或 37°C放置30 60min，棄包被液，每孔加入200 μ L含 5%牛血清蛋白的所述磷酸鹽緩沖液作封閉液，37°C封閉1 2h，用pH7. 0 7. 5,0. 1 0. 5mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌，每次浸泡1 3min，洗板3次，30°C下真空干燥后放入封閉袋中真空保存，制得包被HBsAb的微孔板；所述HBsAb水溶液中HBsAb的濃度為1. 0 5. Omg/mL ；(2)加樣將步驟(1)制備的包被HBsAb的微孔板分成標(biāo)準(zhǔn)品組及待測(cè)樣品組，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入 50 μ L、濃度分別為 10ng/mL、5. 0ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL、 0. 312ng/mL、0. 156ng/mL和0. Ong/mL的HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品，在待測(cè)樣品孔中加入50 μ L預(yù)處理的待測(cè)樣品，用封板膜封住反應(yīng)孔，4°C放置過夜或37°C孵育30 60min，用pH 7. 0 7. 5、、0.1 0. 5mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌，每次浸泡1 3min，洗板3次，所述的待測(cè)樣品的預(yù)處理為3000r/min離心30min，取上清；(3)加標(biāo)記抗體將乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的檢測(cè)試劑用磷酸緩沖液配制成濃度為1. 0 5. 0 μ g/mL的檢測(cè)試劑溶液，于步驟O)的標(biāo)準(zhǔn)品孔及待測(cè)樣品孔中分別加入所述的檢測(cè)試劑溶液100μ L，37°C孵育30 60min，用pH 7. 0 7. 5,0. 1 0. 5mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌，每次浸泡1 3min，洗板3次；(4)檢測(cè)于步驟(3)的標(biāo)準(zhǔn)品孔及待測(cè)樣品孔中分別加入新鮮配制的發(fā)光底物工作液，10 30°C靜置5 lOmin，檢測(cè)420nm處的發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算出待測(cè)樣品中HBsAg的濃度； 所述發(fā)光底物工作液為0. 1 0.5mol/L 3-氨基鄰苯二甲酰胼100 μ L和質(zhì)量濃度0. 、1.0%過氧化氫100 μ L0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙型肝炎表面抗原HBsAg的檢測(cè)試劑及其檢測(cè)HBsAg的方法，所述的檢測(cè)試劑是以水溶性A3B型金屬卟啉標(biāo)記乙肝病毒表面抗體HBsAb得到的的金屬卟啉標(biāo)記HBsAb；本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)A3B型金屬卟啉配合物和HBsAb耦合后易將游離的金屬卟啉分子與耦合物分離，得到高純度的標(biāo)記抗體，降低化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)HBsAg時(shí)的非特異吸附本底信號(hào)，大大提高檢測(cè)靈敏度；(2)本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、快速，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，不僅具有免疫反應(yīng)的特異性、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏性，還具有化學(xué)標(biāo)記物的穩(wěn)定性；(3)本發(fā)明為乙型肝炎病毒表面抗原的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)和乙肝病毒的預(yù)防與治療提供了新的手段。
文檔編號(hào)G01N33/576GK102183647SQ20111002518
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者何睿, 張現(xiàn)俠, 李霞, 梁媛媛, 焦艷華, 袁通, 陳燦玉, 黃志堅(jiān) 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)