金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條，具有襯板，以及在襯板上依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸收墊，其特征在于：其中，由保藏號為CGMCC?No.8764的雜交瘤細胞株5D6D9G3B4產(chǎn)生的單克隆抗體作為金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金，以及由保藏號為CGMCC?No.8763的雜交瘤細胞株5D2G2D9C1產(chǎn)生的單克隆抗體作為檢測抗體，金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金后噴涂于金標(biāo)墊上，檢測抗體噴涂于NC膜上形成檢測線。本發(fā)明對金黃色葡萄球菌的檢測特異性和靈敏性均較高。
【專利說明】金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是最常見的食源性致病菌,廣泛存在于自然環(huán)境中。金黃色葡萄球菌主要污染奶、肉、蛋、魚及其制品等動物性產(chǎn)品，包括奶制作的飲料、冷飲、糕點，熟肉、肉制品罐頭，剩飯、油煎蛋、糯米糕、涼粉、剩大米和米酒等，俗名“嗜肉菌”。金黃色葡萄球菌侵染人體后主要會引起一些人體疾患，其一是侵襲性疾病如弓I起化膿性感染，如傷口化膿、蜂窩織炎，肺炎、腦膜炎、心包炎，敗血癥等；其二是由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒素性疾病，人食用后引起頭暈、惡心、腹瀉、嘔吐等急性胃腸炎等食物中毒癥狀，而由毒素引起的休克綜合癥表現(xiàn)為高熱、低血壓、腹瀉、皮疹、休克。
[0003]目前金黃色葡萄球菌的檢測主要依賴于國標(biāo)所規(guī)定的生化鑒定，其缺點是操作繁瑣、檢測周期較長，無法適應(yīng)大量的樣品篩查。免疫學(xué)檢測是近年來出現(xiàn)的最快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的快速檢測手段，但是檢測產(chǎn)品全部依賴進口，我國目前尚無擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)，且可運用于檢測實踐的快速檢測產(chǎn)品，該專利以金黃色葡萄球菌為檢測靶標(biāo)，所要求保護的技術(shù)涉及金黃色葡萄球菌快速檢測產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問題，本發(fā)明提供一種金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條。
[0005]一種金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條，具有襯板，以及在襯板上依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸收墊，其特征在于:
[0006]其中，由保藏號為CGMCC N0.8764的雜交瘤細胞株OT6D9G3B4產(chǎn)生的單克隆抗體作為金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金，以及由保藏號為CGMCC N0.8763的雜交瘤細胞株OT2G2D9C1產(chǎn)生的單克隆抗體作為檢測抗體，金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金后噴涂于金標(biāo)墊上，檢測抗體噴涂于NC膜上形成檢測線。
[0007]另外，本發(fā)明還提供了金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條在檢測食品中的金黃色葡萄球菌中的應(yīng)用。
[0008]發(fā)明作用與效果
[0009]根據(jù)本發(fā)明的金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條，由于采用了配對單克隆抗體分別噴涂金標(biāo)墊和檢測線，實驗結(jié)果對金黃色葡萄球菌的檢測特異性和靈敏性均較聞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是本發(fā)明實施例中單克隆抗體純度測定的結(jié)果；
[0011]圖2是本發(fā)明實施例中金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條的各抗體偶聯(lián)膠體金的最佳PH的檢測結(jié)果；
[0012]圖3是本發(fā)明實施例中金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條的各抗體偶聯(lián)膠體金的最佳結(jié)合量的檢測結(jié)果；
[0013]圖4是本發(fā)明金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0014]圖5是本發(fā)明金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條的各抗體組合配對結(jié)果;
[0015]圖6是本發(fā)明金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條的靈敏度測定結(jié)果；
[0016]圖7是本發(fā)明金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條的交叉反應(yīng)結(jié)果；以及
[0017]圖8是本發(fā)明實施例中金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條的模擬帶菌實驗結(jié)果。
[0018]保藏信息
[0019]1.產(chǎn)生抗金黃色葡萄球菌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，5D2G2D9C1，于2014年01月09日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC，中國，北京市)，保藏號為中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC，中國，北京市)N0.8763。
[0020]2.抗金黃色葡萄球菌雜交瘤細胞，5D6D9G3B4，于2014年01月09日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC，中國，北京市)，保藏號為中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC，中國，北京市)N0.8764。
【具體實施方式】
[0021]本發(fā)明人的研究表明，以金黃色葡萄球菌作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，分離純化得到抗金黃色葡萄球菌單克隆抗體OT2G2D9C1和OT6D9G3B4，其抗體效價可達到1:100000，其能夠特異性、高效地與金黃色葡萄球菌結(jié)合，與單增李斯特、豬霍亂沙門、鼠傷寒沙門、腸炎沙門、福氏志賀、宋內(nèi)氏志賀、鮑氏志賀、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等均無交叉反應(yīng)。
[0022]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克隆:實驗室手冊(NewYork: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明中所使用的菌株，除提供保藏編號的兩株外，其它菌株均可以通過商業(yè)渠道獲得。
[0023]一、抗金黃色葡萄球菌單克隆抗體的制備及鑒定
[0024]1.免疫原和陽性標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備
[0025]金黃色葡萄球菌(ATCC27660)接種在腦心浸出液肉湯(BHI)平板上:胰蛋白質(zhì)胨
10.0g,氯化鈉5.0g,磷酸氫二鈉(Na2HP04.12H20) 2.5g，葡萄糖2.0g,牛心浸出液500mL,ρΗ7.4±0.2，37°C培養(yǎng)24h，挑取單菌落于BHI肉湯，37 °C、150r/min振蕩培養(yǎng)17h，計數(shù)，加入0.3%甲醛溶液室溫滅活I(lǐng)天。用生理鹽水調(diào)整金黃色葡萄球菌(ATCC27660)濃度至5X109cfu/ml作為免疫原；用生理鹽水調(diào)整濃度為108cfu/ml作為陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品，改良E.C新生霉素增菌肉湯為陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品。
[0026]2.單克隆抗體的制備過程
[0027](I)實驗動物:選3只8周齡，體重20g左右、雌性Balb/c小鼠為實驗動物。
[0028](2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每間隔2周用同樣劑量加強注射一次。
[0029](3)米血:3次加強免疫后從尾部靜脈米血，米用間接非競爭酶聯(lián)免疫法測定抗血清效價。待效價不再上升，腹腔注射同樣量免疫原，3天后按照常規(guī)方法進行細胞融合。
[0030](4)細胞融合:取免疫小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50%PEG作用下常規(guī)融合，分別接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0031](5)雜交瘤細胞篩選:采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法，篩選強陽性孔的雜交瘤細胞，將其轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板。
[0032](6)克隆培養(yǎng)及抗體制備:用有限稀釋法進行克隆化培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至鋪滿孔底1/10時，再用同樣方法檢測，將強陽性孔再克隆，如此反復(fù)3 — 4次，直至陽性率達到100%。將雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，注射于經(jīng)石蠟油預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6個雜交瘤細胞，7~10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水。
[0033]3.單克隆抗體純化及鑒定
[0034]腹水先用辛酸-硫酸銨法粗提后，再用Protein G Sepharose親和層析法純化；純化后的抗體經(jīng)倍比稀釋后用間接ELISA法測定效價，結(jié)果見表1 ;再用SDS-PAGE分析純度，5%積層膠，10%分離膠，120V電壓，電泳至膠底部，凝膠用考馬斯亮藍法染色，脫色后凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，結(jié)果如圖1所示。圖1中第I泳道是OT2G2D9C1，第二泳道是:5D6D9G3B4。
[0035]表1.單克隆抗體效價測定結(jié)果
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條，具有襯板，以及在襯板上依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸收墊，其特征在于: 其中，由保藏號為CGMCC N0.8764的雜交瘤細胞株5D6D9G3B4產(chǎn)生的單克隆抗體作為金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金，以及由保藏號為CGMCC N0.8763的雜交瘤細胞株OT2G2D9C1產(chǎn)生的單克隆抗體作為檢測抗體，所述金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金后噴涂于所述金標(biāo)墊上，所述檢測抗體噴涂于所述NC膜上形成檢測線。
2.如權(quán)利要求1所述的金黃色葡萄球菌免疫膠體金快速檢測試紙條在檢測食品中的金黃色葡萄球菌中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/577GK103954759SQ201410131610
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】劉箐, 李建武 申請人:上海理工大學(xué)