專利名稱：產(chǎn)前篩查afp測定試劑盒(時間分辨熒光免疫法)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于孕中期產(chǎn)前篩查的試劑盒，特別涉及一種孕中期產(chǎn) 前篩查的甲胎 蛋白測定試劑盒(時間分辨熒光免疫分析法)及其制備方法，結(jié)合了單克隆抗體制備技術(shù)、 固相抗體包被技術(shù)、鑭系元素離子標記技術(shù)、濾紙干血片制備技術(shù)和時間分辨免疫熒光技 術(shù)。
背景技術(shù)：
產(chǎn)前篩查(Prenatal Screening)是指通過經(jīng)濟、簡便和較少創(chuàng)傷的檢測方法，從 孕婦群體中篩選出懷有某些先天缺陷胎兒的高危孕婦并進行診斷，從而最大限度地減少缺 陷兒的出生。產(chǎn)前篩查可在妊娠中期(14 21周)進行，其篩查最主要的兩種疾病是唐氏 綜合征(Down’sSydrome，DS)和胎兒神經(jīng)管缺陷(Neural Tube Defects，NTDs)。產(chǎn)前篩查 系統(tǒng)由體外診斷試劑、檢測儀器和篩查分析軟件組成。甲胎蛋白(AFP)是胎兒血清中最常 見的蛋白質(zhì)，也是目前常用于產(chǎn)前篩查的血清學標志物之一。唐氏綜合征又稱為先天愚型或21三體綜合征，是胎兒先天缺陷中最常見的一種， 主要臨床表現(xiàn)嚴重智力低下、愚型面容，約50%伴有先天性心臟病、小頭畸形等發(fā)育異 常。其出生率約占活產(chǎn)新生兒的1/700 1/800，我國每年大約有26600個先天愚型癡呆兒 出生，平均每20分鐘就出生一例。目前對DS尚未有治療方法。因此通過產(chǎn)前篩查找出高 危孕婦，對其進行產(chǎn)前診斷是減少患兒出生的重要手段。當孕婦胎兒患DS時，由于胎兒生 長發(fā)育遲緩，組織器官發(fā)育不全，肝臟、胎盤的功能不良，合成AFP能力降低。胎兒神經(jīng)管缺陷也是出生缺陷最常見疾病類型之一。1977年首次報道血清中AFP 水平升高和開放性神經(jīng)管缺陷畸形有關(guān)。AFP是一個很有效的神經(jīng)管缺陷篩查指標，是其它 標志物所無法比擬的。通過檢測孕婦血清中AFP濃度，進行神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查，可以檢 出80 90%的開放性神經(jīng)管缺陷。目前臨床上主要采用羊水穿刺或絨毛膜取樣等方法來進行產(chǎn)前診斷，存在諸多不 足。不僅是創(chuàng)傷性的，而且有 2%的流產(chǎn)率。因此，對孕婦血清標志物的篩查是今后 產(chǎn)前篩查的主要手段。TrFIA又稱角軍離一±曾強鑭系焚光免疫分析(dissociation-enhancement lanthanidef luoroimmunoassay，DELFIA)，是用三價稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替 熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學發(fā)光物質(zhì)，標記抗原、抗體、激素、核酸探針等物質(zhì)；當反應(yīng)體 系發(fā)生后，用時間分辨熒光免疫分析儀，測定反應(yīng)物中的熒光強度，定量分析待測物質(zhì)的含 量。其靈敏度高，可達IO-17Hiol/孔，技術(shù)上具有獨特優(yōu)勢，應(yīng)用范圍廣泛。銪(Eu)標記時 間分辨熒光免疫技術(shù)是一種非放射標記超微量免疫檢測技術(shù)，利用光譜分辨、時間分辨、解 離-增強原理，具有熒光壽命極長、Stokes位移大、熒光特異性強、Eu3+離子的發(fā)光范圍寬的 特點。TrFIA具有敏感性高、特異性強、重復性好、定量范圍寬、檢測速度快、標記物穩(wěn)定、試 劑盒保存期長等突出優(yōu)點，成為繼放射免疫分析之后的新的里程碑。目前國外的TrFIA系統(tǒng)試劑盒已成商品化，主要用于激素類、癌抗原、蛋白質(zhì)和多肽等項目的檢查。我國從20世紀80年代中期開始這方面的研究，目前國內(nèi)也有部分試劑盒問世，但用于臨床檢測的項目 并不多，許多項目亟待研究開發(fā)，并形成產(chǎn)業(yè)化。我國幅員廣闊，各地區(qū)發(fā)展不平衡，經(jīng)濟技術(shù)滯后和對于產(chǎn)前篩查的認識不足，缺 少進行產(chǎn)前篩查的設(shè)備、儀器、試劑和專業(yè)技術(shù)人員等原因，部分地區(qū)仍無法開展DS、神經(jīng) 管缺陷等先天性疾病的產(chǎn)前篩查。現(xiàn)在濾紙干血片片已經(jīng)常規(guī)應(yīng)用于新生兒疾病篩查，通 過檢測濾紙干血片中促甲狀腺激素刺激激素(TSH)及苯丙氨酸的濃度進行新生兒甲狀腺 功能低下癥和苯丙酮尿癥的篩查。濾紙干血片技術(shù)在一定程度上解決了大面積開展篩查工 作中采血問題、血樣的遞送保存問題，大大減少了產(chǎn)前篩查的人力、物力資源，保障了實驗 的可靠性，有利于產(chǎn)前篩查在全國普及和深入開展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題即是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種檢測結(jié)果準確性、 靈敏度和穩(wěn)定性更高的，檢測方法更經(jīng)濟、簡便、安全，且無創(chuàng)傷性的，用于孕中期產(chǎn)前篩查 的甲胎蛋白測定試劑盒(時間分辨熒光免疫法)及其制備方法，該試劑盒適于產(chǎn)業(yè)化推廣 應(yīng)用。本發(fā)明要解決的另一個問題是為了使產(chǎn)前篩查在全國深入開展和普及，我們采用 了濾紙干血片技術(shù)，建立濾紙干血片中AFP的檢測方法，并應(yīng)用于產(chǎn)前篩查的研究中。為我 國開展大面積產(chǎn)前篩查工作在一定程度上解決了樣本采集、貯存與運輸問題，大大減少了 產(chǎn)前篩查的人力物力資源，實驗的可靠性也得到了保障。為產(chǎn)前篩查的普及奠定了良好的 濾紙干血片技術(shù)基礎(chǔ)，對我國的產(chǎn)前篩查產(chǎn)前事業(yè)有著重要的意義。本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)合了單克隆抗體制備技術(shù)、固相抗體包被技術(shù)、鑭系 元素離子標記技術(shù)、濾紙干血片制備技術(shù)和時間分辨免疫熒光技術(shù)，用于孕中期產(chǎn)前篩查 的甲胎蛋白測定試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括包括以下組分1)實驗緩沖液；2)濃縮洗液；3)增強液；4) AFP單克隆抗體包被的微孔反應(yīng)板；5) AFP標準品、質(zhì)控品；以及6)EU3+-N2-[P-異氰酸-芐 基]-二乙烯三胺四乙酸鈉標記的AFP單克隆抗體標記物。本發(fā)明提供的一種適用于孕早期和孕中期產(chǎn)前篩查的時間分辨熒光免疫試法試 劑盒的制備方法包括以下步驟1)制備實驗緩沖液、濃縮液、增強液；2)以AFP單克隆抗體包被微孔反應(yīng)板；3)以AFP純品配制標準品、質(zhì)控品；4)以Eu3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉標記AFP單克隆抗體；5)分裝上述實驗緩沖液、濃縮洗液、增強液、標準品和銪標記物；6)貼標簽；7)組裝為成品。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述以AFP純品配制標準品、質(zhì)控品采用以下步驟制作的基質(zhì)為人血紅細胞和陰性血清；基質(zhì)包括，但不限于人血紅細胞和陰性血 清。其中基質(zhì)的血細胞比容為45% 90% ；其中血細胞比容以50% 55%為佳。標準品為A、B、C、D、E、F 6個標準點。質(zhì)控品*Qi、Q2、Q3(低、中、高)3個濃度。外包裝為鋁箔袋。 標準品和質(zhì)控品制作是以甲胎蛋白國家標準品為參照，由人血紅細胞和陰性血清的混合基 質(zhì)將AFP純品制備成6個適當濃度的標準品和低、中、高3個適當濃度的質(zhì)控品，以適當體 積分別滴加在濾紙的A、B、C、D、E、F位置和Q1、Q2、Q3位置上，經(jīng)室溫自然干燥后得到的干血 濾紙片標準品、質(zhì)控品，用鋁箔袋真空密封。根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒，采用時間分辨熒光免疫法，實驗方法簡單快速，可自動 化操作，檢測系統(tǒng)為開放式操作系統(tǒng)，本發(fā)明的試劑盒操作方法包括以下步驟1)試劑準備將試劑所需數(shù)量的微孔反應(yīng)板條平衡至室溫；將40ml上述濃縮洗液 和960ml純化水混合成工作洗滌液；使用前，將銪標記物用實驗緩沖液按體積比1 50稀 釋成標記物工作液；2)將標準品、質(zhì)控品或樣本用直徑約3. Omm打孔器打入固相抗體包被反應(yīng)板中， 向每孔中加入100 200 μ 1上述的AFP的標記物工作液；反應(yīng)板在室溫下，緩慢振蕩孵育 1.0 4. Oh ；甩出紙片，用上述的工作洗滌液洗板6次，拍干；向每孔中加入100 200 μ 1 增強液；緩慢振蕩5min，于時間分辨熒光免疫分析儀內(nèi)進行熒光計數(shù)；按測定參數(shù)進行結(jié) 果擬合分析，得到定量結(jié)果；將結(jié)果轉(zhuǎn)入唐氏綜合征和神經(jīng)管缺陷風險評估軟件，得到孕婦 胎兒的出生缺陷的發(fā)生機率。根據(jù)本發(fā)明試劑盒，風險分析軟件采用國內(nèi)人群數(shù)據(jù)庫，更適合中國人群；本發(fā)明 的系統(tǒng)化、人性化的中文數(shù)據(jù)擬合分析軟件及配套儀器，更具有可靠性和嚴謹性。根據(jù)本發(fā)明試劑盒，適用于孕中期產(chǎn)前篩查，檢測孕婦血清中的AFP含量。AFP檢 測試劑盒靈敏度不高于1. OU/ml ；特異性檢測500ng/mlCEA和100mg/L白蛋白，hAFP表 觀值不高于1. OU/ml ；線性相關(guān)系數(shù)試劑盒的測量范圍內(nèi)，劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù) 應(yīng)不低于0. 9900 ；測量準確度以hAFP國家標準品為對照，試劑盒校準品的實測效價與標 示效價比平均值應(yīng)在0. 900 1. 100范圍內(nèi)；測量精密性分析內(nèi)不超過15. 0%;分析間不 超過20. 0% ；質(zhì)控品測定值三個不同濃度質(zhì)控，測值在允許范圍內(nèi)；HOOK效應(yīng)試劑盒的 HOOK效應(yīng)高于10000U/ml ；穩(wěn)定性37°C 3天烘烤后，檢測結(jié)果符合以上技術(shù)性能指標。AFP檢測分析儀已實現(xiàn)高度自動化，這樣提高了檢測速度，提高了檢測結(jié)果的準確 性。本發(fā)明的檢測方法可同時用于唐氏綜合癥、開放性神經(jīng)管缺陷、18三體、13三體 等出生缺陷兒的篩查。


圖1為實施例1所制備的試劑盒的劑量-反應(yīng)曲線圖。劑量反應(yīng)曲線采用雙對 數(shù)軸變換方式(L0G-L0G_B)，三樣條平滑擬合(SPLINE)曲線擬合數(shù)學模型，X軸為標準品 的標示濃度(ng/ml)，Y軸為標準品對應(yīng)的檢測反應(yīng)熒光值(其數(shù)值是實際檢測熒光值的 1/1000)。圖2為實施例4本發(fā)明試劑盒與市場上的時間分辨熒光免疫法試劑盒檢測樣 本的比較圖。Y軸為本發(fā)明試劑盒檢測孕婦血清樣本的甲胎蛋白濃度(u/ml)，X軸為比 對試劑盒檢測孕婦血清樣本的甲胎蛋白濃度(U/ml)，本發(fā)明試劑盒檢測孕婦血清樣本的 甲胎蛋白濃度與比對試劑盒檢測孕婦血清樣本的甲胎蛋白濃度的線性回歸方程為y =1.0835X-0. 8709，r = 0. 9993。
具體實施例方式
下面用實施實例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。其中，下列實施例中的AFP純品、單克隆抗體購于Sigma公司；S^hadex G-50、 PD-10為Pharmacia公司產(chǎn)品；AFP、CEA、白蛋白國家標準品購自中國藥品生物制品檢定所； β -萘甲酰三氟丙酮、三正辛基氧化磷、TritonX -100購于Sigma公司；其他試劑為國產(chǎn)分析 純；時間分辨熒光免疫分析儀(TALENT-II)、恒溫振蕩儀、全自動酶標洗板機均為廣州市豐 華生物有限公司產(chǎn)品；唐氏綜合征和神經(jīng)管缺陷風險評估軟件為珠海艾博羅公司產(chǎn)品。實施例1制備本發(fā)明的產(chǎn)前篩查甲胎蛋白測定試劑盒(時間分辨熒光免疫分析 法)孕中期產(chǎn)前篩查甲胎蛋白測定試劑盒(時間分辨熒光免疫分析法)成分包括增 強液用1 5mg/L β-萘甲酰三氟丙酮、15 30mg/L的三正辛基氧化磷和和緩沖液制成； 實驗緩沖液用10. 0ml/L 100. Oml/L的小牛血清和緩沖液制成；濃縮洗液用1. Oml/L 10. Oml/L的Tween-20和緩沖液制成。單克隆抗體包被板甲胎蛋白單克隆抗體包被板用 含有1 IOppm防腐劑的緩沖液將甲胎蛋白單克隆抗體稀釋成1 10 μ g/ml的包被液，包 被微孔空白板，并用含有1.0g/L 10. Og/L的保護劑的封閉液封閉后干燥制成。標準品、質(zhì)控品甲胎蛋白標準品、質(zhì)控品按50% 55%的血細胞比容由人血紅 細胞和陰性血清混合基質(zhì)將AFP純品制備成六個適當濃度的標準品和低、中、高三個適當 濃度的質(zhì)控品，以50 μ 1體積分別滴加在濾紙上，經(jīng)室溫自然干燥后得到。標記物甲胎蛋 白標記物用甲胎蛋白單克隆抗體與鑭系元素離子螯合物按1 1 1 6(m/m)標記制得 母液，母液再用標記物稀釋液按1 10 1 25倍稀釋而成。本發(fā)明的產(chǎn)前篩查甲胎蛋白測定試劑盒(時間分辨熒光免疫分析法)的主要工藝 制備如下1)通用試劑的制備實驗緩沖液為在含0. 01g/L的乙二胺四乙酸二鈉的50mmol/ L、ρΗ7· 8的Tris-Hcl溶液中加入10. 0ml/L 200. 0ml/L的小牛血清；濃縮洗液為在含 0. 385mol/LNaCl，0. 124mol/L、pH7. 8 的 Tris-Hcl 緩沖液中加入 1. 0ml/L 10. 0ml/L 的 Tween-20 ；增強液為在含有l(wèi)ml/LTritonX-100、0. lmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-冰醋酸溶液中 加入1 5mg/Li3 -萘甲酰三氟丙酮、15 30mg/L的三正辛基氧化磷。其中實驗緩沖液的 小牛血清為100. 0ml/L ；濃縮洗液中的Tween-20為4. 0ml/L。增強液中的β -萘甲酰三氟 丙酮 4. 0mg/L、三正辛基氧化磷 20mg/L、TritonX-100 為 lml/L ；2)單克隆抗體的制備用單克隆抗體技術(shù)，建立AFP單克隆抗體細胞庫，然后再經(jīng) 過接種小鼠腹腔制備腹水，再將腹水純化后獲得特異性為100 %、純度大于95 %的AFP配對 單克隆抗體；3)包被板的制備將純化得到的AFP單克隆抗體用緩沖稀釋成濃度為1 10μ g/ ml的包被液；在96孔的微孔空白板中加入包被液100 200 μ 1/孔，2 8°C條件下孵育 過夜；孵育好的包被板按250 μ 1/孔加入封閉液，37士2°C條件下孵育2 3h ；甩干，過夜晾 干；用鋁箔袋真空密封；置2 8°C條件下保存。其中AFP單克隆抗體采用棋盤滴定法確定包被濃度，用緩沖稀釋成濃度為10 μ g/ ml的包被液包被效果為最佳。包被抗體稀釋液為含5ppm Proclin300 ，0. 05mol/L、pH9. 6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液；封閉液為含5. Og/L海藻糖、0. 5% BSA, 0. 05mol/L、pH9. 6的碳 酸鈉_碳酸氫鈉緩沖液，單克隆抗體包被板的熱穩(wěn)定性良好；4)標準品、質(zhì)控品的制備以AFP國家標準品為參照，按50% 55%的血細胞比 容由人血紅細胞和陰性血清混合基質(zhì)將AFP純品制備成6個適當濃度的標準品和低、中、高 三個適當濃度的質(zhì)控品，以50 μ 1體積分別滴加在濾紙的A、B、C、D、E、F位置和QpQpQji 置上，經(jīng)室溫自然干燥后得到的干濾紙片標準品和質(zhì)控品，用鋁箔袋真空密封。5)銪標記物的制備將純化得到的Img AFP單克隆標記抗體；加入Img的Eu3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉中混勻，室溫反應(yīng)過夜；反應(yīng)液經(jīng) Sephadex G-50 柱(lX40cm)用 50mmol/L、pH7. 8 的 Tris-Hcl 緩沖液洗脫，分離 Eu3+-單克 隆抗體結(jié)合物與游離Eu3+，采用全自動部分收集器2ml/管進行液體收集；于時間分辨熒光 免疫分析儀上進行熒光計數(shù)，收集第一峰中熒光計數(shù)大于1000000的洗脫液，加等體積甘 油，混勻后-20°C保存；采用棋盤滴定法確定銪標記工作液濃度，用實驗緩沖液再按1 50 稀釋檢測效果最佳；6)實驗緩沖液、濃縮洗液、增強液、標準品和銪標記物分裝；7)貼標簽；以及8)成品組裝。上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出3份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定 性檢定合格才能組裝成產(chǎn)前篩查甲胎蛋白測定試劑盒(時間分辨熒光免疫分析法)。組裝 成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。實施例2本發(fā)明的試劑盒的使用方法以上實施例1制備的產(chǎn)前篩查甲胎蛋白測定試劑盒(時間分辨熒光免疫分析法) 的具體操作如下將試劑所需數(shù)量的微孔反應(yīng)板條平衡至室溫；將40ml上述濃縮洗液和960ml純化 水混合成工作洗滌液；使用前，將銪標記物用實驗緩沖液按體積比1 50稀釋成標記物工 作液。將標準品、質(zhì)控品或樣本用直徑3. Omm打孔器打入固相抗體包被板中，向每孔中 加入100 200 μ 1上述的AFP的標記物工作液；反應(yīng)板在室溫下，緩慢振蕩孵育90 240min ；甩出紙片。用上述的工作洗滌液洗板6次，拍干；向每孔中加入100 200 μ 1增強 液；緩慢振蕩5分鐘，于時間分辨熒光免疫分析儀內(nèi)進行熒光計數(shù)；按測定參數(shù)進行結(jié)果擬 合分析，得到定量結(jié)果；將結(jié)果轉(zhuǎn)入唐氏綜合征和神經(jīng)管缺陷風險評估軟件，得到孕婦胎兒 的出生缺陷的發(fā)生機率。實施例3本發(fā)明的試劑盒的分析性能評價指標以上實施例1制備的產(chǎn)前篩查甲胎蛋白測定試劑盒(時間分辨熒光免疫分析法) 的性能評價指標如下1.劑量反應(yīng)曲線和線性范圍采用LOG-LOGB軸變換模式與SPLINE擬合算法，標準品含量對數(shù)值為橫坐標，相應(yīng) 反應(yīng)孔熒光值對數(shù)值為縱坐標，繪制標準曲線。AFP試劑盒的測量范圍內(nèi)，劑量_反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0. 9900。2.靈敏度
以零標準檢測20次，計算其濃度均值(χ)和標準偏差(s)，以χ士2s為檢測低限， 則AFP檢測試劑盒靈敏度不高于1. OU/ml。3.方法特異性AFP試劑盒檢測500ng/mlCEA，hAFP表觀值不高于1. OU/ml ；檢測100mg/L白蛋白， hAFP表觀值不高于1. OU/ml。4.準確性以國家標準品為對照，AFP試劑盒標準品的實測效價與標示效價比平均值應(yīng)在 0. 900 1. 100范圍內(nèi)。5.精密性AFP試劑盒的測量精密性，批內(nèi)不超過15. 0% ；批間不超過20. 0%。6.室內(nèi)質(zhì)控三個不同濃度質(zhì)控，AFP試劑盒測值均在允許范圍內(nèi)。7. HOOK 效應(yīng)試劑盒的HOOK效應(yīng)高于10000U/ml。8.熱穩(wěn)定性(加速破壞試驗)AFP試劑盒在37°C 3天烘烤后，檢測結(jié)果符合以上性能指標。以上性能指標表明“產(chǎn)前篩查甲胎蛋白測定試劑盒(時間分辨熒光免疫分析法)” 的線性范圍寬、靈敏度高、特異性強、準確性好、精密性好和熱穩(wěn)定性好，完全符合要求。實施例4使用本發(fā)明的試劑盒與市場上的時間分辨熒光免疫法試劑盒對孕婦血 清檢測值的比較使用本發(fā)明的濾紙干血片法試劑盒與市場上的血清學法時間分辨熒光免疫法試 劑盒對比檢測24例孕母血清樣本，兩種試劑盒線性回歸方程為Y(濾紙干血片法)=1.0835X(血清 對去廠0· 8709，r = 0. 9993。將給定值帶入回歸方程計算預期偏差如表1 表1本發(fā)明的試劑盒檢測孕婦血清樣本結(jié)果的預期偏差
~給定值(U/ml)預期值(U/ml)偏差(U/ml)相對偏倚(%)
16.5117.02oTil Γθ8
23.8124.931.124.69
29.9831.611.635.44
32.9634.841.885.71
36.8639.072.215.99
43.0145.732. 726.33
49.6152.883.276.59
59.6663.774. 116.89
71.1176.185.077. 13
510551.7141.718. 18
以上結(jié)果表明，本發(fā)明的濾紙干血片法試劑盒與市場上的血清法時間分辨熒光免 疫法試劑盒檢測孕婦血清標本結(jié)果具有高度的相關(guān)性，預期偏差小。AFP最先用于NTDs篩查，檢出率為85%，一般以MSAFP > 2. 5MoM為標準，為目前 其他標志物無法取代的NTDs篩查標志物。而AFP單獨用于DS篩查的陽性檢出率約為25% 左右，一般以MSAFP < 0. 4MoM為標準，也有以MSAFP < 0. 7MoM為標準。產(chǎn)前篩查日益受到臨床重視，本發(fā)明產(chǎn)前篩查試劑盒的研制成功，為孕婦血清/全血中AFP定量分析提供了可靠的保障，必將對推動國內(nèi)產(chǎn)前篩查的開展產(chǎn)生深遠的影 響。
權(quán)利要求
一種適用于孕中期產(chǎn)前篩查的甲胎蛋白測定試劑盒(時間分辨熒光免疫法)，對孕中期的孕婦血清中的甲胎蛋白(AFP)進行定量測定。其特征包括以下組分實驗緩沖液、濃縮洗液、增強液、AFP單克隆抗體包被的微孔反應(yīng)板、AFP標準品、AFP質(zhì)控品以及Eu3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉標記的AFP單克隆抗體標記物。
2.如權(quán)利要求1所述產(chǎn)前篩查甲胎蛋白測定試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下 步驟1)制備實驗緩沖液、濃縮液、制備增強液；2)以AFP單克隆抗體包被微孔反應(yīng)板；3)以AFP純品制備標準品、質(zhì)控品；4)以Eu3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉標記AFP單克隆抗體；5)分裝上述實驗緩沖液、濃縮洗液、增強液、標準品和銪標記物；6)貼標簽；以及7)組裝為成品。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述以AFP純品制備標準品、質(zhì)控品步驟3) 采用以下方法標準品和質(zhì)控品制作的基質(zhì)為人血紅細胞和陰性血清；基質(zhì)包括，但不限 于人血紅細胞和陰性血清。其中基質(zhì)的血細胞比容為45% 90%。標準品為A、B、C、D、E、 F 6個標準點。質(zhì)控品為01為、03(低、中、高)3個濃度。外包裝為鋁箔袋。標準品和質(zhì)控 品制作是以甲胎蛋白國家標準品為參照，由人血紅細胞和陰性血清的混合基質(zhì)將AFP純品 制備成6個適當濃度的標準品和低、中、高3個適當濃度的質(zhì)控品，以適當體積分別滴加在 濾紙的A、B、C、D、E、F位置和Qp Q2, Q3位置上，經(jīng)室溫自然干燥后得到的干血濾紙片標準 品、質(zhì)控品，用鋁箔袋真空密封。
4.如權(quán)利要求1中所述的甲胎蛋白測定試劑盒，用于孕中期的孕婦血清中的甲胎蛋白 (AFP)進行定量測定，測定結(jié)果作為孕婦是否懷有各種三體綜合征(如唐氏綜合癥)和神經(jīng) 管缺陷的一個篩選指標。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適用于孕中期產(chǎn)前篩查的甲胎蛋白測定試劑盒(時間分辨熒光免疫法)及其制備方法。該試劑盒主要成分包括1)實驗緩沖液；2)濃縮洗液；3)增強液；4)反應(yīng)板；5)濾紙干血片標準品、質(zhì)控品；以及6)銪標記物。根據(jù)本發(fā)明制備該試劑盒的方法包括以下步驟1)制備實驗緩沖液、濃縮洗液、增強液；2)包被反應(yīng)板；3)制備標準品、質(zhì)控品；4)制備銪標記物；5)分裝；6)貼標簽；以及7)組裝為成品。本發(fā)明具有檢測結(jié)果準確性、靈敏度高，穩(wěn)定性好，檢測方法經(jīng)濟、簡便、安全、無創(chuàng)傷性、自動化程度高等特點。濾紙干紙片技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前篩查工作，有利于血樣采集、貯存、運輸，保障實驗可靠性。
文檔編號G01N33/577GK101819206SQ200910213630
公開日2010年9月1日 申請日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者何海榮, 馮健明, 劉勝利, 吳道貧, 季濤, 李貴情, 汪勤, 沈健, 譚玉華, 鄭元升 申請人:廣州市豐華生物工程有限公司