專利名稱：：Tafi含量的體外檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于臨床預(yù)測(cè)心腦血管疾病等發(fā)生可能性的檢測(cè)凝血酶激活的纖溶抑制物(thrombin-activatablefibrinolysisinhibitor，簡(jiǎn)稱TAFI)含量的新方法，特別是用于檢測(cè)人個(gè)體生物樣品，如血液、血清、血漿、尿液、粘液、糞便、腦脊液、胸腔積液、腹水、唾液、組織或細(xì)胞等的TAFI含量的體外檢測(cè)方法。在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，它主要通過(guò)對(duì)人個(gè)體生物樣品中的TAFI含量的體外測(cè)定，以輔助心腦血管疾病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、內(nèi)源性凝血系統(tǒng)缺陷疾病、炎癥等相關(guān)疾病的診斷和大規(guī)模臨床普查。
背景技術(shù)：
：眾所周知，血栓性疾病是一類嚴(yán)重影響健康的疾病，尤其是心腦血管栓塞性疾病已成為我國(guó)人口死亡的首位原因。由于血栓性疾病的臨床表現(xiàn)千差萬(wàn)別，診斷和治療往往非常復(fù)雜，因此，早期發(fā)現(xiàn)、早期治療尤為重要。目前，血栓性疾病的檢查方法主要有心電圖、超聲心動(dòng)圖、胸部X射線、血壓監(jiān)測(cè)、頭顱X射線、腦CT掃描、腦MRI檢查、DSA、MRA、經(jīng)顱多普勒超聲檢查等。射線類檢查會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定程度的電離輻射，組織血流灌注的功能性成像檢查方法較多，這些檢查設(shè)備通常比較昂貴，增加了成本，有的還需特殊裝備，成像時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法短期獲得結(jié)果。在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，尚缺乏一種簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確的用于臨床預(yù)測(cè)心腦血管疾病等發(fā)生可能性的檢測(cè)方法，不利于對(duì)疾病的早期發(fā)現(xiàn)，早期治療。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，TAFI具有被凝血酶激活后下調(diào)纖溶活性的功能，是一種存在于血漿中的含金屬ai的羧肽酶前體，又被稱為血漿羧肽酶原B、血漿羧肽酶原U、血漿羧肽酶原R。TAFI前體由肝臟合成，是一條包含423個(gè)氨基酸的單鏈糖蛋白，在循環(huán)至血液中的過(guò)程中，切掉N端22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，形成401個(gè)氨基酸的56kDa的TAFI；TAFI也存在于血小板內(nèi)，血小板激活時(shí)釋放至血液。凝血酶、胰蛋白酶、纖溶酶等蛋白水解酶可以作用于TAFI的Arg92，將其切割成20kDa的激活肽和具有羧肽酶活性的36kDa的TAFIa。TAFIa具有切除部分降解的纖維蛋白C端Arg或Lys的能力，使纖溶蛋白酶原不能被激活，因而具有下調(diào)纖溶系統(tǒng)的功能，但其構(gòu)象具有高度不穩(wěn)定性。TAFI于1988年被首次發(fā)現(xiàn)，活化后具有內(nèi)在不穩(wěn)定性，通常在37°C條件下孵育池失去活性，并且能特異性地分解底物上精氨酸。后經(jīng)多位科技工作者對(duì)其cDNA進(jìn)行分離以及測(cè)定，并利用纖溶酶原-瓊脂糖柱層析的方法從血漿中分離、提純其酶原蛋白pro-pCPB，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)TAFI通過(guò)凝血酶激活后具有羧肽酶活性，發(fā)揮纖溶抑制作用。TAFI與心腦血管疾病有一定關(guān)系。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，簡(jiǎn)稱AS)是缺血性心腦血管疾病(如心絞痛、心肌梗死、腦卒中等)共同的病理基礎(chǔ)，也是導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成的主要原因。近幾年的研究表明，AS的發(fā)生發(fā)展與炎癥、凝血-纖溶調(diào)節(jié)系統(tǒng)密切相關(guān)。目前研究表明，TAFI通過(guò)降低纖溶活性可促進(jìn)靜脈血栓的形成，血漿高TAFI水平能增加靜脈血栓事件。目前，用來(lái)檢測(cè)TAFI水平的方法主要有兩類，一類是通過(guò)測(cè)定酶活力的方法間接測(cè)定TAFI含量，即利用凝血酶和凝血酶調(diào)節(jié)蛋白激活TAFIjIUSTAFIa的酶活力’另一類是免疫學(xué)方法，包括酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)和火箭免疫電泳。其中，夾心ELISA法檢測(cè)TAFI抗原是目前相對(duì)成熟的檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性好，檢測(cè)方法安全易行。2005年出現(xiàn)了兩種針對(duì)TAFI的特異性單克隆抗體，成功運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)TAFI、TAFIa和失活的TAFI。但這些方法因自身存在一定的缺陷，都沒(méi)有成為國(guó)際公認(rèn)的TAFI參照標(biāo)準(zhǔn)法。本發(fā)明人曾在專利號(hào)為CN200410020546.X的“乳腺癌的Her_2免疫組織化學(xué)診斷試劑盒”中，利用含氨功能基高分子PAMAM樹(shù)突狀物的生物特性標(biāo)記抗體，進(jìn)行乳腺癌的Her-2免疫組織化學(xué)的體外診斷，可使檢測(cè)乳腺癌獲得準(zhǔn)確的判斷結(jié)果。由此，開(kāi)辟了新的體外診斷學(xué)方法。PAMAM(聚酰胺-胺)是一種納米級(jí)樹(shù)突狀多聚物，PAMAM樹(shù)狀大分子(PAMAMDendrimer)是近年來(lái)合成并迅速發(fā)展的一類新型聚合物。該聚合物與傳統(tǒng)的聚合物相比，可在納米水平上嚴(yán)格控制設(shè)計(jì)分子大小、結(jié)構(gòu)和表面基團(tuán)，因而具有精確的分子結(jié)構(gòu)、致密的球狀外形、單分散性、極好的水溶性。經(jīng)研究表明，用PAMAM來(lái)攜帶寡核酐酸基因片段進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，證明其具有非常好的傳遞功能；可應(yīng)用PAMAM結(jié)合抗體片段靶向性治療前列腺癌。專利號(hào)為US2003/0044407A1的“標(biāo)記抗體或抗體片段的免疫脂質(zhì)或多聚物用于系統(tǒng)治療的傳輸或診斷試劑”中，也公開(kāi)了一種應(yīng)用PAMAM標(biāo)記稀有金屬和抗體注入體內(nèi)，通過(guò)核磁共振測(cè)定進(jìn)行影像學(xué)診斷的方法。但是因其在體內(nèi)分解、代謝所產(chǎn)生的毒性作用尚不清楚，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，一定的PAMAM劑量可使小鼠產(chǎn)生溶血性變化。因此，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)難于廣泛應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種TAFI含量的體外檢測(cè)方法，它解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的設(shè)備昂貴，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)等缺陷，與其它檢測(cè)方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、快捷、成本低廉，診斷敏感，檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，作為用于臨床預(yù)測(cè)心腦血管疾病的輔助診斷，可顯著提高疾病的檢出率和準(zhǔn)確率，有利于疾病的早期發(fā)現(xiàn)，早期治療；減少被檢者不必要的痛苦和醫(yī)療費(fèi)用支出，提高被檢者的生存質(zhì)量。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案的具體操作步驟如下步驟一采集人個(gè)體生物樣品立即于30分鐘內(nèi)，4°C條件下離心取上清作為待檢樣品，置于冰盒1小時(shí)內(nèi)使用或-20°C保存?zhèn)溆茫徊襟E二利用體外檢測(cè)試劑盒，對(duì)待檢樣品進(jìn)行TAFI含量測(cè)定；所述體外檢測(cè)試劑盒的內(nèi)容物包括捕獲待檢樣品TAFI抗原并在固相上形成抗原抗體復(fù)合物的包被抗體的酶標(biāo)板，用于稀釋待檢樣品的樣品稀釋液，用于制作計(jì)算待檢樣品中的TAFI抗原含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的TAFI標(biāo)準(zhǔn)品，洗去未結(jié)合在酶標(biāo)板上的分子的洗凈液，用來(lái)使酶標(biāo)抗體成比例的結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體及抗體稀釋液，作為酶作用底物的30%過(guò)氧化氫和鄰苯二胺及底物顯色緩沖液，使底物顯色反應(yīng)停止的終止液；檢測(cè)操作時(shí)，所述PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體用所述抗體稀釋液300倍稀釋，所述TAFI標(biāo)準(zhǔn)品加入Iml所述樣品稀釋液溶解，所述酶作用底物中各組分的用量比為鄰苯二胺13mg顯色緩沖液體積13ml30%過(guò)氧化氫體積6.5μ1；步驟三利用所述樣品稀釋液對(duì)所述待檢樣品進(jìn)行100-2000倍稀釋；5步驟四取Iml樣品稀釋液溶解所述TAFI標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度為48ng/ml，用所述樣品稀釋液對(duì)48ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液做2倍梯度稀釋，制成濃度分別為Mng/ml，12ng/ml,6ng/ml,3ng/ml,1.5ng/ml,0.75ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以所述樣品稀釋液作為空白對(duì)照液；步驟五分別取所述標(biāo)準(zhǔn)工作液、空白對(duì)照液、稀釋的待檢樣品50μ1，加入所述包被抗體的酶標(biāo)板孔中，每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)，室溫靜置1小時(shí)，所述待檢樣品中的TAFI抗原與包被在酶標(biāo)板上的抗體特異結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物；步驟六棄去酶標(biāo)板孔中的液體，拍干，加入所述試劑盒的洗凈液300μ1，靜置10分鐘，棄去拍干，重復(fù)3次，洗去所述包被抗體的酶標(biāo)板孔中的未結(jié)合物質(zhì)；步驟七取所述PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體20μ1，加入所述抗體稀釋液6ml中，制成酶聯(lián)抗體工作液；步驟八向結(jié)合有抗原抗體復(fù)合物的所述包被抗體的酶標(biāo)板孔中加入所述PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體50μ1，室溫靜置1小時(shí)，所述PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體與所述固相抗原抗體復(fù)合物上的TAFI抗原結(jié)合；步驟九棄去所述包被抗體的酶標(biāo)板孔中的液體，拍干，加入所述洗凈液300μ1，靜置10分鐘，棄去拍干，重復(fù)3次，洗去所述包被抗體的酶標(biāo)板孔中未結(jié)合的所述PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體，此時(shí)固相載體上帶有的酶量與所述待檢樣品中受檢抗原的量成正比；步驟十取所述鄰苯二胺1片，溶解于所述顯色液13ml中，加入30%所述過(guò)氧化氫6.5μ1混勻，制成所述酶作用底物；步驟^^一加入所述酶作用底物100μ1，避光反應(yīng)10分鐘，固相上的酶催化所述酶作用底物成為淡黃色產(chǎn)物；步驟十二加入所述終止液100μ1終止反應(yīng)，淡黃色產(chǎn)物立即轉(zhuǎn)化為棕色，于492nm處測(cè)定吸光值；步驟十三根據(jù)所述TAFI標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值與濃度的關(guān)系，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所述待檢樣品中TAFI抗原的含量。所述包被抗體和酶標(biāo)抗體是針對(duì)重組人TAFI抗原所制備的鼠抗人單克隆抗體，所述鼠抗人單克隆抗體包含3B1和4E7，所述3B1為特異性結(jié)合TAFI和失活的TAFI，所述4E7僅與TAFI結(jié)合。所述PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體是由辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體與帶正電荷的PAMAM樹(shù)突狀多聚物混合，在室溫條件下反應(yīng)1015分鐘制成，二者的混合濃度為0.1101摩爾比。所述包被抗體的酶標(biāo)板的制備為，用磷酸鹽緩沖液稀釋抗體4E7至15μg/ml，每孔100μ1包被酶標(biāo)板，用含有IOmM乙二胺四乙酸二鈉(ρΗ7.3)的明膠溶液作為封閉液，每孔200μ1封閉酶標(biāo)板。所述TAFI標(biāo)準(zhǔn)品的制備為，以標(biāo)化TAFI作為標(biāo)準(zhǔn)品，倍比稀釋做標(biāo)準(zhǔn)曲線，ELISA方法測(cè)定人混合血漿濃度，測(cè)定結(jié)果為19200ng/ml，取該血漿0.:3ml，加入IOOmM乙二胺四乙酸二鈉(ρΗ7·3)溶液240μ1，蒸餾水3.3ml,IOOmM殼聚糖溶液0.96ml，充分混勻，制成終濃度為TAFI2.4μg/ml、乙二胺四乙酸二鈉5mM、殼聚糖20mM的溶液，取該溶液20μ1分裝至滅菌過(guò)的凍存管底部，冷凍干燥后4°C保存。樣品稀釋液的制備為，取Ig牛血清白蛋白，加入IOOmM乙二胺四乙酸二鈉(pH7.3)溶液IOOmlUO倍濃度磷酸鹽緩沖液IOOml和蒸餾水800ml，充分混勻。所述體外檢測(cè)試劑盒的內(nèi)容物包括捕獲待檢樣品TAFI抗原并在固相上形成抗原抗體復(fù)合物的96孔包被抗體的酶標(biāo)板一塊；用于稀釋待檢樣品的樣品稀釋液，2XIOOml/瓶；用于制作計(jì)算待檢樣品中的TAFI抗原含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的TAFI標(biāo)準(zhǔn)品，凍干品lX48ng/管；洗去未結(jié)合在酶標(biāo)板上的分子的洗凈液，2X100ml/瓶；用來(lái)使酶標(biāo)抗體成比例的結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體IX30μ1/管；及抗體稀釋液，1XIOml/瓶；作為酶作用底物的30%過(guò)氧化氫1X30μ1/管，鄰苯二胺，lX13mg/片，及底物顯色緩沖液，IX30ml/瓶；使底物顯色反應(yīng)停止的終止液，1XIOml/瓶。所述TAFI含量的體外檢測(cè)方法的應(yīng)用其技術(shù)要點(diǎn)是用于檢測(cè)人體生物樣品中的血液、血清、血漿、尿液、粘液、糞便、腦脊液、胸腔積液、腹水、唾液、組織或細(xì)胞。所述TAFI含量的體外檢測(cè)方法的應(yīng)用其技術(shù)要點(diǎn)是將對(duì)人個(gè)體樣品中TAFI含量的測(cè)定，根據(jù)TAFI與相關(guān)疾病的關(guān)系，應(yīng)用于輔助心腦血管疾病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、內(nèi)源性凝血系統(tǒng)缺陷疾病、炎癥等的與TAFI含量相關(guān)聯(lián)疾病的診斷。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)及積極效果是由于本發(fā)明所采用的體外檢測(cè)試劑盒的內(nèi)容物中包括針對(duì)TAFI的特異性單克隆抗體和酶聯(lián)免疫測(cè)定所需試劑，并根據(jù)含氨功能基高分子PAMAM樹(shù)突狀物的生物特性，用PAMAM標(biāo)記抗體的方法，與現(xiàn)有成熟的ELISA檢測(cè)方法相結(jié)合，用于檢測(cè)人體生物樣品的TAFI含量的體外檢測(cè)，開(kāi)辟了TAFI新的體外診斷學(xué)方法，所以它解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的設(shè)備昂貴，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)等缺陷。將這種體外診斷學(xué)方法用于臨床預(yù)測(cè)心腦血管疾病的可能性，其操作簡(jiǎn)便、快捷、成本低廉，診斷敏感，檢出限低。因PAMAM是被合成的一種常用的納米級(jí)樹(shù)突狀多聚物，其大小、形狀及功能基團(tuán)的放置都可以精確控制，故在直徑上呈現(xiàn)出可被較好控制的單分散性。同時(shí)，它還有較好的水溶性，經(jīng)過(guò)反復(fù)的聚合反應(yīng)，在其表面形成了高密度的氨基基團(tuán)，在生理環(huán)境的PH時(shí)帶正電性，可與帶負(fù)電荷的酶聯(lián)抗體蛋白結(jié)合，樣品中的TAFI抗原與標(biāo)記了PAMAM的酶聯(lián)特異抗體進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)，通過(guò)酶催化的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，在492nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值，吸光值與抗原濃度呈正比關(guān)系，從而達(dá)到定量測(cè)定抗原含量的目的。將PAMAM應(yīng)用于ELISA檢測(cè)可以明顯提高檢測(cè)的靈敏度和特異性，這種體外診斷學(xué)方法優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中采用的其它普通方法。因此，本發(fā)明的方法可應(yīng)用于人個(gè)體樣品中TAFI含量的體外測(cè)定，根據(jù)TAFI與相關(guān)疾病的關(guān)系，作為輔助診斷，提高相關(guān)疾病的檢出率和準(zhǔn)確率，達(dá)到了早期發(fā)現(xiàn)，早期治療的目的；減少被檢者不必要的痛苦和醫(yī)療費(fèi)用支出，提高被檢者的生存質(zhì)量。本發(fā)明所用的體外檢測(cè)試劑盒與人纖溶抑制因子/凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)材料為已確診的心腦梗死患者血漿58例，使用TAFI酶聯(lián)免疫分析試劑盒和本發(fā)明所用的體外檢測(cè)試劑盒同時(shí)進(jìn)行酶聯(lián)免疫測(cè)定，本發(fā)明所用的體外檢測(cè)試劑盒與TAFI酶聯(lián)免疫分析試劑盒測(cè)定的陽(yáng)性率分別為36.2%和20.6%,該結(jié)果顯示，本發(fā)明方法對(duì)TAFI抗原的檢測(cè)特異性更高，更準(zhǔn)確。以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。7圖1是單克隆抗體3B1與TAFI特異性結(jié)合免疫印跡圖。圖中序號(hào)說(shuō)明①M(fèi)arker；②純化的TAFI，濃度為0.252μg；③空白；④人血漿。圖2是單克隆抗體4E7與TAFI特異性結(jié)合ELISA曲線。圖3是TAFI標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4是心腦梗死患者與健康者血漿TAFI含量對(duì)照?qǐng)D。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合圖14和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。本發(fā)明是采用體外檢測(cè)試劑盒的內(nèi)容物中的針對(duì)TAFI的特異性單克隆抗體和酶聯(lián)免疫測(cè)定所需試劑，并根據(jù)含氨功能基高分子PAMAM樹(shù)突狀物的生物特性，用PAMAM標(biāo)記抗體的方法，與現(xiàn)有成熟的ELISA檢測(cè)方法相結(jié)合，用于檢測(cè)人體生物樣品的TAFI含量的體外檢測(cè)。該TAFI含量的體外檢測(cè)試劑盒內(nèi)容物包括捕獲待檢樣品TAFI抗原并在固相上形成抗原抗體復(fù)合物的96孔包被抗體的酶標(biāo)板一塊；用于稀釋待檢樣品的樣品稀釋液，2X100ml/瓶；用于制作計(jì)算待檢樣品中的TAFI抗原含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的TAFI標(biāo)準(zhǔn)品，lX48ng/管(凍干品)；洗去未結(jié)合在酶標(biāo)板上的分子的洗凈液，2XIOOml/瓶；用來(lái)使酶標(biāo)抗體成比例的結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體，1X30μ1/管；抗體稀釋液，1XIOml/瓶；作為酶作用底物的30%過(guò)氧化氫，1X30μ1/管，鄰苯二胺，IX13mg/片，及底物顯色緩沖液，IX30ml/瓶；使底物顯色反應(yīng)停止的終止液，IXIOml/瓶。檢測(cè)操作時(shí)，PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體用抗體稀釋液300倍稀釋，TAFI標(biāo)準(zhǔn)品加入Iml樣品稀釋液溶解，酶作用底物中各組分的用量比為鄰苯二胺13mg顯色緩沖液體積13ml30%過(guò)氧化氫體積6.5μ1。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中TAFI抗原的量。盒內(nèi)各試劑的劑量可根據(jù)實(shí)際檢測(cè)待檢樣品的需要配制。本發(fā)明所采用的TAFI含量的體外檢測(cè)試劑盒的內(nèi)容物的制備方法如下1、PAMAMDendrimer的合成PAMAMDendrimer由0代至10代，其分子直徑在IOA至130Α之間，屬于納米尺度的分子。其合成是采用分支法，即分子由核心部分開(kāi)始向外生長(zhǎng)。根據(jù)樹(shù)木分枝的規(guī)律將預(yù)先制好的單體按放射狀的順序、分支的枝梢再接分支，依次重復(fù)組合起來(lái)。以乙二胺(EDA)為引發(fā)核，第1步反應(yīng)(a)與丙烯酸甲酯(MA)通過(guò)Michael加成反應(yīng)生成1個(gè)四元酯[稱為0.5代(G)]；第2步反應(yīng)(b)四元酯與過(guò)量的乙二胺發(fā)生氨解反應(yīng)生成1個(gè)四元酰胺化合物(稱為1代)。重復(fù)(a)、(b)Michael加成和氨解的反應(yīng)步驟，即可得到不同代數(shù)的PAMAM樹(shù)狀大分子化合物。合成產(chǎn)物均用FT2^、FAB2MS、1HNMR和13CNMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。以下是PAMAM合成反應(yīng)路線。權(quán)利要求1.一種TAFI含量的體外檢測(cè)方法，其特征在于具體操作步驟如下步驟一采集人個(gè)體生物樣品立即于30分鐘內(nèi)，4°C條件下離心取上清作為待檢樣品，置于冰盒1小時(shí)內(nèi)使用或-20°C保存?zhèn)溆?；步驟二利用體外檢測(cè)試劑盒，對(duì)待檢樣品進(jìn)行TAFI含量測(cè)定；所述體外檢測(cè)試劑盒的內(nèi)容物包括捕獲待檢樣品TAFI抗原并在固相上形成抗原抗體復(fù)合物的包被抗體的酶標(biāo)板，用于稀釋待檢樣品的樣品稀釋液，用于制作計(jì)算待檢樣品中的TAFI抗原含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的TAFI標(biāo)準(zhǔn)品，洗去未結(jié)合在酶標(biāo)板上的分子的洗凈液，用來(lái)使酶標(biāo)抗體成比例的結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體及抗體稀釋液，作為酶作用底物的30%過(guò)氧化氫和鄰苯二胺及底物顯色緩沖液，使底物顯色反應(yīng)停止的終止液；檢測(cè)操作時(shí)，所述PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體用所述抗體稀釋液300倍稀釋，所述TAFI標(biāo)準(zhǔn)品加入Iml所述樣品稀釋液溶解，所述酶作用底物中各組分的用量比為鄰苯二胺13mg顯色緩沖液體積13ml30%過(guò)氧化氫體積6.5μ1；步驟三利用所述樣品稀釋液對(duì)所述待檢樣品進(jìn)行100-2000倍稀釋；步驟四取Iml樣品稀釋液溶解所述TAFI標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度為48ng/ml，用所述樣品稀釋液對(duì)48ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液做2倍梯度稀釋，制成濃度分別為Mng/ml，12ng/ml，6ng/ml，3ng/ml,1.5ng/ml,0.75ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以所述樣品稀釋液作為空白對(duì)照液；步驟五分別取所述標(biāo)準(zhǔn)工作液、空白對(duì)照液、稀釋的待檢樣品50μ1，加入所述包被抗體的酶標(biāo)板孔中，每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)，室溫靜置1小時(shí)，所述待檢樣品中的TAFI抗原與包被在酶標(biāo)板上的抗體特異結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物；步驟六棄去酶標(biāo)板孔中的液體，拍干，加入所述試劑盒的洗凈液300μ1，靜置10分鐘，棄去拍干，重復(fù)3次，洗去所述包被抗體的酶標(biāo)板孔中的未結(jié)合物質(zhì)；步驟七取所述PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體20μ1，加入所述抗體稀釋液6ml中，制成酶聯(lián)抗體工作液；步驟八向結(jié)合有抗原抗體復(fù)合物的所述包被抗體的酶標(biāo)板孔中加入所述PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體50μ1，室溫靜置1小時(shí)，所述PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體與所述固相抗原抗體復(fù)合物上的TAFI抗原結(jié)合；步驟九棄去所述包被抗體的酶標(biāo)板孔中的液體，拍干，加入所述洗凈液300μ1，靜置10分鐘，棄去拍干，重復(fù)3次，洗去所述包被抗體的酶標(biāo)板孔中未結(jié)合的所述PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體，此時(shí)固相載體上帶有的酶量與所述待檢樣品中受檢抗原的量成正比；步驟十取所述鄰苯二胺1片，溶解于所述顯色液13ml中，加入30%所述過(guò)氧化氫6.5μ1混勻，制成所述酶作用底物；步驟十一加入所述酶作用底物100μ1，避光反應(yīng)10分鐘，固相上的酶催化所述酶作用底物成為淡黃色產(chǎn)物；步驟十二加入所述終止液100μ1終止反應(yīng)，淡黃色產(chǎn)物立即轉(zhuǎn)化為棕色，于492nm處測(cè)定吸光值；步驟十三根據(jù)所述TAFI標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值與濃度的關(guān)系，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所述待檢樣品中TAFI抗原的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TAFI含量的體外檢測(cè)方法，其特征在于所述包被抗體和酶標(biāo)抗體是針對(duì)重組人TAFI抗原所制備的鼠抗人單克隆抗體，所述鼠抗人單克隆抗體包含3B1和4E7，所述3B1為特異性結(jié)合TAFI和失活的TAFI，所述4E7僅與TAFI結(jié)合。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TAFI含量的體外檢測(cè)方法，其特征在于所述PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體是由辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體與帶正電荷的PAMAM樹(shù)突狀多聚物混合，在室溫條件下反應(yīng)1015分鐘制成，二者的混合濃度為0.1101摩爾比。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TAFI含量的體外檢測(cè)方法，其特征在于所述包被抗體的酶標(biāo)板的制備為，用磷酸鹽緩沖液稀釋抗體4E7至15μg/ml，每孔100μ1包被酶標(biāo)板，用含有IOmMρΗ7.3的乙二胺四乙酸二鈉溶液的明膠溶液作為封閉液，每孔200μ1封閉酶標(biāo)板。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TAFI含量的體外檢測(cè)方法，其特征在于所述TAFI標(biāo)準(zhǔn)品的制備為，以標(biāo)化TAFI作為標(biāo)準(zhǔn)品，倍比稀釋做標(biāo)準(zhǔn)曲線，ELISA方法測(cè)定人混合血漿濃度，測(cè)定結(jié)果為19200ng/ml，取該血漿0.:3ml，加入IOOmMpH7.3的乙二胺四乙酸二鈉溶液240μ1,蒸餾水3.3ml，IOOmM殼聚糖溶液0.96ml，充分混勻，制成終濃度為TAFI2.4μg/ml、乙二胺四乙酸二鈉5mM、殼聚糖20mM的溶液，取該溶液20μ1分裝至滅菌過(guò)的凍存管底部，冷凍干燥后4°C保存。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TAFI含量的體外檢測(cè)方法，其特征在于樣品稀釋液的制備為，取Ig牛血清白蛋白，加入IOOmMpH7.3的乙二胺四乙酸二鈉溶液IOOml、10倍濃度磷酸鹽緩沖液IOOml和蒸餾水800ml，充分混勻。7.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的TAFI含量體外檢測(cè)方法用的體外檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述體外檢測(cè)試劑盒的內(nèi)容物包括捕獲待檢樣品TAFI抗原并在固相上形成抗原抗體復(fù)合物的96孔包被抗體的酶標(biāo)板一塊；用于稀釋待檢樣品的樣品稀釋液，2X100ml/瓶；用于制作計(jì)算待檢樣品中的TAFI抗原含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線的TAFI標(biāo)準(zhǔn)品，凍干品lX48ng/管；洗去未結(jié)合在酶標(biāo)板上的分子的洗凈液，2X100ml/瓶；用來(lái)使酶標(biāo)抗體成比例的結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體1Χ30μ1/管；及抗體稀釋液，1XIOml/瓶；作為酶作用底物的30%過(guò)氧化氫1X30μ1/管，鄰苯二胺，1X13mg/片，及底物顯色緩沖液，1X30ml/瓶；使底物顯色反應(yīng)停止的終止液，1XIOml/瓶。8.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的TAFI含量的體外檢測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于用于檢測(cè)人體生物樣品中的血液、血清、血漿、尿液、粘液、糞便、腦脊液、胸腔積液、腹水、唾液、組織或細(xì)胞。9.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的TAFI含量的體外檢測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于用于輔助心腦血管疾病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、內(nèi)源性凝血系統(tǒng)缺陷疾病、炎癥中的與TAFI含量相關(guān)聯(lián)疾病的診斷。全文摘要一種TAFI含量的體外檢測(cè)方法，利用PAMAM樹(shù)狀多聚物能與抗體結(jié)合的生物特性，與傳統(tǒng)ELISA方法相結(jié)合，將其用于TAFI含量的體外檢測(cè)，開(kāi)辟了TAFI新的體外診斷學(xué)方法，提高了TAFI體外檢測(cè)的靈敏度。該方法包括包被抗體的酶標(biāo)板，樣品稀釋液，TAFI標(biāo)準(zhǔn)品，洗凈液，PAMAM標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)抗體，抗體稀釋液，顯色緩沖液，30％過(guò)氧化氫，鄰苯二胺和終止液的TAFI含量體外檢測(cè)試劑盒。它解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的設(shè)備昂貴，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)等缺陷，與其它檢測(cè)試劑盒相比，具有操作簡(jiǎn)便、快捷，成本低廉，診斷敏感，檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，作為輔助診斷，提高相關(guān)疾病的檢出率和準(zhǔn)確率，達(dá)到了早期發(fā)現(xiàn)，早期治療的目的；減少被檢者不必要的痛苦和醫(yī)療費(fèi)用支出，提高被檢者的生存質(zhì)量。文檔編號(hào)G01N1/28GK102103142SQ20101061275公開(kāi)日2011年6月22日申請(qǐng)日期2010年12月30日優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日發(fā)明者李文欣申請(qǐng)人:遼寧邁迪生物科技有限公司