一種玉米細菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及了一種玉米細菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測試紙條，可以實現(xiàn)玉米細菌性枯萎病菌的快速檢測，適用于大量樣品的現(xiàn)場檢測、進出口糧食的快速檢測與應(yīng)急處理，屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米細菌性枯萎病(7 5.Bacterial Wilt of Cbr/?)是玉米上的一種毀滅性的病害，我國尚無該病害發(fā)生。玉米細菌性枯萎病菌(/^s)屬于腸桿菌科多源菌屬，是一種黃色、不運動、無內(nèi)生孢子、革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，可以引起玉米細菌性枯萎病。1897年首次發(fā)現(xiàn)于美國紐約長島，之后傳播到世界其他地區(qū)。目前已知發(fā)生地區(qū)有加拿大、墨西哥、巴西、秘魯、圭亞那、意大利、波蘭、羅馬尼亞、南斯拉夫、泰國、越南、馬來西亞等。玉米細菌性枯萎病菌可以通過帶菌種子遠距離傳播(種傳)，在病區(qū)則以昆蟲傳播為主，如玉米跳甲等，玉米在生長的各個階段均能被玉米細菌性枯萎病菌進行侵染。在國際貿(mào)易中，帶菌種子是該病遠距離傳播的主要因素，是傳入無病區(qū)的主要侵染源。我國目前尚未發(fā)現(xiàn)玉米細菌性枯萎病的發(fā)生，但傳入風險很高，已經(jīng)列為我國進境一類檢疫對象，只有證實未染菌的玉米產(chǎn)品才可以入境。在1992年農(nóng)業(yè)部頒布的《中華人民共和國進境植物檢疫危險性病、蟲、雜草名錄》中，被列為一類危險性有害生物。
[0003]對玉米細菌性枯萎病菌的檢測診斷方法包括野外觀察、生理生化鑒定、免疫學(xué)檢測和鑒定、以及PCR檢測技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)和生物傳感技術(shù)也被用來檢測玉米細菌性枯萎病菌。但生化檢測技術(shù)耗時過長，且檢測結(jié)果存在不可靠性。PCR檢測技術(shù)相比具有很好的靈敏性與準確性，但由于依賴于昂貴的儀器和專業(yè)的檢測人員，不適用于大量產(chǎn)品的快速檢測。ELISA檢測技術(shù)在檢測靈敏度上雖然不如PCR方法，但是具有檢測快速、批量、便宜的優(yōu)勢。而膠體金試紙條具有操作簡單、穩(wěn)定性高、不需要借助專門儀器、適合現(xiàn)場快速檢測的優(yōu)點。
[0004]由于玉米細菌性枯萎病菌會對農(nóng)業(yè)帶來巨大威脅與損失，因此快速準確的檢測方法顯得尤為重要。
【實用新型內(nèi)容】
[0005]本實用新型目的在于提供一種檢測玉米細菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測試紙條，操作簡單，快速方便，靈敏度高，穩(wěn)定性好，成本低廉。
[0006]本實用新型適用于海關(guān)、糧倉、企業(yè)、檢驗檢疫單位等，可實現(xiàn)大量糧食或種子樣本中玉米細菌性枯萎病菌的快速檢測。
[0007]本實用新型的技術(shù)方案，一種玉米細菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測試紙條，包括PVC底板，在PVC底板兩端分別設(shè)有樣品墊和吸水墊；
[0008]在PVC底板中部設(shè)置有硝酸纖維素膜檢測層，在硝酸纖維素膜檢測層與樣品墊之間設(shè)置有金標墊；所述金標墊一端與樣品墊相連接疊放，金標墊另一端疊放于硝酸纖維素膜檢測層上；
[0009]所述硝酸纖維素膜檢測層上依次設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線。
[0010]所述金標墊上包被有金標標記抗玉米細菌性枯萎病菌抗體(12B4)；
[0011]所述檢測線上包被有抗玉米細菌性枯萎病菌抗體(10B1)；
[0012]所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠IgG。
[0013]所述玉米細菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測試紙條的制備方法，步驟如下:
[0014](I)玉米細菌性枯萎病菌單克隆抗體的制備
[0015]單克隆抗體是采用玉米細菌性枯萎病菌(NCPPB 449，來自湖南省進出口檢驗檢疫局)菌體經(jīng)過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的。玉米細菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體做為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周進行首免，I X 18Cfu玉米細菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點注射；第四周進行二免，IX 18Cfu玉米細菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；第六周進行三免，I X 17 cfu玉米細菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；第七周尾部采血測效價，分別挑選對玉米細菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體效價最高的老鼠；第九周進行沖刺免疫，I X 17Cfu玉米細菌性枯萎病菌NCPPB 449菌體/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后分別眼眶采血后進行融合、篩選，共篩選到5個細胞株；
[0016](2)單克隆抗體的配對篩選
[0017]將步驟(I)中純化后的5株單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標記成功后進行夾心法配對，確定特異性免疫膠體金快速檢測試紙條所需要的抗玉米細菌性枯萎病菌抗體；其中12B4為金標抗體，1Bl為包被抗體；
[0018](3)玉米細菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測試紙條的制備:
[0019]a、空白膠體金的制備:
[0020]采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，在錐形瓶中加入200mL去離子水和2mL 1%氯金酸，攪拌加熱至沸騰，快速加入4mL 1%朽1檬酸鈉,繼續(xù)加熱15~20min,至呈亮紅色,然后室溫中冷卻，4 C冷減保存；
[0021]b、膠體金標記抗體的制備:
[0022]空白膠體金溶液用0.1M K2CO3調(diào)節(jié)pH值至7.4，攪拌中滴加適量濃度步驟(2)制備的抗體，每mL膠體金加入30 μ g抗體12B4,繼續(xù)攪拌30 min,離心,吸取上清,用金標抗體保存液(0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液)重旋；
[0023]C、金標墊的制備:
[0024]調(diào)試三維平面點膜噴金儀儀器(HM3055)，將lmg/mL標記好膠體金的抗玉米細菌性枯萎病菌抗體(12B4)均勻的噴在玻璃纖維膜上，噴液量0.6μ L/cm，37°C烘干過夜，封袋備用;
[0025]d、包被膜的制備:
[0026]調(diào)試三維平面點膜噴金儀儀器(HM3055)，將lmg/mL抗玉米細菌性枯萎病菌抗體(10B1)均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將羊抗鼠IgG抗體均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，噴液量均為0.6μ L /cm，37°C烘干過夜，封袋備用。
[0027]將PVC底板、樣品墊、金標墊、涂有檢測線與質(zhì)控線的硝酸纖維素膜檢測層、和吸水墊組合，即得產(chǎn)品玉米細菌性枯萎病菌的免疫膠體金快速檢測試紙條。
[0028]其適用于海關(guān)、糧倉、企業(yè)、檢驗檢疫單位等，可實現(xiàn)糧食或種子樣本中玉米細菌性枯萎病菌的快速檢測，最低檢測限為IX15 cfu/mL。
[0029]本實用新型試紙條的工作原理:采用膠體金免疫層析技術(shù)，選用玉米細菌性枯萎病菌特異性抗體作為固相物，利用雙抗體夾心法原理檢測樣品中是否含有玉米細菌性枯萎病菌。當待檢樣品中含有玉米細菌性枯萎病菌時，抗原先和膠體金標記的抗玉米細菌性枯萎病菌抗體(12B4)結(jié)合，由于層析作用復(fù)合物沿包被膜向前移動，當遇到檢測線上的抗玉米細菌性枯萎病菌抗體(1Bl)時，形成抗體-抗原-金標抗體復(fù)合物，在檢測線上富集，形成紅色沉淀線。
[0030]與其他檢測方法相比，免疫膠體金檢測技術(shù)具有以下優(yōu)點:1、迅速；2、靈敏度高；3、成本低廉；4、安全簡便。
[0031]本實用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
[0032]1.檢測速度快，全過程只需要5 min即可，可以試驗大批量樣品的快速檢測；
[0033]2.靈敏度高，最低檢測限為IXlO5 cfu/mL ；
[0034]3.操作簡便，無需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，易于推廣；
[0035]4.不需要儀器，適合現(xiàn)場檢測；
[0036]5.過程簡單,直接上樣檢測,樣本量少。