專利名稱：一種崗梅總皂苷的提取方法及其質(zhì)量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從崗梅藥材中提取崗梅總皂苷的方法及用途，本發(fā)明還涉及一種崗梅總皂苷的質(zhì)量檢測方法。

背景技術(shù)：
崗梅為冬青科植物梅葉冬青的干燥根及莖，收載于《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(第一冊)粵D/WS-058-2003項下，主產(chǎn)于廣東、廣西等地，為嶺南習(xí)用中藥。功能主治為清熱解毒，生津止渴，利咽消腫，散瘀止痛；用于感冒發(fā)熱，肺熱咳嗽，熱病津傷口渴，咽喉腫痛，跌打瘀痛。主要含三萜皂苷、內(nèi)酯(香豆素)及少量生物堿。
大孔吸附樹脂為一種有機高聚吸附劑，具有選擇性吸附有機化合物的能力，應(yīng)用于皂苷類成分的富集純化有較好的效果，但其吸附性能及其解吸、純化條件參數(shù)因化合物的理化性質(zhì)的不同而不同。馮達(dá)星等(大孔樹脂富集純化崗梅根中總皂苷的研究，廣東藥學(xué)院學(xué)報2004年6月)采用大孔吸附樹脂LSA-20對崗梅根中的總皂苷進行了提取，純化前總固形物中崗梅根總皂苷含量為5.3％，純化后總固形物中崗梅根總皂苷含量為62.98％，精制度達(dá)11.86倍。但LSA-20樹脂對崗梅總皂苷的比吸附量與解析率不是很高，純化后總固形物中崗梅根總皂苷含量亦不算高。
現(xiàn)有技術(shù)中崗梅總皂苷的提取精制工藝是以崗梅總皂苷的含量作為指標(biāo)來考察的，對崗梅總皂苷的標(biāo)定均采用人參皂苷Re為對照品。人參皂苷Re與崗梅總皂苷顯色后的紫外-可見吸收曲線兩者基本一致，在無崗梅特征性皂苷ilexosideX X IX作為對照品的前提下，通常以人參皂苷Re為對照品標(biāo)定崗梅總皂苷。然而，一方面，以人參皂苷Re為對照品來標(biāo)定崗梅總皂苷的準(zhǔn)確度和精確度不是很高；另一方面，僅采用崗梅總皂苷的含量這一種指標(biāo)來考察崗梅總皂苷提取工藝，具有模糊性，對提取工藝的驗證有一定的影響。因此，急需采用更有說服力的指標(biāo)，對現(xiàn)有的崗梅總皂苷的提取方法作出改進。
此外，現(xiàn)有技術(shù)對提取的崗梅總皂苷的質(zhì)量檢測方法尚屬空白。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一即在于針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種崗梅總皂苷的新的提取方法，該提取方法采用新的工藝參數(shù)，以崗梅總皂苷中特征性單體皂苷ilexosideX X IX和基于ilexoside X X IX標(biāo)定的崗梅總皂苷的含量和保留率為指標(biāo)進行考察。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案 一種崗梅總皂苷的提取方法，包括以下步驟 (1)取崗梅根或莖藥材，加入4～12倍量60％乙醇提取第一次，再加2～10倍量60％乙醇提取第二次，濾過，合并濾液； (2)將步驟(1)得到的濾液減壓濃縮至無醇味，加水稀釋至上樣濃度為0.1-0.5g生藥/ml，上已預(yù)處理的AB-8大孔樹脂柱； (3)水洗樹脂柱至澄清，棄去過柱液及水洗液，然后用60％-80％乙醇洗脫； (4)收集60％-80％乙醇洗脫液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥得崗梅總皂苷。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中加入8倍量60％乙醇提取第一次，再加6倍量60％乙醇提取第二次；所述步驟(2)中上樣濃度為0.2g生藥/ml；最大上樣量以崗梅總皂苷計為119.43mg崗梅總皂苷計/g干樹脂；所述步驟(3)中用3倍柱體積80％乙醇洗脫。
采用上述提取方法提取的崗梅總皂苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱及抗病毒等作用，通過加入常規(guī)藥用輔料可制備為用于急性咽炎和抗病毒的片劑、膠囊、顆粒、滴丸、口服液、合劑等劑型，還可作為添加劑加入飲料、牙膏、漱口水、口香糖中，用于口腔保健。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種采用上述提取方法得到的崗梅總皂苷的質(zhì)量檢測方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案 一種崗梅總皂苷提取物的質(zhì)量檢測方法，包括以下步驟 (1)崗梅總皂苷的鑒別(TLC色譜鑒別) 取崗梅總皂苷提取物0.1-0.2g，加水5-15ml使溶解，用以水飽和的正丁醇提取2-3次，每次5-15ml，合并正丁醇液，加0.8％-1.2％氫氧化鈉溶液洗滌2-3次，每次15-25ml，取正丁醇液用以正丁醇飽和的水洗至中性，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液；同法制成崗梅對照藥材溶液；照《中國藥典》2005年版一部附錄VIB薄層色譜法試驗，分別吸取上述溶液各5μl點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為1∶6∶1.5∶0.7∶0.1的氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水∶甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色斑點； (2)崗梅總皂苷中ilexoside X X IX的含量測定(HPLC-ELSD) ①色譜條件 以C18柱為固定相，乙腈-0.2％甲酸為流動相，進行梯度洗脫；漂移管溫度40℃，載氣壓力2.5bar，流速1ml/min，柱溫室溫；理論塔板數(shù)以ilexosideX X IX計大于4000，對稱因子為0.95～1.05，與相鄰峰的分離度大于1.5； ②對照品溶液的制備 取ilexosideX X IX對照品5mg，精密稱定，置5ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得； ③供試品溶液的制備 取崗梅總皂苷2g，精密稱定，用70％乙醇定容至100ml，微孔濾膜濾過，即得。
分別吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，按①色譜條件測定，計算ilexoside X X IX的含量。
優(yōu)選地，所述崗梅總皂苷提取物中所含ilexoside X X IX的重量百分含量為5％-15％。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果 1、采用本發(fā)明大孔樹脂AB-8精制工藝，經(jīng)過大孔吸附樹脂純化，崗梅總皂苷和ilexosideX X IX的保留率得到了極大的提高，醇洗液中總皂苷的保留率達(dá)83.71％，ilexosideX X IX的保留率達(dá)89.46％，崗梅總皂苷和ilexoside X X IX的泄露率很低，所得提取物中總皂苷的含量可達(dá)93％，ilexoside X X IX的含量可達(dá)8％以上；； 2、本發(fā)明崗梅總皂苷的提取工藝及大孔樹脂的精制工藝中采用特征性皂苷ilexoside XX IX為對照品，ilexoside X X IX與崗梅總皂苷的紫外吸收曲線一致(見圖1)，同時以崗梅總皂苷的含量和ilexoside X X IX的含量為指標(biāo)進行定量考察，與現(xiàn)有技術(shù)中僅采用人參皂苷Re來標(biāo)定總皂苷相比，準(zhǔn)確度和精確度更高，結(jié)果更具可信度。
3、本發(fā)明提供了一種崗梅總皂苷提取物的質(zhì)量檢測方法，HPLC-ELSD對崗梅總皂苷中ilexoside X X IX的分離效果好，靈敏度高，可用于崗梅藥材及崗梅總皂苷中ilexosideX X IX的含量測定，可為崗梅總皂苷提取物的質(zhì)量控制提供參考。



圖1為崗梅ilexoside X X IX與崗梅總皂苷顯色后在400-700nm波長的紫外吸收曲線，其中圖中上面曲線為ilexoside X X IX顯色后吸收曲線；下面曲線為崗梅總皂苷顯色后吸收曲線； 圖2為不同上樣濃度對崗梅總皂苷吸附量的影響； 圖3為崗梅總皂苷的動態(tài)吸附曲線； 圖4為不同洗脫溶媒對崗梅總皂苷的洗脫率； 圖5為不同洗脫溶媒對ilexoside X X IX的洗脫率； 圖6為不同體積的洗脫溶媒對崗梅總皂苷的洗脫率； 圖7為不同體積的洗脫溶媒對ilexoside X X IX的洗脫率； 圖8為崗梅總皂苷提取液過柱前后的HPLC圖譜，其中A為上柱液的HPLC圖譜，B為洗脫液的HPLC圖譜； 圖9為崗梅總皂苷薄層色譜圖，其中A為崗梅對照藥材，B-F為崗梅總皂苷提取物。

具體實施例方式 以下結(jié)合附圖和具體實施方式
來詳細(xì)說明本發(fā)明。
實施例1 崗梅總皂苷的提取工藝 1、正交試驗設(shè)計 分別以總皂苷和ilexoside X X IX的保留率為指標(biāo)，采用四因素三水平的正交試驗設(shè)計。稱取崗梅藥材20g，按照表1的正交設(shè)計開展實驗，合并濾液，測定體積。
表1 崗梅藥材提取工藝正交實驗因素水平表
2、供試品溶液的制備 2.1 總皂苷供試品溶液的制備 精密量取各正交試驗項下的藥液適量，減壓濃縮至無醇味，加水稀釋至上樣濃度為0.2mg生藥/ml，精密量取相當(dāng)于4.00g生藥的濃縮液，上已預(yù)處理的AB-8大孔樹脂柱(13×150mm)，用40ml蒸餾水洗至澄清，再用95％乙醇洗脫，收集醇洗液至100ml量瓶刻度，搖勻，得正交供試液。精密吸取供試液適量，置試管中，水浴蒸干，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，在60℃水浴中加熱20min，取出，冷水冷卻10分鐘，加冰醋酸至5ml，搖勻，以相應(yīng)試劑作空白對照，541nm處測定吸光度，即為總皂苷的含量。
2.2 ilexoside X X IX供試品溶液的制備 取各正交試驗項下的藥液適量，微孔濾膜濾過，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算ilexoside X X IX的含量。
色譜條件SHIMADZU高效液相色譜儀，SEDEX 75蒸發(fā)光散射檢測器。N2000色譜工作站(浙江大學(xué))，確定以Phenomenex BDS C18柱(250×4.6mm)為固定相，以乙腈-0.2％甲酸為流動相，按表2梯度洗脫。漂移管溫度40℃，載氣(氮氣)壓力2.5bar，流速1ml/min，柱溫室溫28℃。在以上色譜條件下測定，記錄譜圖，理論塔板數(shù)以ilexoside X X IX計大于4000，對稱因子為0.95～1.05，與相鄰峰的分離度大于1.5。 表2 梯度洗脫程序
3、正交實驗結(jié)果和分析 3.1 正交試驗樣品總皂苷含量測定結(jié)果及分析 表3 正交實驗樣品總皂苷含量測定結(jié)果
3.2 正交試驗崗梅ilexoside X X IX含量測定結(jié)果及分析 表4 正交實驗樣品ilexoside X X IX含量測定結(jié)果

以崗梅總皂苷與ilexoside X X IX的保留率，加權(quán)計算綜合保留率。
綜合保留率＝(總皂苷保留率+ilexoside X X IX保留率)/2表5 崗梅藥材提取工藝正交實驗綜合保留率結(jié)果
表6 崗梅藥材提取工藝正交實驗綜合保留率結(jié)果統(tǒng)計(直觀分析)
表7 崗梅藥材提取工藝正交實驗綜合保留率結(jié)果統(tǒng)計(方差分析)
從表5-表7綜合保留率結(jié)果可知，乙醇濃度和提取次數(shù)對保留率影響較為顯著，乙醇濃度中水平2保留率最高，故選擇水平2(60％乙醇)。提取次數(shù)中水平1與水平2、3有顯著性差異，水平2與水平3無顯著性差異，故選擇水平2(兩次)。溶媒用量的影響較小，以水平2較大，加之提取次數(shù)選擇較少的2次，故溶媒用量選擇適中的水平2(8倍量，6倍量)。提取時間的三個水平之間略有差異，綜合考慮選擇水平2。故最佳提取工藝為8倍量60％乙醇提取1.5h，再用6倍量60％乙醇提取1h。
實施例2 崗梅總皂苷提取液的AB-8大孔吸附樹脂精制工藝 1、上樣濃度的考察 1.1 崗梅提取液的制備及提取液中崗梅總皂苷的測定 取崗梅藥材粗粉(廣州市藥材公司中藥飲品廠批號20080401)905g，加入8倍量的60％乙醇，加熱回流1.5小時，濾過，濾渣再加入6倍量的60％乙醇，加熱回流1小時，濾過，合并濾液，測定體積，得提取液11020ml，備用。測定其中總皂苷含量。
1.2 不同上樣濃度的總皂苷保留率考察(離心、靜態(tài)吸附) 量取崗梅提取液608.8ml(相當(dāng)于含50g生藥)，減壓回收乙醇，濃縮至100ml(0.5g/ml)，離心(3000r/min，10min)，得上清液80ml，加水稀釋到100ml，作為0.5g生藥/ml供試藥液。
取上述0.5g生藥/ml供試藥液20ml(相當(dāng)于含10g生藥)，水浴蒸至稠膏狀，加水稀釋至10ml，作為1.0g生藥/ml的供試藥液。
取上述0.5g生藥/ml供試藥液20ml，加水分別稀釋至200ml、100ml、50ml作為0.05g生藥/ml、0.1g生藥/ml、0.2g生藥/ml的供試藥液。
取已預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂(20ml柱體積)(13*150mm)，各5份，置具塞錐形瓶中，分別加入各個不同濃度的供試藥液，每隔10min震蕩10s，持續(xù)2h，將樹脂連同供試液倒于丁氏漏斗上，加100ml蒸餾水水洗，再用95％乙醇洗脫，收集95％乙醇洗脫液至100ml量瓶刻度。精密量取以上醇洗液各5ml，加70％乙醇稀釋至10ml，作為總皂苷測定供試液，平行兩份。測定其中總皂苷含量，計算AB-8大孔吸附樹脂對不同上樣濃度藥液中總皂苷的比吸附量。結(jié)果見表8。
表8 不同上樣濃度的總皂苷含量測定(離心、靜態(tài)吸附)

注表中皂苷含量以崗梅生藥中總皂苷百分比計。表9 不同上樣濃度的總皂苷的吸附量考察
如圖2和表8、9所示，不同生藥濃度的崗梅澄清藥液經(jīng)AB-8樹脂靜態(tài)吸附，總皂苷的比吸附量為54.48-64.90mg/g。離心工藝對崗梅藥液中總皂苷的保留率影響較大，原液經(jīng)離心后，藥液中總皂苷含量從3.701％降為2.713％，損失26.7％。提示離心工藝對崗梅藥液中總皂苷的損失較大，在精制工藝中不宜采用。
在上柱藥液濃度較高時工藝效率較高，但上柱時可能會堵柱，影響工藝連續(xù)性；濃度太低，上樣液太多，影響效率。結(jié)合不同生藥濃度崗梅澄清藥液在AB-8樹脂靜態(tài)吸附的比吸附量，綜合考慮工廠生產(chǎn)的操作可行性和生產(chǎn)效率，將上柱液濃度確定為0.2g生藥/ml。
2、崗梅藥液大孔吸附樹脂精制工藝的最大上樣量考察 量取崗梅提取液243.5ml(相當(dāng)于20g生藥)，減壓回收至無醇味，加水稀釋至100ml即得上柱液，過已預(yù)處理的AB-8大孔樹脂柱(13mm×150mm)，收集過柱液，每2.5ml為一份，按順序收集，共收集34管。
將過柱液1#至34#分別上已預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂柱(13×80mm)，水洗50ml，再用95％乙醇洗脫，收集醇洗液60ml。測定其中總皂苷和ilexoside X X IX的含量，與上柱液中含量比較，計算未吸附率，結(jié)果如下。
2.1 以總皂苷為指標(biāo)的最大上樣量測定表10 最大上樣量考察實驗中各管上柱液中皂苷濃度及未吸附率


注表中每管的體積為2.5ml，原液中皂苷濃度以7.72mg/ml計。

如圖3所示，第26管總皂苷濃度為0.45mg/ml，已超過上柱液的5％(7.72mg/ml×5％＝0.39mg/ml)。樹脂干重為4.04g，以5％即得泄漏點計，其最大上樣量為25×0.5＝12.5g生藥，相當(dāng)于3.09g生藥/g干樹脂；以總皂苷計，其最大上樣量為2.5ml×25管×7.72＝482.5mg總皂苷，相當(dāng)于119.43mg總皂苷/g干樹脂。
2.2 以ilexoside X X IX為指標(biāo)的最大上樣量測定 取10#、16#、25#、27#、34#ilexoside X X IX供試液適量，微孔濾膜濾過，測定峰面積，計算ilexoside X X IX含量。表11 最大上樣量考察中各管上柱液中ilexoside X X IX濃度及未吸附率

結(jié)果顯示，以5％作為泄漏點計，第34管時ilexoside X X IX未吸附率僅為3.91％，仍未超過上柱液的5％。說明以ilexoside X X IX作為指標(biāo)考察樹脂泄漏點有一定的缺陷，不足以全面反映總皂苷的信息，總皂苷對最大上樣量的反應(yīng)更為敏感，故最大上樣量以總皂苷結(jié)果計。
3、洗脫溶媒種類考察 按照前期實驗確定的崗梅藥液最大上樣量，取崗梅提取液152.2ml(相當(dāng)于含12.5g生藥)，減壓濃縮至無醇味，得崗梅濃縮液約30ml，加水稀釋至62.5ml，上已預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂柱(13×150mm)，用150ml蒸餾水洗至澄清，再依次以20％、40％、60％、80％、95％乙醇分別洗脫4倍柱體積，即80ml，收集醇洗液，備用。分別測定不同洗脫溶媒中總皂苷和ilexoside X X IX含量，計算總皂苷和ilexoside X X IX在不同洗脫溶媒種類中的分布，結(jié)果如下 表12 洗脫溶媒種類考察實驗中崗梅總皂苷的含量測定
注表中皂苷含量以崗梅生藥中總皂苷百分比計。
表13 崗梅總皂苷在不同洗脫溶媒種類中的分布
表14 洗脫溶媒種類考察實驗中ilexoside X X IX的含量測定
表15 ilexoside X X IX在不同洗脫溶媒種類中的分布
從表12-15，圖4-圖5可以得出，在崗梅的大孔樹脂精制工藝的洗脫溶媒種類考察中，就總皂苷而言，60％乙醇可累積洗脫下約89％的皂苷，而80％乙醇可累積洗脫下約98.5％的皂苷，接近洗脫完全；就ilexoside X X IX而言，60％乙醇可累積洗脫下幾乎100％的ilexosideX X IX，接近洗脫完全。綜合考慮工藝成本與洗脫效率，選擇80％乙醇為崗梅的大孔樹脂精制工藝的洗脫溶媒。
4、洗脫溶媒用量考察 按照以上最大上樣量實驗確定的崗梅藥液上樣量，精密量取崗梅提取液152.2ml(相當(dāng)于12.5g生藥)，減壓濃縮至無醇味，加水稀釋至62.5ml，上已預(yù)處理的AB-8大孔樹脂柱(13×150mm)，用150ml的蒸餾水水洗至澄清，用80％乙醇洗脫，每一倍柱體積(20ml)分別收集，共收集6倍柱體積，備用。分別測定其中中總皂苷和ilexoside X X IX含量，計算總皂苷和ilexoside X X IX在不同用量洗脫溶媒中的分布，結(jié)果如下 表16 洗脫溶媒用量考察實驗中崗梅總皂苷的含量測定
注表中皂苷含量以崗梅生藥中總皂苷百分比計。 表17 崗梅總皂苷在不同洗脫溶媒用量中的分布

表18 洗脫溶媒用量考察實驗中ilexoside X X IX的含量測定
注表中皂苷含量以崗梅生藥中ilexoside X X IX百分比計。
表19 ilexoside X X IX在不同洗脫溶媒用量中的分布
如表16-表19，圖6-圖7所示，就總皂苷而言，三倍柱體積的80％乙醇能洗脫下絕大多數(shù)(97％)的總皂苷，而更多洗脫溶媒僅能增加少量的總皂苷；就ilexoside X X IX而言，三倍柱體積的80％乙醇能洗脫下絕大多數(shù)(99％)的ilexoside X X IX，而更多洗脫溶媒僅能增加少量的ilexoside X X IX，綜合考慮總皂苷保留率和生產(chǎn)成本，確定洗脫溶媒用量為三倍柱體積。
實施例3 崗梅總皂苷提取液AB-8大孔樹脂精制工藝的驗證 1、崗梅提取液的制備及提取液中崗梅總皂苷和ilexoside X X IX的測定 按擬定條件，取崗梅藥材粗粉(廣州市藥材公司中藥飲品廠，批號20080401)250g，加入8倍量的60％乙醇，加熱回流1.5小時，濾過，濾渣再加入6倍量的60％乙醇，加熱回流1小時，濾過，合并濾液，測定體積，得提取液3016ml，備用。測定其中崗梅總皂苷和ilexosideX X IX的含量。
2、崗梅AB-8大孔吸附樹脂精制工藝驗證 按照實施例2確定的崗梅藥液大孔樹脂最大上樣量，取崗梅提取液1508ml，相當(dāng)于含125g生藥，減壓回收至無醇味，得崗梅濃縮液約250ml，加水稀釋至625ml，過已經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂，流速為1ml/min，收集過柱液；續(xù)用蒸餾水水洗，洗至澄清，收集水洗液1026ml；再用80％乙醇洗脫，收集三倍柱體積，即600ml，備用。分別測定上柱液、過柱液、水洗液及醇洗液中總皂苷和ilexoside X X IX含量，結(jié)果如下 表20 樹脂精制工藝驗證實驗中崗梅總皂苷的含量測定及保留率
注表中皂苷含量以崗梅生藥中總皂苷百分比計。
表21 樹脂精制工藝驗證實驗中ilexoside X X IX的含量測定及保留率
*表示與上柱液比較，表中皂苷含量以崗梅生藥中總皂苷百分比計。
上柱液和洗脫液的HPLC圖譜見圖8，圖8表明醇洗液中基本保留上柱液HPLC圖譜中特征峰所代表的成分。
3、過柱前后得膏率的變化驗證 精密量取60％乙醇提取液120.6ml(相當(dāng)于10g生藥量)兩份，從醇洗脫液中精密量取48ml(相當(dāng)于10g生藥量)兩份，減壓回收乙醇至流浸膏，分別轉(zhuǎn)移至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置烘箱105℃烘至恒重，稱重，計算得膏率。結(jié)果見表22。 表22 過柱前后固形物得率測定
采取精制工藝已確定的參數(shù)，經(jīng)過大孔吸附樹脂純化，醇洗液中總皂苷的保留率達(dá)83.71％，ilexoside X X IX的保留率達(dá)89.46％，過柱液中總皂苷泄漏了5.62％，水洗液中總皂苷泄漏了1.31％，過柱液中沒有ilexoside X X IX的泄露，水洗液中僅有0.57％的泄露。計算結(jié)果顯示過柱前崗梅提取液的固形物得率為7.76％，提取液固形物中總皂苷理論含量為1×3.826％/(1×7.76％)＝49.31％，ilexoside X X IX理論含量為1×0.455％/(1×7.76％)＝5.87％；過柱后崗梅醇洗脫液的固形物得率為3.68％，醇洗脫液固形物中總皂苷理論含量為1×3.203％/(1×3.68％)＝87.03％，固形物中ilexoside X X IX理論含量為1×0.398％/(1×3.68％)＝10.83％。
實施例4 崗梅總皂苷提取物的質(zhì)量檢測方法的方法學(xué)驗證 鑒別(TLC色譜鑒別) 取崗梅總皂苷提取物0.1g，加水10ml使溶解，用以水飽和的正丁醇提取2次，每次10ml，合并正丁醇液，加1％氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次20ml，取正丁醇液用以正丁醇飽和的水洗至中性，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。同法制成崗梅對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄VIB)試驗，分別吸取上述溶液各51點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(1∶6∶1.5∶0.7∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色斑點，見圖9。
含量測定(HPLC-ELSD) 1、對照品溶液的制備 取ilexoside X X IX對照品(ilexoside XXIX，純度為98.9％)5mg，精密稱定(4.92mg)，置5ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1ml含有ilexosideX X IX0.984mg的對照品溶液。
2、供試品溶液的制備 取崗梅總皂苷提取物約2g，精密稱重，用70％乙醇定容至100mL，即得崗梅總皂苷提取物供試品溶液。
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取上述對照品溶液1μl、2μl、4μl、10μl、25μl、30μl注入液相色譜儀，測定峰面積。以進樣量的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程為y＝1.3535x+4.7495，r＝0.9998，表明ilexoside X X IX進樣量在0.984μg～29.52μg范圍內(nèi)的自然對數(shù)值與峰面積的自然對數(shù)值成良好線性關(guān)系。
4、精密度試驗 精密吸取對照品溶液10μl，在上述色譜條件下，重復(fù)注入液相色譜儀6次，測定峰面積，計算ilexoside XXIX的含量，RSD為1.58％。
5、重復(fù)性試驗 制備崗梅總皂苷提取物供試品溶液各6份，按“3”項下操作，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，計算ilexoside XXIX的含量，RSD為1.06％。
6、穩(wěn)定性試驗 精密吸取崗梅總皂苷提取物的供試品溶液各10μl，分別在0、2、4、8、12、24、48h進樣，計算ilexoside XXIX含量，RSD為1.37％。結(jié)果表明供試品溶液在48h內(nèi)保持穩(wěn)定。
7、加樣回收率試驗 取已知含量的崗梅總皂苷提取物約0.1g，各六份，精密稱定，分別精密加入ilexosideX XIX 8mg，按“2”項下供試品溶液制備方法制備，HPLC測定ilexoside XXIX含量，計算加樣回收率。其平均回收率為100.4％，RSD為1.43％。
8、樣品的測定 取崗梅總皂苷提取物約2g，精密稱定，用70％乙醇定容至100ml，微孔濾膜濾過，注入液相色譜儀，按擬定色譜條件，測定峰面積，計算ilexoside XXIX的含量。結(jié)果見表23。
表23 崗梅總皂苷提取物中ilexoside XXIX含量測定結(jié)果(％)
HPLC-ELSD檢測方法對崗梅中ilexoside XXIX分離效果好，靈敏度高，可用于崗梅總皂苷提取物中ilexoside XXIX的含量測定。
實施例5 崗梅總皂苷及ilexoside X X IX的藥理作用 一、ilexoside X X IX的藥理作用(ilexoside錯誤！未找到引用源。對醋酸致腹腔毛細(xì)血管通透性增加試驗) 1.1 受試藥物 崗梅ilexoside X X IXilexoside錯誤！未找到引用源。，純度為98.9％。
1.2 造模及對照藥品 阿司匹林，新鄉(xiāng)中杰藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，配成0.5％的混懸液備用。
1.3 試驗儀器 Mettler toledo(AB204-N)萬分之一電子天平；Mettler toledo(CP225D)十萬分之一電子天平；Thermo(Heλios-γ)紫外分光光度儀； 1.4 實驗動物 小鼠為昆明種，SPF級動物，小鼠，雌雄各半(由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。) 1.5 實驗環(huán)境 廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗環(huán)境設(shè)施清潔級動物房。
2.實驗方法 2.1 實驗用動物及分組 小鼠，雌雄各半，分為3組，每組15只，分別為空白對照組，陽性藥阿司匹林對照組，ilexoside錯誤！未找到引用源。藥物組。
2.2 給藥時間和給藥劑量 每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7天，空白對照組給予相同體積的蒸餾水。陽性對照組給阿司匹林，各給藥組給藥劑量分別為20ml/kg。
2.3 試驗方法 末次給藥后0.5h，尾靜脈注射1％伊文思藍(lán)生理鹽水溶液0.1ml/10g，并即刻腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只，20min后，處死小鼠(掐死)，剪開腹腔，用5ml生理鹽水沖洗腹腔數(shù)次收集洗滌液，1000r/min離心5min，用紫外分光光度計于590nm波長處測吸收度，比較組間差異，進行t檢驗分析，結(jié)果見表24。
3.實驗結(jié)果表24
注給藥組、陽性對照組分別與空白對照組比較。
結(jié)論與空白對照組比較，ilexoside錯誤！未找到引用源。組具有抑制毛細(xì)血管通透性的作用，有一定的抗炎效果。
二、崗梅總皂苷的藥理作用 I.抗病毒作用 1 實驗材料 1.1 藥物名稱 崗梅總皂苷，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心提供，批號20091101。
含量每克藥粉(未添加輔料)含生藥27g 1.2 動物 NIH小鼠由廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供，小鼠飼料為廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供的富含多種營養(yǎng)成分的配方。飼養(yǎng)環(huán)境室溫為23±2℃，相對濕度為75±10％。
1.3 毒種 甲I型流感病毒FMI株，由中國藥品生物檢定所提供，經(jīng)小鼠增強毒力后，于雞胚尿囊腔傳代2次，并測定其半數(shù)致死量。
1.4 器材 YJ-875醫(yī)用凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備公司；壓力蒸汽滅菌器，上海南華醫(yī)療器械廠；超純水器，Millipore；超低溫冰箱，Sanyo日本；萬分之一電子分析天平，F(xiàn)A/JA系列，上海良平儀器儀表有限公司；乙醚，天津化學(xué)試劑有限公司； 0.9％生理鹽水，開開援生物制藥有限公司；架盤藥物天平，福州天平儀器廠； 平皿，解剖剪，眼科鑷，一次性注射器等。
2.1 稀釋病毒 實驗前，取毒種流水沖浸融化，以無菌生理鹽水稀釋成每0.05ml含15個LD50，放冰水中保存。
2.2 感染小鼠 把小鼠隨機分組，分陽性藥物組(病毒唑)、病毒對照組及試驗藥物組，雌雄各半。在乙醚輕度麻醉下，用已滴定流感病毒液滴鼻感染，每鼠4滴，約0.05ml。同時設(shè)正常小鼠對照組。
2.3 給藥 按照體表面積法計算崗梅總皂苷及陽性藥的用藥劑量，藥物分為高、中、低劑量組給藥，分別為20g/kg、10g/kg、5g/kg生藥。陽性藥物對照組用藥量為0.07g/kg。以上藥物均在病毒攻擊前一天開始給藥。共給藥5天，每天一次，灌胃0.3ml給藥。
2.4 測定肺指數(shù) 感染后四天，殺剖小鼠，殺剖前禁食禁水4小時以上。稱鼠體重，腋下動脈放血處死后取出鼠肺，記錄病變程度，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)同前，將肺放在盛有0.9％生理鹽水的平碟中洗滌二次，用吸水紙吸干表面水分，稱出肺重。按以下公式計算出肺指數(shù)與肺指數(shù)抑制率 肺指數(shù)＝(小鼠肺重/小鼠體重)×100 肺指數(shù)抑制率＝[(模型對照組平均肺指數(shù)-實驗組平均肺指數(shù))/模型對照組平均肺指數(shù)]×100 3 統(tǒng)計學(xué)處理 對所得實驗數(shù)據(jù)以SPSS12.0進行t檢驗，求統(tǒng)計學(xué)的顯著性。
4 實驗結(jié)果表25 崗梅總皂苷對流感病毒致小鼠肺炎的抑制作用結(jié)果
注與病毒對照組相比*p＜0.01， 結(jié)果表明崗梅總皂苷提取物能改善小鼠感染甲I型流感病毒的肺指數(shù)，肺指數(shù)抑制率具有量效關(guān)系，提示崗梅總皂苷提取物具有體內(nèi)抗流感病毒作用。
II.抗炎試驗 1、實驗材料 1.1 受試藥物 名稱崗梅總皂苷提取物，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心提供，批號20091101。
含量每克藥粉(未添加輔料)含生藥27g 配制方法以蒸餾水稀釋至所需濃度 給藥途徑灌服給藥 臨床劑量30g生藥/60Kg/天，即0.5g生藥/Kg/天。
1.2 造模及對照藥品 醋酸潑尼松片，由廣東華南藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，5mg/片崗梅總皂苷提取物20、10、5g生藥/kg，陽性對照組灌服醋酸潑尼松(強的松)10mg/kg，每天給藥一次，連續(xù)5天；空白對照組灌服等體積蒸餾水。于末次給藥后30min，在每鼠左足跖皮下注射1％角叉菜膠混懸液0.08ml，用自制測容積玻璃容器測量給藥后30min、1h、2h、4h、6h足跖腫脹程度，按以下公式計算腫脹率和抑制率，t檢驗，結(jié)果見表3。


3、實驗結(jié)果 表26 崗梅總皂苷提取物對角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的影響(x±s)
注給藥組、陽性對照組與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
4.結(jié)論 表26表明與空白對照組比較，崗梅總皂苷提取物20、10、5g生藥/kg均可以明顯地抑制角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹(p＜0.01～0.05)。
提示崗梅總皂苷提取物具有抗炎作用。
III、鎮(zhèn)痛試驗(熱板法、熱水縮尾法) 1.實驗材料 1.1 受試藥物 同抗炎試驗。
1.2 造模及對照藥品 消炎痛，為中山市三才醫(yī)藥集團有限公司生產(chǎn)，25mg/片 1.3 試驗儀器 同抗炎試驗。
1.2 造模及對照藥品 消炎痛，為中山市三才醫(yī)藥集團有限公司生產(chǎn)，25mg/片 1.3 試驗儀器 電熱恒溫水浴鍋，由上海醫(yī)療器械二廠生產(chǎn)。
秒表、自制藥盒(裝小鼠，一側(cè)剪成柵欄供抓著用，底部留空供甩尾用)。
2.實驗方法 2.1 將體重在20±2g的雌性小鼠置于55℃±0.5℃的金屬板上，以小鼠舔后足為疼痛反應(yīng)信號，以疼痛反應(yīng)潛伏期為痛閾指標(biāo)，給藥前測兩次(間隔5min)，以其均值作為基礎(chǔ)痛閾，選擇痛閾值在5～30秒的小鼠50只，隨機均分為5組(n＝10)。藥物組分別灌服崗梅總皂苷提取物20、10、5g生藥/kg，陽性對照組灌服消炎痛8.33mg/kg，每天給藥一次，連續(xù)3天；空白對照組灌服等體積蒸餾水。于末次給藥后1小時測痛閾值兩次(間隔5min)，取平均值，計算前后痛閾值之差，即痛閾提高值，t檢驗，見表27。
2.2 將體重在20±2g的昆明小鼠尾浸入50℃恒溫水浴3cm，記錄縮尾潛伏期為痛閾指標(biāo)，給藥前測兩次(間隔5min)，以其均值作為基礎(chǔ)痛閾，選擇痛閾值在5～30秒的小鼠50只，雌雄各半，隨機均分為5組(n＝10)。各組給藥情況同上。于末次給藥后1小時內(nèi)測痛閾值兩次(間隔5min)，取平均值。計算前后痛閾值之差，即痛閾提高值，進行t檢驗，見表28。
3.實驗結(jié)果 表27 崗梅總皂苷提取物對熱板法所致小鼠疼痛的影響(x±s)
注給藥組、陽性對照組與空白對照組比較。表28 崗梅總皂苷提取物對熱水法所致小鼠縮尾的影響(x±s)n＝10
注給藥組、陽性對照組與空白對照組比較。
4.結(jié)論 表27表明與空白對照組比較，崗梅總皂苷提取物20、10g生藥/kg可延長熱板所致小鼠舔后足反應(yīng)的潛伏期(p＜0.05)，5g生藥/kg也有一定鎮(zhèn)痛作用，但差異無顯著性意義(P＞0.05)。
表28表明與空白對照組比較，崗梅總皂苷提取物20、10g生藥/kg可延長熱水所致小鼠縮尾潛伏期(p＜0.05)，5g生藥/kg也有一定鎮(zhèn)痛作用，但差異無顯著性意義(P＞0.05)。
實驗提示崗梅總皂苷提取物有延長熱水致小鼠縮尾潛伏期和熱板致小鼠舔后足反應(yīng)的潛伏期作用，表明崗梅總皂苷有鎮(zhèn)痛作用。
IV、解熱試驗(崗梅總皂苷提取物對2，4-二硝基苯酚所致大鼠發(fā)熱的影響) 1.實驗材料 1.1 受試藥物 同抗炎試驗。
1.2 造模及對照藥品 2，4-二硝基苯酚(C.P)，由上海試劑三廠生產(chǎn) 阿司匹林，由石家莊神威藥業(yè)股份公司生產(chǎn) 1.3 試驗儀器 歐姆龍電子體溫計(精密度為0.05℃)，由日本歐姆龍株式會社生產(chǎn)。
2.實驗方法 選用體重在200±10g大鼠50只，雌雄各半，選用體溫在正常范圍內(nèi)的大鼠，隨機均分為5組(n＝10)。藥物組分別灌服崗梅總皂苷提取物20、10、5g生藥/kg，陽性對照組灌服阿司匹林0.1g/kg，空白對照組灌服等體積蒸餾水。一次給藥后隨即對大鼠背部皮下注射2％2，4-二硝基苯酚15mg/kg，于給藥后30、60、120、180、240min測其肛溫變化值，t檢驗，結(jié)果見表29。
3.實驗結(jié)果 表29 崗梅總皂苷提取物對2，4-二硝基苯酚所致大鼠發(fā)熱的影響(x±s)

4.結(jié)論 表29表明與空白對照組比較，崗梅總皂苷提取物20、10、5g生藥/kg均可以明顯地抑制2，4-二硝基苯酚所致大鼠發(fā)熱(p＜0.01～0.05)。
實驗提示崗梅總皂苷提取物有抑制2，4-二硝基苯酚致大鼠發(fā)熱作用。
以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的前提下，還可以做出若干改進和修飾，這些改進和修飾也視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種崗梅總皂苷的提取方法，其特征在于包括以下步驟
(1)取崗梅根或莖藥材，加入4～12倍量60％乙醇提取1.5-2小時，再加2～10倍量60％乙醇提取1.0-1.5小時，濾過，合并濾液；
(2)將步驟(1)得到的濾液減壓濃縮至無醇味，加水稀釋至上樣濃度為0.1-0.5g生藥/ml，上已預(yù)處理的AB-8大孔樹脂柱；
(3)水洗樹脂柱至澄清，然后用60％-80％乙醇洗脫；
(4)收集60％-80％乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥得崗梅總皂苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的崗梅總皂苷的提取方法，其特征在于所述步驟(1)中加入8倍量60％乙醇提取1.5小時，再加6倍量60％乙醇提取1小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的崗梅總皂苷的提取方法，其特征在于所述步驟(2)中上樣濃度為0.2g生藥/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的崗梅總皂苷的提取方法，其特征在于以崗梅總皂苷計，所述步驟(2)中最大上樣量為119.43mg崗梅總皂苷/g干樹脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的崗梅總皂苷的提取方法，其特征在于所述步驟(3)中用3倍柱體積80％乙醇洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的提取方法所得的崗梅總皂苷在制備抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱或抗流感病毒藥物，或在制備飲料、漱口水、牙膏或口香糖日化健康產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7.一種崗梅總皂苷提取物的質(zhì)量檢測方法，其特征在于包括以下步驟
(1)崗梅總皂苷的鑒別
取崗梅總皂苷提取物0.1-0.2g，加水5-15ml使溶解，用以水飽和的正丁醇提取2-3次，每次5-15ml，合并正丁醇液，加0.8％-1.2％氫氧化鈉溶液洗滌2-3次，每次15-25ml，取正丁醇液用以正丁醇飽和的水洗至中性，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液；同法制成崗梅對照藥材溶液；照《中國藥典》2005年版一部附錄VIB薄層色譜法試驗，分別吸取上述溶液各5μl點于同一硅膠G薄層板上，以體積比為1∶6∶1.5∶0.7∶0.1的氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水∶甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰；供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色斑點；
(2)崗梅總皂苷中ilexosideX X IX的含量測定
①色譜條件
以C18柱為固定相，乙腈-0.2％甲酸為流動相，進行梯度洗脫；漂移管溫度40℃，載氣壓力2.5bar，流速1ml/min，柱溫室溫；理論塔板數(shù)以ilexosideX X IX計大于4000，對稱因子為0.95～1.05，與相鄰峰的分離度大于1.5；
②對照品溶液的制備
取ilexosideX X IX對照品5mg，精密稱定，置5ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；
③供試品溶液的制備
取崗梅總皂苷2g，精密稱定，用70％乙醇定容至100ml，微孔濾膜濾過，即得；
分別吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，按①色譜條件測定，計算ilexosideX X IX的含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的崗梅總皂苷的質(zhì)量檢測方法，其特征在于所述崗梅總皂苷提取物中ilexosideX X IX的重量百分含量為5％-15％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種崗梅總皂苷的提取方法及其質(zhì)量檢測方法，提取方法包括步驟取崗梅根或莖藥材，加入4～12倍量60％乙醇提取1.5-2小時，再加2～10倍量60％乙醇提取1.0-1.5小時，濾過，合并濾液；減壓濃縮至無醇味，加水稀釋至上樣濃度為0.1-0.5g生藥/ml，上已預(yù)處理的AB-8大孔樹脂柱；水洗樹脂柱至澄清，然后用60％-80％乙醇洗脫；收集60％-80％乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥得崗梅總皂苷；質(zhì)量檢測方法包括TLC色譜鑒別和崗梅總皂苷中ilexosideX XIX的含量測定。采用本發(fā)明的精制工藝，崗梅總皂苷和ilexosideX XIX的保留率得到了極大的提高，所得提取物中純度更高；所得崗梅總皂苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱及抗病毒等作用；采用特征性皂苷ilexoside X XIX為對照品，準(zhǔn)確度和精確度更高，結(jié)果更具可信度；崗梅總皂苷提取物的質(zhì)量檢測方法可為崗梅總皂苷提取物的質(zhì)量控制提供參考。
文檔編號G01N30/90GK101766664SQ201010120930
公開日2010年7月7日 申請日期2010年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月4日
發(fā)明者張軍, 張曉琦, 李潤美, 湯毅, 葉文才, 賴小平 申請人:廣州中醫(yī)藥大學(xué)