專利名稱：一種堿性磷酸酶結(jié)合物的合成工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶結(jié)合物的制備方法，更具體地說，涉及一種新的堿性磷酸酶標(biāo)記物的合成方法。
背景技術(shù)：
堿性磷酸酶是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物等中的酶。經(jīng)常使用的堿性磷酸酶從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提煉，由多個(gè)同功酶組成。在適宜的緩沖液中，堿性磷酸酶可以催化水解硝基苯磷酸鹽(PNP)、β-甘油磷酸鈉、磷酸萘酯、3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷(AMPPD)等含磷酸根基團(tuán)的顯色底物和化學(xué)發(fā)光底物。鑒于此，堿性磷酸酶作為一種標(biāo)記酶，廣泛應(yīng)用于臨床免疫診斷中。堿性磷酸酶的結(jié)合物是通過化學(xué)合成的方法將堿性磷酸酶和待結(jié)合物結(jié)合在一起，也稱酶標(biāo)記物。免疫診斷中常用的酶結(jié)合物包括酶結(jié)合抗原、酶結(jié)合抗體和酶結(jié)合葡萄球菌蛋白A等。酶結(jié)合物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶結(jié)合物主要應(yīng)用于免疫印跡雜交(Western blotting)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassay, CLE ΙΑ)及免疫組化等免疫檢測(cè)和定量分析。目前本領(lǐng)域中常用的酶結(jié)合物的合成方法主要有三種1.戊二醛交聯(lián)法。戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與待結(jié)合物的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸酶結(jié)合物一般用此法進(jìn)行合成。合成方法分一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與待結(jié)合物的混合物中，反應(yīng)后即得酶結(jié)合物。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與待結(jié)合物作用而形成酶結(jié)合物。也可先將待結(jié)合物與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。但是，這種方法合成的堿性磷酸酶結(jié)合物的活性和結(jié)合率都不夠理想，影響免疫分析的靈敏度。2.過碘酸鹽氧化法。本方法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時(shí)，過碘酸鈉將辣根過氧化物酶分子表面的多糖氧化為很活潑的醛基，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成&1^€€氏堿而結(jié)合。這種方法的操作較為復(fù)雜，合成后酶和待結(jié)合物活性損失較多，也不適合堿性磷酸酶結(jié)合物的合成。3.琥珀酰亞胺-馬來酰亞胺交聯(lián)法。同時(shí)帶有可與氨基反應(yīng)的琥珀酰亞胺酯類和可與巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺基團(tuán)的異源雙功能交聯(lián)試劑常用于制備酶結(jié)合物。這種交聯(lián)試劑常用的有4-(Ν-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)或其水溶性類似物4-(Ν-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亞胺酯(sulfo-SMCC)， 它們可通過活化酶分子的氨基得到帶有馬來酰亞胺基團(tuán)的酶分子，酶分子上的馬來酰亞胺基團(tuán)可以和巰基化結(jié)合物上的巰基基團(tuán)反應(yīng)，最后得到酶結(jié)合物。該方法所用試劑昂貴，而且，待結(jié)合物通常會(huì)因?yàn)樾杞?jīng)過巰基化處理，操作復(fù)雜。因此，有必要開發(fā)一種新的方法，合成具有更高結(jié)合率和活性的堿性磷酸酶結(jié)合物。發(fā)明概述
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在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種合成堿性磷酸酶結(jié)合物的方法。僅僅是為了說明的目的，本發(fā)明方法可稱為碳二亞胺法。本發(fā)明的方法包括以下步驟步驟a)，用碳二亞胺和任選的羥基琥珀酰亞胺活化堿性磷酸酶分子的羧基，生成活性堿性磷酸酶酯；步驟b)， 任選調(diào)節(jié)體系PH至堿性，加入待結(jié)合物，使得堿性磷酸酶酯與待結(jié)合物的合成反應(yīng)，生成堿性磷酸酶結(jié)合物。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明方法獲得的堿性磷酸酶結(jié)合物。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于堿性磷酸酶標(biāo)記的試劑盒，其包括碳二亞胺，以及任選的pH調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選地，該試劑盒還包括指示操作者按照本發(fā)明方法進(jìn)行操作的說明、 離心超濾管或兩者。


圖1圖示了本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案。圖2是泌乳素濃度-發(fā)光值的線性擬合，其中使用本發(fā)明方法對(duì)已知濃度的泌乳素抗體進(jìn)行標(biāo)記，獲得堿性磷酸酶-泌乳素抗體結(jié)合物，并測(cè)定其發(fā)光值。以泌乳素抗體濃度為X軸，以發(fā)光值為Y軸，以最小二乘法進(jìn)行濃度-發(fā)光值的線性擬合。
具體實(shí)施例方式本文中使用的術(shù)語(yǔ)“堿性磷酸酶”是指能夠?qū)?duì)應(yīng)底物去磷酸化的酶，即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基。這類底物包括核酸、蛋白、生物堿等。而該脫去磷酸基團(tuán)的過程被稱為去磷酸化或脫磷酸化。堿性磷酸酶在堿性環(huán)境有最大活力，例如對(duì)來源于細(xì)菌中的ALP來說，其最適PH是8. 0，而對(duì)來源于牛的ALP則是8. 5。用于本發(fā)明的堿性磷酸酶可以是各種來源的堿性磷酸酶，包括但不限于自然提取和工程菌表達(dá)制備的堿性磷酸酶、表面糖基化處理或去糖基處理的堿性磷酸酶，以及其它基團(tuán)修飾處理的堿性磷酸酶。所有合適的堿性磷酸酶都包括在本發(fā)明中。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“碳二亞胺”是指具有含有N = C = N官能團(tuán)的物質(zhì)。本領(lǐng)域中公知，碳二亞胺是一類常用的失水劑，用于有機(jī)合成，其主要用于活化羧基，促使酰胺和酯的生成。可使用的碳二亞胺也是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N，N' -二異丙基碳二亞胺(DIC)等。所有合適的碳二亞胺都包括在本發(fā)明中。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“羥基琥珀酰亞胺”是指具有以下結(jié)構(gòu)的物質(zhì)
權(quán)利要求
1.一種合成堿性磷酸酶結(jié)合物的方法，所述方法包括a)用碳二亞胺和任選的羥基琥珀酰亞胺活化堿性磷酸酶分子的羧基，生成活性堿性磷酸酶酯；b)加入待結(jié)合物，使得堿性磷酸酶酯與待結(jié)合物的合成反應(yīng)，生成堿性磷酸酶結(jié)合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)在酸性條件下進(jìn)行，優(yōu)選所述酸性條件為PH 4. 0-5. O0
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述碳二亞胺選自二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N，N' - 二異丙基碳二亞胺(DIC)；獨(dú)立地所述羥基琥珀酰亞胺選自N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N-磺酸化羥基琥珀酰亞胺。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)還包括調(diào)節(jié)體系至堿性，優(yōu)選所述堿性條件為 PH 7. 5-9.0。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法在步驟b)之后還包括純化處理；優(yōu)選所述純化處理選自超濾純化、脫鹽柱純化、透析純化、凝膠過濾純化、Protein A或G親和柱純化和硫酸銨沉淀純化。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法獲得的堿性磷酸酶結(jié)合物。
7.一種用于堿性磷酸酶標(biāo)記的試劑盒，包括碳二亞胺和任選的羥基琥珀酰亞胺。
8.權(quán)利要求7的試劑盒，所述試劑盒還包括pH調(diào)節(jié)劑，所述pH調(diào)節(jié)劑包括用于步驟 a)的pH調(diào)節(jié)劑、用于步驟b)的pH調(diào)節(jié)劑或兩者。
9.權(quán)利要求8的試劑盒，其中用于步驟a)的所述pH調(diào)節(jié)劑為酸或緩沖系統(tǒng)，優(yōu)選所述酸選自脂肪族有機(jī)酸、芳香族有機(jī)酸和無機(jī)酸，所述緩沖系統(tǒng)選自2-(N-嗎啉代)乙磺酸 (MES)緩沖系統(tǒng)、哌嗪-N，N’雙乙磺酸)(PIPEQ緩沖系統(tǒng)和磷酸鹽緩沖系統(tǒng)。
10.權(quán)利要求8或9的試劑盒，其中用于步驟b)的所述PH調(diào)節(jié)劑為堿，優(yōu)選選自氫氧化鈉和氫氧化鉀。
11.權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的試劑盒，所述試劑盒還包括指示操作者進(jìn)行操作的說明、離心超濾管或兩者。
全文摘要
本發(fā)明涉及堿性磷酸酶結(jié)合物的合成方法，包括步驟a)，用碳二亞胺活化堿性磷酸酶分子的羧基，生成活性堿性磷酸酶酯；步驟b)，加入待結(jié)合物，使得堿性磷酸酶酯與待結(jié)合物的合成反應(yīng)，生成堿性磷酸酶結(jié)合物。
文檔編號(hào)G01N33/535GK102269761SQ20101019264
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者張?jiān)Ｆ? 李可, 錢純亙 申請(qǐng)人:深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司