專利名稱：糖類的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖類的分析方法，特別是涉及采用柱后熒光檢測(cè)-硼酸配合物陰離子 交換法的還原糖和甘露糖-6-磷酸的分析方法。。
背景技術(shù)：
作為還原糖的分析方法，已知下述方法向?qū)⑺米髁鲃?dòng)相使試樣經(jīng)液相色譜而 得的洗脫液中加入含精氨酸等堿性氨基酸的硼酸水溶液，進(jìn)行加熱反應(yīng)后冷卻，對(duì)該反應(yīng) 液照射激發(fā)光并測(cè)定熒光強(qiáng)度或吸光度(專利文獻(xiàn)1)。該方法中所用的裝置是下述裝置 將液相色譜的流出管路延長(zhǎng)，在該流路上連接含堿性氨基酸的硼酸水溶液的供給路徑，其 后安裝有加熱裝置、冷卻裝置、激發(fā)光的照射裝置和熒光強(qiáng)度等的測(cè)定裝置。該方法中需要 設(shè)置用于向經(jīng)液相色譜而得的洗脫液加入含堿性氨基酸的硼酸水溶液而使其反應(yīng)的供給 路徑。此外，作為上述方法的改良型，已知下述方法使試樣經(jīng)采用含作為反應(yīng)試劑的 精氨酸等堿性氨基酸和硼酸的流動(dòng)相的液相色譜進(jìn)行洗脫，加熱所得的洗脫液而使反應(yīng)試 劑與糖類進(jìn)行反應(yīng)(加熱反應(yīng))后冷卻，對(duì)該反應(yīng)液照射激發(fā)光并測(cè)定熒光強(qiáng)度或吸光度 (專利文獻(xiàn)2)。該方法中，因?yàn)椴捎煤瑝A性氨基酸的硼酸水溶液作為液相色譜的流動(dòng)相，所 以不需要設(shè)置用于加入含堿性氨基酸的硼酸水溶液而使其反應(yīng)的供給路徑。上述的還原糖 分析法被稱為柱后熒光檢測(cè)_硼酸配合物陰離子交換法。上述的還原糖分析法都在檢測(cè)中利用了還原糖通過(guò)在硼酸的存在下與精氨酸等 堿性氨基酸的加熱反應(yīng)生成強(qiáng)熒光衍生物的特性(非專利文獻(xiàn)1)。該熒光衍生物是通過(guò)還 原糖與作為胺化合物的堿性氨基酸的加熱反應(yīng)、即美拉德反應(yīng)而生成的呈褐色的類黑精， 該衍生物如果受到作為激發(fā)光的波長(zhǎng)320nm的光的照射，則發(fā)射波長(zhǎng)430nm的光。此外，這 些還原糖分析法利用了還原糖具有容易與硼酸結(jié)合而生成陰離子性配位離子的性質(zhì)且該 陰離子性配位離子被保持于陰離子交換色譜的特性。柱后熒光檢測(cè)-硼酸配合物陰離子交換法中，作為流動(dòng)相，采用含0. 01 5%的濃 度的堿性氨基酸和0. 05 0. 5M的濃度的硼酸的水溶液(PH7 10)。這時(shí)所用的堿性氨基 酸為精氨酸、賴氨酸、組氨酸等。另外，最近還已知作為液相色譜的流動(dòng)相使用由0. IM硼緩 沖液和0. 4M硼酸緩沖液形成的梯度來(lái)進(jìn)行糖的分離(專利文獻(xiàn)3、4)。柱后熒光檢測(cè)_硼酸配合物陰離子交換法中，液相色譜中的試樣洗脫在室溫 70°C的溫度下進(jìn)行，而加熱反應(yīng)、即美拉德反應(yīng)在140 180°C進(jìn)行(專利文獻(xiàn)2)。因?yàn)樵?這樣的高溫下以高硼酸濃度進(jìn)行洗脫和反應(yīng)，所以有時(shí)流動(dòng)相中所含的硼酸會(huì)析出而堵塞 管道。管道堵塞時(shí)就無(wú)法進(jìn)行分析，因此必須經(jīng)過(guò)管道的更換和清洗等費(fèi)時(shí)費(fèi)力的操作來(lái) 重新開(kāi)始分析。這是柱后熒光檢測(cè)-硼酸配合物陰離子交換法中未解決的重要問(wèn)題之一。此外，可通過(guò)柱后熒光檢測(cè)-硼酸配合物陰離子交換法分析的還原糖有葡萄糖、 甘露糖、半乳糖、果糖、鼠李糖等單糖，麥芽糖、麥芽三糖等寡糖，葡糖胺、半乳糖胺等氨基 糖，葡糖醛酸等糖醛酸。
作為該方法的分析對(duì)象，可以例舉糖蛋白的糖鏈。構(gòu)成糖蛋白的糖鏈的還原糖有 甘露糖、半乳糖、巖藻糖等中性糖和半乳糖胺等氨基糖等。糖鏈有時(shí)還包含甘露糖被1分子 的磷酸修飾而得的甘露糖-6-磷酸(M6P)。
糖蛋白的糖鏈中所含的M6P具有在蛋白質(zhì)被攝入細(xì)胞內(nèi)時(shí)與細(xì)胞膜上的甘露 糖-6-磷酸受體結(jié)合而促進(jìn)該攝入的重要功能。作為糖鏈中含M6P的糖蛋白，已知局部存在 于溶酶體中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)等溶酶體酶(非專利文獻(xiàn)2)。溶酶體酶中有 使用重組技術(shù)制成的酶，被用作該酶的遺傳性缺失的患者的治療藥，例如α-半乳糖苷酶A 和葡糖腦苷脂酶。溶酶體酶由于在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能，因此為了使通過(guò)靜脈注射等方法給予 患者的溶酶體酶發(fā)揮藥效，溶酶體酶必須被攝入患者的細(xì)胞內(nèi)，因而需要在溶酶體酶的糖 鏈中包含Μ6Ρ。因此，進(jìn)行構(gòu)成這樣的酶的糖鏈的糖類時(shí)，對(duì)Μ6Ρ的分析是特別重要的。柱 后熒光檢測(cè)-硼酸配合物陰離子交換法可以用作各種糖類的分析技術(shù)，但尚未確立采用該 方法的Μ6Ρ的分析技術(shù)。專利文獻(xiàn)1 日本專利特開(kāi)昭58-216953號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本專利特開(kāi)昭61-25059號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 日本專利特開(kāi)2006-184131號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 日本專利特開(kāi)2008-245550號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1 =Mikami H.等，《分析化學(xué)》(1983)32，Ε207非專利文獻(xiàn)2 :Bielicki J.等，Biochem J. (1993)289,241-246專利文獻(xiàn)

發(fā)明內(nèi)容
在上述背景下，本發(fā)明的一項(xiàng)目的在于調(diào)整柱后熒光檢測(cè)-硼酸配合物陰離子交 換法中所用的陰離子性配位離子對(duì)于陰離子交換樹(shù)脂的保持力，在實(shí)現(xiàn)M6P的分析的同 時(shí)，提高該方法對(duì)甘露糖、巖藻糖、葡萄糖等中性還原糖的分析能力。此外，本發(fā)明的另一項(xiàng)目的在于，實(shí)質(zhì)上消除該方法的管道因流動(dòng)相中所含的硼 酸的析出而堵塞的問(wèn)題。針對(duì)上述目的的研究中，本發(fā)明人嘗試了在柱后熒光檢測(cè)-硼 酸配合物陰離子交換法中，使用硼酸和水溶性的如氯化鈉等中性無(wú)機(jī)鹽的水溶液作為流動(dòng) 相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于這樣的流動(dòng)相，可以通過(guò)水溶性的中性無(wú)機(jī)鹽的濃度來(lái)調(diào)節(jié)陰離子性配 位離子對(duì)于陰離子交換樹(shù)脂的保持力，而且令人吃驚的是，能夠?qū)o(wú)法通過(guò)現(xiàn)有方法分析 的M6P進(jìn)行分析。此外，也發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有方法相比，可以顯著地改善對(duì)甘露糖、巖藻糖、葡萄糖 等中性還原糖的分析能力。另外，還發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加氯化鈉，可以降低流動(dòng)相中所含的硼酸的 濃度，能夠?qū)嵸|(zhì)上消除柱后熒光檢測(cè)_硼酸配合物陰離子交換法的管道因硼酸的析出而堵 塞的問(wèn)題。本發(fā)明是基于這些發(fā)現(xiàn)而完成的發(fā)明。S卩，本發(fā)明提供以下的技術(shù)方案。1. 一種分離分析方法，它是試樣中所含的還原糖的采用柱色譜法的分離分析方 法，其中，包括下述步驟將試樣裝載于陰離子交換樹(shù)脂柱中，藉由使足量的由含規(guī)定濃度的水溶性無(wú)機(jī)鹽 的規(guī)定濃度的硼酸水溶液形成的第一流動(dòng)相通過(guò)所述柱來(lái)對(duì)柱進(jìn)行清洗；
以規(guī)定的流速連續(xù)地向所述柱供給將所述鹽的濃度提高至高于所述第一流動(dòng)相 的第二流動(dòng)相，藉由所述第二流動(dòng)相將還原糖洗脫；將來(lái)自所述柱的洗脫液連續(xù)地導(dǎo)入流路中；通過(guò)在所述流路的規(guī)定位置以規(guī)定速度連續(xù)地向所述洗脫液中添加至少1種堿 性氨基酸，從而形成在所述流路中連續(xù)地流動(dòng)的混合溶液；通過(guò)使所述混合溶液用規(guī)定時(shí)間通過(guò)所述流路的規(guī)定溫度的加熱區(qū)域，從而對(duì)所 述混合溶液 進(jìn)行加熱；在所述流路的規(guī)定位置對(duì)加熱后的在所述流路中流動(dòng)的所述混合溶液連續(xù)地照 射激發(fā)光的同時(shí)，連續(xù)地測(cè)定并記錄從所述混合溶液發(fā)射的熒光的強(qiáng)度。2.如上述1所述的分離分析方法，其中，所述第一流動(dòng)相的硼酸濃度為50 150mM，所述水溶性無(wú)機(jī)鹽的濃度為10 30mM。3.如上述2所述的分離分析方法，其中，所述第一流動(dòng)相及第二流動(dòng)相的硼酸濃 度為75 125mM。4.如上述1 3中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其中，所述第一流動(dòng)相及第二流 動(dòng)相的PH為7. 5 9. 5。5.如上述1 4中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其中，所述水溶性無(wú)機(jī)鹽是氯化 鈉。6.如上述1 5中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其中，在將所述柱加熱至70°C 以下的溫度的狀態(tài)下進(jìn)行還原糖的分離。7.如上述1 6中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其中，所述堿性氨基酸以在所述 混合溶液中達(dá)到0. 1 2w/v%的濃度的條件添加。8.如上述1 7中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其中，所述堿性氨基酸選自精氨 酸、賴氨酸和組氨酸。9.如上述1 8中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其中，所述規(guī)定溫度的加熱區(qū)域 的溫度為140 180°C。10.如上述1 9中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其中，所述第二流動(dòng)相的所述 鹽的濃度至少被提高至200mM。11.如上述1 10中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其中，還原糖包含中性糖。12.如上述1 11中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其中，還原糖包含甘露糖、葡 萄糖或巖藻糖。13.如上述1 12中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其中，還原糖包含甘露 糖-6-磷酸。14. 一種水溶液，該水溶液用于在上述1 13中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法中 用作所述第一流動(dòng)相，含50 150mM硼酸和10 30mM氯化鈉。15. 一種水溶液，該水溶液用于在上述1 13中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法中 與所述第一流動(dòng)相混合來(lái)制備所述第二流動(dòng)相，含50 150mM硼酸和200 250mM氯化鈉。16. 一種固體組合物，該組合物用于溶解于水來(lái)制備上述14所述的水溶液，以 1 0. 1 1 0.5的摩爾比含有硼酸和氯化鈉。17. 一種固體組合物，該組合物用于溶解于水來(lái)制備上述15所述的水溶液，以1 1.5 1 2. 5的摩爾比含有硼酸和氯化鈉。本發(fā)明對(duì)于柱后熒光檢測(cè)-硼酸配合物陰離子交換法，可實(shí)現(xiàn)M6P的分析，且提高 還原糖的分析能力。此外，由于硼酸的使用濃度低于以往的柱后熒光檢測(cè)_硼酸配合物陰 離子交換法，因此也可以實(shí)質(zhì)上消除該方法的管道堵塞的問(wèn)題。



圖1是模式化表示裝置的配置和流路的圖。圖2-1是表示采用新方法的中性還原糖混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果的色譜圖。圖2-2是表示采用現(xiàn)有方法的中性還原糖混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果的色譜圖。圖3-1是表示采用新方法的M6P標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果的色譜圖。圖3-2是表示采用現(xiàn)有方法的M6P標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果的色譜圖。圖4-1是表示采用新方法的中性糖混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液和M6P標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合液的分 析結(jié)果的色譜圖。圖4-2是表示采用現(xiàn)有方法的中性糖混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液和M6P標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合液的 分析結(jié)果的色譜圖。符號(hào)說(shuō)明1 自動(dòng)進(jìn)樣器，2 柱加熱器，3 柱，4 加熱單元，5 熒光檢測(cè)器，A 溶液A(A’)，B 溶液(B’)，C:反應(yīng)試樣液。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中，“硼酸水溶液”一詞也包括為了適當(dāng)調(diào)整pH而添加有如氫氧化鈉或硼酸 鈉等少量的作為PH調(diào)整劑的堿的硼酸水溶液。本發(fā)明中，對(duì)于硼酸水溶液，提到“硼酸濃度”時(shí)，是指將該水溶液中的硼換算為硼 酸(H3BO3)時(shí)的濃度。因此，也包括以如硼酸鈉等鹽的形式添加的硼酸。本發(fā)明中，為了提高第二流動(dòng)相中所含的鹽的濃度，例如將提高了鹽濃度的其他 硼酸水溶液在提高其配比的同時(shí)加入至第一流動(dòng)相中即可。這時(shí)，該配比可以連續(xù)地提高， 也可以間斷地提高，較好是連續(xù)地提高，特別好是線性地提高，即以恒定的速度連續(xù)地提 高。第二流動(dòng)相中的鹽濃度的上升進(jìn)行至作為分析對(duì)象的還原糖洗脫即可。通常使鹽濃度 上升至200mM附近即可，但也可以使其進(jìn)一步提高，例如可以進(jìn)行至鹽濃度達(dá)到250mM。本發(fā)明中，流動(dòng)相中所含的鹽只要是水溶性的除硼酸鹽以外的無(wú)機(jī)鹽即可，沒(méi)有 特別限定，較好是溶于水時(shí)呈中性的中性鹽，特別好是氯化鈉、氯化鉀。本發(fā)明中，只要可以進(jìn)行糖類的分析、特別是根據(jù)目的進(jìn)行的中性還原糖或M6P 的分析，流動(dòng)相的硼酸濃度沒(méi)有限定，較好是在50 150mM的范圍內(nèi)，更好是75 125mM， 特別好是約lOOmM。本發(fā)明中，流動(dòng)相的pH較好是在7. 5 9. 5的范圍內(nèi)，特別好是約9。作為本發(fā)明中的用于陰離子交換柱色譜的陰離子交換樹(shù)脂，可以使用弱陰離子交 換樹(shù)脂和強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂中的任一種，較好是使用強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂。此外，基于陰離子 交換柱色譜法的洗脫可以在室溫下進(jìn)行，較好是加熱柱來(lái)進(jìn)行。但是，這時(shí)的加熱溫度在約 70°C以下，較好是約65°C。
作為本發(fā)明中使用的堿性氨基酸，沒(méi)有特別限定，較好是精氨酸、賴氨酸、組氨酸， 特別好是精氨酸。此外，堿性氨基酸可以單獨(dú)使用任一種，也可以將多種氨基酸制成混合 物來(lái)使用。此外，這時(shí)的堿性氨基酸的添加通過(guò)將含有該堿性氨基酸的水溶液注入至在流 路中流動(dòng)的來(lái)自柱的洗脫液來(lái)進(jìn)行。堿性氨基酸的注入速度只要在一次分析期間保持恒定 即可，可以是任意的。通常，以在流路內(nèi)與來(lái)自柱的洗脫液混合后的濃度(最終濃度)達(dá)到
0.1 2w/v%的條件注入，較好是以達(dá)到0. 5 1. 8w/v%的條件注入，更好是以達(dá)到1. 0
1.5w/v%的條件注入。堿性氨基酸的添加較好是通過(guò)例如以含有該堿性氨基酸的硼酸水溶 液的形式注入流路的方法來(lái)進(jìn)行。該情況下，硼酸濃度可以與流動(dòng)相的硼酸濃度一致，但也 可以存在一定程度的差異。本發(fā)明中，將洗脫液與堿性氨基酸一起加熱而使其進(jìn)行反應(yīng)(加熱反應(yīng))時(shí)的反 應(yīng)溫度可以設(shè)為140 180°C，較好是約150°C。此外，這時(shí)的反應(yīng)是糖分子中的還原性基 團(tuán)與堿性氨基酸反應(yīng)而生成褐色物質(zhì)、即類黑精的美拉德反應(yīng)。本發(fā)明中，對(duì)加熱反應(yīng)后的反應(yīng)液照射作為激發(fā)光的波長(zhǎng)約320nm的紫外線，熒 光強(qiáng)度的測(cè)定針對(duì)由此發(fā)射的波長(zhǎng)約430nm的熒光進(jìn)行。這時(shí)，為了防止噪聲的產(chǎn)生，較好 是在測(cè)定熒光強(qiáng)度之前預(yù)先通過(guò)冷卻裝置等將反應(yīng)液冷卻至室溫左右。可通過(guò)本發(fā)明進(jìn)行分析的糖類是與堿性氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)的還原糖。作為例 子，可以例舉葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、鼠李糖等單糖，麥芽糖、麥芽三糖等寡糖，葡糖 胺、半乳糖胺等氨基糖，葡糖醛酸等糖醛酸以及磷酸化糖等；特別是甘露糖、葡萄糖、巖藻糖 等中性糖和甘露糖-6-磷酸等磷酸化糖。此外，本發(fā)明的方法中所使用的流動(dòng)相作為試劑預(yù)先準(zhǔn)備在提高分析操作的便捷 性方面是有利的。試劑的形態(tài)可以是水溶液，也可以是通過(guò)用純水溶解而形成流動(dòng)相的 固體組合物(粉末、顆粒等)。水溶液的情況下，用作第一流動(dòng)相的試劑是含優(yōu)選為50 150mM、更優(yōu)選為75 125mM、例如約IOOmM的硼酸和10 30mM的氯化鈉的pH7. 5 9. 5 的水溶液。PH的調(diào)整例如可以通過(guò)添加氫氧化鈉來(lái)實(shí)現(xiàn)，也可以通過(guò)將硼酸的一部分置換 為硼酸鈉(例如硼砂)來(lái)實(shí)現(xiàn)，由其中的任一種方法獲得的水溶液為同一組成。此外，用于添加、混合于第一流動(dòng)相來(lái)制備第二流動(dòng)相的水溶液形式的試劑例如 是含優(yōu)選為50 150mM、更優(yōu)選為75 125mM、例如約IOOmM的硼酸和優(yōu)選200 250mM、 例如約200mM的氯化鈉的pH7. 5 9. 5的水溶液。作為用于單純地溶解來(lái)制備第一流動(dòng)相的試劑的固體組合物的情況下，試劑是以 溶于水后可使硼酸濃度為50 150mM、較好是75 125mM、例如約IOOmM且氯化鈉濃度為 10 30mM的比例摻合了硼酸和氯化鈉的固體組合物。因此，采用例如以1 0. 1 1 0. 5 的摩爾比含有硼酸和氯化鈉的固體組合物即可。這時(shí)，通過(guò)摻入適量的硼酸鈉來(lái)代替一部 分硼酸，可以預(yù)先調(diào)整制成水溶液時(shí)的PH。該情況下，為了以溶于規(guī)定量的水時(shí)可獲得那樣的pH的條件配制，例如預(yù)先制備 少量目標(biāo)水溶液，測(cè)定使其達(dá)到該范圍內(nèi)的PH所需的硼酸量和硼酸鈉(硼砂等)量，再基 于這些量根據(jù)要制備的液量配制適當(dāng)量的硼酸和硼酸鈉(硼砂等)即可。此外，通過(guò)添加 氫氧化鈉來(lái)調(diào)整水溶液的PH的情況下，與和所需的氫氧化鈉的Na離子的摩爾數(shù)相同的摩 爾數(shù)的Na離子對(duì)應(yīng)的硼酸鈉量是以硼酸鈉代替氫氧化鈉來(lái)進(jìn)行pH調(diào)整時(shí)的硼酸鈉的需要 量。此外，硼酸的使用量減少與來(lái)源于所添加的硼酸鈉的硼的摩爾數(shù)對(duì)應(yīng)的量。
為了添加、混合于第一流動(dòng)相來(lái)制備第二流動(dòng)相而制備含高濃度的氯化鈉的水溶 液，作為用于溶于水來(lái)制備所述水溶液的試劑的固體組合物是以制成水溶液時(shí)的硼酸的濃 度優(yōu)選為50 150mM、更優(yōu)選為75 125mM、例如約IOOmM的硼酸且氯化鈉的濃度為200 250mM的pH達(dá)到7. 5 9. 5的條件配制的組合物。因此，采用例如以1 1. 5 1 2.5 的摩爾比含有硼酸和氯化鈉的固體組合物即可。
實(shí)施例以下，參照實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，但并不表示本發(fā)明受到實(shí)施例的限定?！矘?biāo)準(zhǔn)溶液的制備〕將30mg的D (+)-甘露糖、IOmg的L(-)-巖藻糖、30mg的D (+)-半乳糖溶解于純 水，定容為100mL。將在ISmL該水溶液中加入純水而定容為50mL的溶液作為中性還原糖 混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液。此外，將20mg的甘露糖-6-磷酸鈉鹽溶于純水而定容為IOOmL的溶液作 為M6P標(biāo)準(zhǔn)原液。M6P標(biāo)準(zhǔn)原液以ImL為單位分裝灌注并于-20°C保存，使用時(shí)溶解，將用 純水稀釋2倍而得的溶液作為M6P標(biāo)準(zhǔn)溶液?！擦鲃?dòng)相用的溶液的制備(新方法用)〕將6. 2g硼酸加入純水中溶解，使用2N氫氧化鈉調(diào)整至pH9. 0后，加入純水將總 量定容為IOOOmL,使用0. 22 μ m的膜濾器抽濾。將所得的溶液記作溶液A (IOOmM硼酸溶液 (PH9.0))。此外，將6. 2g硼酸和11. 7g氯化鈉加入純水中溶解，使用2N氫氧化鈉調(diào)整至 PH9. 0后，加入純水將總量定容為IOOOmL,使用0. 22 μ m的膜濾器抽濾。將所得的溶液記作 溶液B (IOOmM硼酸-200mM氯化鈉溶液(pH9. 0))?！擦鲃?dòng)相用的溶液的制備(現(xiàn)有方法用)〕將6. 2g硼酸加入純水中溶解，使用2N氫氧化鈉調(diào)整至pH8. 0后，加入純水將總量 定容為IOOOmL,使用0. 22 μ m的膜濾器抽濾。將所得的溶液記作溶液A’ (IOOmM硼酸溶液 (pH8. 0))。將24. 8g硼酸加入純水中溶解，使用2N氫氧化鈉調(diào)整至pH9. 0后，加入純水將 總量定容為IOOOmL,使用0. 22 μ m的膜濾器抽濾。將所得的溶液記作溶液B’ (400mM硼酸 水溶液(ρΗ9· 0))?！卜磻?yīng)試樣液的制備〕將IOg L-精氨酸和30g硼酸加入純水中溶解，將總量定容為IOOOmL,使用0. 22 μ m 以下的膜濾器抽濾，將所得的溶液作為反應(yīng)試樣液?！膊捎弥鬅晒鈾z測(cè)_硼酸配合物陰離子交換法的糖分析(1)〕(1)裝置在島津HPLC系統(tǒng)LC-lOAvp (還原糖分析系統(tǒng))中設(shè)置作為陰離子交換柱的 Shim-pack ISA-07/S2504 (4. OmmI. D. X 250mm)(基材聚苯乙烯凝膠，固定相；季銨基)，再 設(shè)置作為用于加熱該柱的柱加熱器的Shim-pack保護(hù)柱ISA (4. OmmI. D. X 50mm)。此外，在 柱的流出口的下游設(shè)置加熱反應(yīng)用的加熱單元(ALB-221，旭科技玻璃株式會(huì)社(旭f ” ) 夂‘，7 )制)。通過(guò)柱加熱器將柱加熱至65°C的同時(shí)，將加熱單元設(shè)置為150°C。此外，在 加熱單元的下游設(shè)置熒光檢測(cè)器，設(shè)置為照射作為激發(fā)光的波長(zhǎng)320nm的紫外線并檢測(cè)波 長(zhǎng)430nm的熒光。裝置的配置和流路模式化示于圖1。
(2)操作步驟
將溶液A和溶液B加樣于還原糖分析系統(tǒng)的自動(dòng)進(jìn)樣器，再設(shè)置為從柱的流出口 的下游(加熱單元的上游)供給反應(yīng)試樣液的狀態(tài)。用色譜分析開(kāi)始時(shí)的流動(dòng)相(溶液A) 平衡柱后，將中性還原糖混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液和M6P標(biāo)準(zhǔn)溶液或者它們的混合溶液裝載于柱。新方法中，將糖類的標(biāo)準(zhǔn)溶液裝載于柱后，使將溶液A和溶液B以90 10的體積 比混合而制成的第一流動(dòng)相(因此硼酸IOOmM,氯化鈉20mM)以0. 3mL/分鐘的流速通入柱 35分鐘后，以同一流速用25分鐘將溶液A和溶液B的體積比線性地提高至25 75(因此 硼酸IOOmM,氯化鈉提高至150mM)，再使溶液B的添加比例達(dá)到100% (因此硼酸IOOmM,氯 化鈉200mM)并以同一流速通入10分鐘，然后與第一流動(dòng)相的情況同樣地使溶液A和溶液 B以90 10的體積比(因此硼酸IOOmM,氯化鈉20mM)以同一流速通入。此外，反應(yīng)試樣 液在柱的流出口的下游以0. 2mL/分鐘的速度供給至流路。因此，反應(yīng)混合液中的精氨酸濃 度為 3X0. 2/(0. 3+0. 2) = 1. 2w/v%。現(xiàn)有方法中，將糖類的標(biāo)準(zhǔn)溶液裝載于柱后，用50分鐘將溶液A’和溶液B’的體積 比連續(xù)地從100 0提高至0 100 (因此，硼酸從IOOmM提高至400mM)的同時(shí)，以0.6mL/ 分鐘的流速通入柱后，僅使溶液B’(400mM硼酸)以同一流速通入20分鐘，然后僅使溶液 A' (IOOmM)以同一流速通入。此外，反應(yīng)試樣液在柱的流出口的下游以0.5mL/分鐘的速度 供給至流路。因此，反應(yīng)混合液中的精氨酸濃度為3X0. 5/(0. 6+0. 5) = 1. 36w/v%。新方法和現(xiàn)有方法中的各溶液的組成和色譜分析的條件示于表1，溶液B、B’的比 例分別示于表2。表1.各溶液的組成和色譜分析的條件 表2.溶液B，B，的比例 (注)時(shí)間以試樣的裝載時(shí)為基準(zhǔn)(0分鐘)。〔中性糖混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析〕通過(guò)新方法對(duì)中性糖混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析后，獲得表示來(lái)源于甘露糖、巖藻 糖和半乳糖的熒光的強(qiáng)度的完全分離的各峰(圖2-1)。另一方面，通過(guò)現(xiàn)有方法對(duì)中性糖 混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析后，來(lái)源于甘露糖、巖藻糖和半乳糖的各峰未完全分離，特別是獲 得來(lái)源于巖藻糖和半乳糖的重疊的峰(圖2-2)。由這些結(jié)果可知，新方法作為中性糖的分 析方法，特別是作為定量的分析方法比現(xiàn)有方法更佳?！拨?Ρ標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析〕通過(guò)新方法對(duì)Μ6Ρ標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析后，獲得來(lái)源于Μ6Ρ的峰(圖3_1)。另一方 面，通過(guò)現(xiàn)有方法對(duì)Μ6Ρ標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析后，未獲得來(lái)源于Μ6Ρ的峰(圖3-2)。這被認(rèn)為 是將氯化鈉向流動(dòng)相的摻入使其他還原糖的同時(shí)分析成為可能，而且對(duì)于對(duì)陰離子交換樹(shù) 脂的保持力產(chǎn)生調(diào)整性的作用，使得對(duì)于現(xiàn)有方法中牢固地結(jié)合于陰離子交換樹(shù)脂而無(wú)法 容易地洗脫的Μ6Ρ的保持力下降。還有，新方法的上述實(shí)施例中，Μ6Ρ在將流動(dòng)相中的氯化 鈉濃度暫時(shí)提高至200mM的10分鐘中未與中性糖一起洗脫，然后使氯化鈉濃度降低至20mM 后發(fā)現(xiàn)洗脫，由實(shí)施例整體的結(jié)果可知，氯化鈉濃度越高，則M6P越容易洗脫，所以可知即 使不使流動(dòng)相的氯化鈉的濃度從200mM降下而直接流入維持柱，也可以實(shí)現(xiàn)M6P的分離?！仓行蕴腔旌衔飿?biāo)準(zhǔn)溶液和M6P標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合液〕通過(guò)新方法對(duì)中性糖混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液和M6P標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合液進(jìn)行分析后，獲得 來(lái)源于甘露糖、巖藻糖、半乳糖和M6P的完全分離的峰(圖4-1)。另一方面，通過(guò)現(xiàn)有方法 對(duì)中性糖混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液和M6P標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合液進(jìn)行分析后，來(lái)源于甘露糖、巖藻糖和 半乳糖的各峰未完全分離，也未能獲得來(lái)源于M6P的峰(圖4-2)。這些結(jié)果顯示，新方法作 為甘露糖、巖藻糖、半乳糖等中性糖的分析技術(shù)以及M6P的分析技術(shù)，特別是作為它們的定 量分析方法，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于現(xiàn)有方法。此外，確認(rèn)如果采用新方法，則可以同時(shí)對(duì)M6P和甘露糖 進(jìn)行分析，因此通過(guò)對(duì)M6P分解而產(chǎn)生的甘露糖進(jìn)行定量，可以對(duì)糖鏈、構(gòu)成糖蛋白的M6P 的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明可以用作還原糖的新分析法，該方法對(duì)于柱后熒光檢測(cè)-硼酸配合物陰離 子交換法，可實(shí)現(xiàn)M6P的分析，且提高中性糖間的分離能力，還解決了該方法的管道堵塞的 問(wèn)題。
權(quán)利要求
一種分離分析方法，它是試樣中所含的還原糖的采用柱色譜法的分離分析方法，其特征在于，包括下述步驟將試樣裝載于陰離子交換樹(shù)脂柱中，藉由使足量的由含規(guī)定濃度的水溶性無(wú)機(jī)鹽的規(guī)定濃度的硼酸水溶液形成的第一流動(dòng)相通過(guò)所述柱來(lái)對(duì)柱進(jìn)行清洗；以規(guī)定的流速連續(xù)地向所述柱供給將所述鹽的濃度提高至高于所述第一流動(dòng)相的第二流動(dòng)相，藉由所述第二流動(dòng)相將還原糖洗脫；將來(lái)自所述柱的洗脫液連續(xù)地導(dǎo)入流路中；通過(guò)在所述流路的規(guī)定位置以規(guī)定速度連續(xù)地向所述洗脫液中添加至少1種堿性氨基酸，從而形成在所述流路中連續(xù)地流動(dòng)的混合溶液；通過(guò)使所述混合溶液用規(guī)定時(shí)間通過(guò)所述流路的規(guī)定溫度的加熱區(qū)域，從而對(duì)所述混合溶液進(jìn)行加熱；在所述流路的規(guī)定位置對(duì)加熱后的在所述流路中流動(dòng)的所述混合溶液連續(xù)地照射激發(fā)光的同時(shí)，連續(xù)地測(cè)定并記錄從所述混合溶液發(fā)射的熒光的強(qiáng)度。
2.如權(quán)利要求1所述的分離分析方法，其特征在于，所述第一流動(dòng)相的硼酸濃度為 50 150mM，所述水溶性無(wú)機(jī)鹽的濃度為10 30mM。
3.如權(quán)利要求2所述的分離分析方法，其特征在于，所述第一流動(dòng)相及第二流動(dòng)相的 硼酸濃度為75 125mM。
4.如權(quán)利要求1 3中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其特征在于，所述第一流動(dòng)相及 第二流動(dòng)相的pH為7. 5 9. 5。
5.如權(quán)利要求1 4中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其特征在于，所述水溶性無(wú)機(jī)鹽 是氯化鈉。
6.如權(quán)利要求1 5中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其特征在于，在將所述柱加熱至 70°C以下的溫度的狀態(tài)下進(jìn)行還原糖的分離。
7.如權(quán)利要求1 6中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其特征在于，所述堿性氨基酸以 在所述混合溶液中達(dá)到0. 1 2w/v%的濃度的條件添加。
8.如權(quán)利要求1 7中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其特征在于，所述堿性氨基酸選 自精氨酸、賴氨酸和組氨酸。
9.如權(quán)利要求1 8中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其特征在于，所述規(guī)定溫度的加 熱區(qū)域的溫度為140 180°C。
10.如權(quán)利要求1 9中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其特征在于，所述第二流動(dòng)相 的所述鹽的濃度至少被提高至200mM。
11.如權(quán)利要求1 10中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其特征在于，還原糖包括中性糖。
12.如權(quán)利要求1 11中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其特征在于，還原糖包含甘露糖、葡萄糖或巖藻糖。
13.如權(quán)利要求1 12中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法，其特征在于，還原糖包含甘露 糖-6-磷酸。
14.一種水溶液，其特征在于，用于在權(quán)利要求1 13中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法 中用作所述第一流動(dòng)相，含50 150mM硼酸和10 30mM氯化鈉。
15.一種水溶液，其特征在于，用于在權(quán)利要求1 13中的任一項(xiàng)所述的分離分析方法 中與所述第一流動(dòng)相混合來(lái)制備所述第二流動(dòng)相，含50 150mM硼酸和200 250mM氯化鈉。
16.一種固體組合物，其特征在于，用于溶解于水來(lái)制備權(quán)利要求14所述的水溶液，以 1 0. 1 1 0. 5的摩爾比含有硼酸和氯化鈉。
17.—種固體組合物，其特征在于，用于溶解于水來(lái)制備權(quán)利要求15所述的水溶液，以 1 1.5 1 2. 5的摩爾比含有硼酸和氯化鈉。
全文摘要
本發(fā)明提供可對(duì)甘露糖-6-磷酸進(jìn)行分析的柱后熒光檢測(cè)-硼酸配合物陰離子交換法。一種分離分析方法，它是還原糖的采用柱色譜法的分離分析方法，包括下述步驟將試樣裝載于陰離子交換樹(shù)脂柱中，藉由使足量的由含水溶性無(wú)機(jī)鹽的硼酸水溶液形成的第一流動(dòng)相通過(guò)所述柱來(lái)對(duì)柱進(jìn)行清洗，供給將所述鹽的濃度提高了的第二流動(dòng)相來(lái)將還原糖洗脫，向洗脫液中添加堿性氨基酸，加熱，連續(xù)地測(cè)定并記錄照射激發(fā)光而發(fā)射的熒光的強(qiáng)度。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101839898SQ201010144089
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者橫山哲雄 申請(qǐng)人:日本化學(xué)研究株式會(huì)社