專利名稱：一種人畜兩用檢測血吸蟲抗體試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對人畜兩用血吸蟲檢測方面的設(shè)備，特別是一種人畜兩用血吸蟲抗體檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
日本血吸蟲病曾流行于我國南方12個省(市)、自治區(qū)，目前仍在108個縣和57 個縣級農(nóng)場流行，受威脅的人、畜各有近1億。20世紀80年代以來，血吸蟲病防治策略由消滅媒介釘螺轉(zhuǎn)向以化療為主的綜合性防治措施，由此血吸蟲病的早期診斷工作愈顯重要。 家畜是日本血吸蟲的主要保蟲宿主和感染者，其在血吸蟲病的流行過程中起著重要的傳播作用。在血吸蟲病的防治工作中，控制家畜感染源尤為重要，因而除了查治病人外，還必須對流行區(qū)的家畜進行查治。目前日本血吸蟲病的診斷方法主要是糞檢法、間接血凝法(IHA) 和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)。糞檢法費時費力，陽性檢出率也較低，不適合在現(xiàn)場廣泛使用。間接血凝法(IHA法)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)需要儀器設(shè)備，操作時間較長，也不方便于現(xiàn)場使用。因此，尋找簡便快速、準確靈敏，并具有考核療效和防治效果以及監(jiān)測疫情的日本血吸蟲病的診斷方法，已成為當前迫切需要解決的問題。目前市場上有四川邁克生物科技股份有限公司生產(chǎn)的血吸蟲循環(huán)抗原測定試劑盒(ELISA法)、無錫賽德科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)的血吸蟲抗體(IgG)檢測試劑盒(膠體染料法)和安徽安吉醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的日本血吸蟲抗體檢測試劑盒(間接血凝法)，沒有一個產(chǎn)品能同時檢測人和多種家畜的血吸蟲抗體的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對當前市場上對血吸蟲檢測方面的不足之處，發(fā)明一種快速、 簡便，靈敏度高、特異性好、結(jié)果穩(wěn)定可靠并能長期保存實驗結(jié)果，又能同時檢測人和多種家畜血清中血吸蟲抗體試劑盒。本發(fā)明的采用的技術(shù)方案如下一種人畜兩用檢測血吸蟲抗體試劑盒，其特征在于包括a、試劑板由已包被了日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原和金黃色葡萄球菌A蛋白的硝酸纖維素膜、不滲水海綿、吸水墊經(jīng)滲水惰性膠水粘貼而成，再分切成固定寬度的板狀，夕卜加聚苯乙烯塑料外殼制成；b、洗滌液是向緩沖液中加入保護劑、洗滌劑配置而成的無色或淡黃色液體；c、金標液由膠體金標記的SPA紅色液體。本發(fā)明首次用SPA(金黃色葡萄球菌A蛋白)標記膠體金測定日本血吸蟲抗體，解決了實驗室中因SPA與牛、馬、羊等動物IgG親和力較差而無法應(yīng)用于這類動物檢測的難題，開發(fā)出可同時檢測人和多種哺乳動物血清中存在的血吸蟲抗體試劑盒。同時在標記SPA 膠體金溶液中加入穩(wěn)定劑，避免了聚沉現(xiàn)象的產(chǎn)生，極大延長產(chǎn)品的有效期，比市面上其他標記SPA膠體金的產(chǎn)品有效期提高了 3倍，從而解決其在實際生產(chǎn)和臨床檢驗中關(guān)鍵問題；在膠體金溶液燒制過程中，應(yīng)用超聲破碎原理，控制金溶液顆粒大小一致，實現(xiàn)了靈敏度和穩(wěn)定性的優(yōu)異結(jié)合，大幅度提高產(chǎn)品性能；開發(fā)出對照蛋白特殊處理技術(shù)，避免了大規(guī)模檢測時因漏加血清導致的假陰性結(jié)果出現(xiàn)，規(guī)范了檢測操作，提高了結(jié)果可信度；檢測結(jié)果能長期保存，可作為以后實驗的參照及查詢依據(jù)。技術(shù)產(chǎn)品填補國內(nèi)空白，達國際先進水平。本發(fā)明采用的是膠體金免疫滲濾斑點法原理，使用硝酸纖維素膜(NC膜)作為固相載體，將抗原點樣于NC膜上，加入待測血清濾過NC膜，SPA-膠體金(紅色)則作為顯色齊U。如果待測血清中有血吸蟲抗體，則會形成紅色斑點；如果待測血清中不存在血吸蟲抗體，則不會形成紅色斑點。本發(fā)明具有操作簡便、節(jié)省時間、靈敏度高、特異性好、結(jié)果穩(wěn)定可靠并能長期保存實驗結(jié)果，又能同時檢測人和多種家畜血清中血吸蟲抗體，是一種不需要其他儀器設(shè)備就可進行檢測的試劑盒。
具體實施例方式下面根據(jù)具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明1、血吸蟲抗原制備準確稱取購買的蟲卵IOOmg加水:3ml，超聲波破碎3分鐘，反復凍融5天；3000轉(zhuǎn) /min離心40min。經(jīng)離心后的上清液，即為蟲卵抗原原液，保存于_20°C中備用。2、膠體金的燒制a.將1/萬氯化金溶液緩慢加熱，待水溫達到50 60°C (以玻璃器皿外不凝結(jié)水蒸氣為標準)；b.用大火將1/萬氯化金溶液煮沸，煮沸持續(xù)2分鐘；c.迅速加入新鮮配制已溶解好的檸檬酸三鈉溶液；d.觀察膠體金溶液由深紫色轉(zhuǎn)變?yōu)榈仙?，并最終轉(zhuǎn)變?yōu)殚偌t色為宜；e.持續(xù)小火，20分鐘；f.待稍冷卻，密封；g.使用超聲儀，對燒制好的膠體金溶液超聲破脆，使膠體金溶液顆粒大小均勻。3、SPA標記膠體金的NaCL破壞定量實驗標記前將膠體金溶液PH調(diào)整到8. 0。a.將SPA溶液稀釋到lmg/ml，再將SPA溶液(lmg/ml)按如下比例稀釋1 1、 1 5、1 10、1 20、1 40、1 80、1 160,1 320,1 640,1 1280,1 2560、
I 5120,1 10240.每管中加入膠體金溶液lml，充分混勻并靜置15分鐘以上。b.每管加入2mol/L的氯化鈉溶液1ml，靜置2小時左右，觀察每一管中SPA-膠體金溶液的顏色變化情況，并記錄結(jié)果。以SPA-膠體金溶液顏色沒有改變的那一管的SPA量為最低膠體金的標記量，對應(yīng)計算出每毫升膠體金溶液所需SPA的量。4、SPA-膠體金保護液配置配方三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCL溶液)Tris 0.5 %以10%的鹽酸調(diào)整PH到7. 5。牛血清白蛋白(BSA% ) 1.0% ；吐溫-20 (TTOEN-20 % ) :1.5% ；聚乙二
II-20000 (PEG-20000% ) :2.0% ；十二烷基硫酸鈉(SDS% ) 0. 15%5、SPA-膠體金的標記
將膠體金溶液PH調(diào)整到8. 0。當?shù)鞍踪|(zhì)的最適穩(wěn)定量被確定以后便可進行標記， 邊滴加SPA邊搖動膠體金溶液；將所有的SPA都加入到膠體金溶液中后。具體步驟如下 (1)根據(jù)用以標記的膠體金的總量計算出所需要的待標記蛋白質(zhì)的總量；( 在電磁攪拌下，將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中(pH已調(diào)至PI超過0. 5pH)，加入蛋白質(zhì)時應(yīng)逐滴加入， Img的蛋白質(zhì)大約5min加完；(3)在磁性攪拌下加入5%的穩(wěn)定劑使其終濃度為1%。SPA-膠體金標記溶液以15000轉(zhuǎn)/分鐘，40分鐘離心，棄去上清液，保留沉渣，并以少量膠體金-SPA保護液溶解，過濾于潔凈容器中；以此稀釋液配制SPA-膠體金濃縮液并將調(diào)到7. 5左右，450nm吸光度為1. 0 2. 0。純化的目的是除去其中未標記的SPA，未充分標記的SPA以及在標記過程中可能形成的各種聚合物。(1)以2000r/min 4°C離心5min，留上清液，棄沉淀。(2)將膠體金溶液選用15000r/min 4°C離心40min，吸棄上清，留沉淀。(3)將離心收集的SPA-膠體金用 PH值7. 5左右的保護液稀釋，用450nm調(diào)整0D1. 0 2. 0之間。6、洗滌液的配制配方三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCL溶液)Tris 0.5 %以10%的鹽酸調(diào)整PH到8.0。牛血清白蛋白(BSA% ) 2. 0% ；吐溫-20 (TWEEN-20 % ) :1.5% ；聚乙二醇-20000 (PEG-20000% ) :2. 0% ；十二烷基硫酸鈉(SDS % ) 0. 15%07、檢測點和對照點的點樣(1)、抗原稀釋液選取5%蔗糖pH7. 2的磷酸鹽緩沖液(PBS)作為血吸蟲抗原的稀釋液，PBS配置比例如下0.15mol/L的磷酸氫二鈉(含結(jié)晶水)0. 15mol/L的磷酸二氫鉀(含結(jié)晶水)0.9%氯化鈉=1:1:1測定PH值應(yīng)在7. 2，可用0. 15mol/L的磷酸氫二鈉(含結(jié)晶水)或0. 15mol/L的磷酸二氫鉀(含結(jié)晶水)溶液進行PH值的調(diào)整。O)、點樣將硝酸纖維素膜裁剪成IX lcm，將血吸蟲抗原(作為檢測點)及SPA (金黃色葡萄球菌A蛋白作為對照點)用抗原稀釋液稀釋成1 20，然后各取0.5μ1點在硝酸纖維素膜中央靠邊緣2點，室溫干燥2小時，干燥后，4°C密封保存。檢測前將點樣膜緊貼在惰性吸水板上，組裝成測試試劑板。8、SPA(金黃色葡萄球菌A蛋白)標記膠體金免疫滲濾斑點法測定血吸蟲抗體試劑盒的具體操作方法1、在試劑板的反應(yīng)孔中間加入2滴洗滌液，待完全滲入；2、取30 50ul新鮮血清標本，加入反應(yīng)孔中間，待完全滲入；3、在反應(yīng)孔中間加2滴洗滌液，待完全滲入；4、在反應(yīng)孔中間加入2滴膠體金液，待完全滲入；5、在反應(yīng)孔中間加入2滴洗滌液，待完全滲入，5分鐘內(nèi)目測結(jié)果；6、結(jié)果判斷試劑板上出現(xiàn)兩個(T 檢測點、C 對照點)紅色點為陽性結(jié)果；出現(xiàn)一個(C 對照點)紅色點，(T 檢測點)不顯色為陰性結(jié)果。
權(quán)利要求
1. 一種人畜兩用檢測血吸蟲抗體試劑盒，其特征在于包括a、試劑板由已包被了日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原和金黃色葡萄球菌A蛋白的硝酸纖維素膜、不滲水海綿、吸水墊經(jīng)滲水惰性膠水粘貼而成，再分切成固定寬度的板狀，外加聚苯乙烯塑料外殼制成；b、洗滌液是向緩沖液中加入保護劑、洗滌劑配置而成的無色或淡黃色液體；c、金標液由膠體金標記的SPA紅色液體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人畜兩用檢測血吸蟲抗體試劑盒，其特征在于包括a、試劑板；b、洗滌液；c、金標液。本發(fā)明具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性好、結(jié)果穩(wěn)定可靠并能長期保存實驗結(jié)果，又能同時檢測人和多種家畜血清中血吸蟲抗體，是一種不需要其他儀器設(shè)備就可進行檢測血吸蟲抗體的試劑盒。
文檔編號G01N21/78GK102466728SQ20101054100
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者劉照武, 謝端泉 申請人:岳陽迅超生物技術(shù)有限公司