專利名稱：糖鏈抗原15-3化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外臨床檢驗(yàn)和化學(xué)發(fā)光免疫法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于乳腺癌 和卵巢癌相關(guān)指標(biāo)糖鏈抗原15-3檢測的反應(yīng)板及試劑盒。
背景技術(shù)：
近半個世紀(jì)以來，腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年升高，成為醫(yī)學(xué)界熱點(diǎn)中的熱點(diǎn)。20 世紀(jì)70年代，美國提出的向“腫瘤進(jìn)軍”反映了社會對腫瘤死亡率居高不下的焦慮，同時， 在過去的幾十年中，腫瘤標(biāo)志在技術(shù)上和定義上有了突破，這一切都促使了腫瘤標(biāo)志研究 的快速發(fā)展。糖鏈抗原15-3 (Carbohydrate Antigen 15-3, CA15-3)于 1984 年被發(fā)現(xiàn)，相對分 子質(zhì)量為300 500kD。其又稱為DF3、CD227和PUM。CA15-3有兩種抗體一種由鼠抗人乳 腺癌肝轉(zhuǎn)移株膜富集提取物的單克隆抗體DF3制備，另一種抗體115DB是鼠抗人乳脂球蛋 白抗體。和DF3抗體反應(yīng)的是相對分子量為3(T45kD的異質(zhì)糖蛋白分子，基因位于1號染 色體長臂。它的cDNA克隆表明DF3多肽的核心有一段60bp高度保守的串聯(lián)重復(fù)序列，重 復(fù)序列數(shù)量的差異導(dǎo)致了該抗原的多態(tài)性。DF3抗體識別位于多肽核心的20氨基酸重復(fù)序 列的抗原決定簇，即基因核心的表達(dá)產(chǎn)物，抗原決定簇的識別同樣受到糖基化的影響。在健康人群，血清CA15-3參考值上限為25kU/L。以此為標(biāo)準(zhǔn)，1050名正常人中 的5.5%、23%的原發(fā)性乳腺癌患者以及69(%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的0415-3超過了這一水 平。在其他一些惡性腫瘤中也能見到CA15-3升高，如80%的胰腺癌、71 %的肺癌、68%的乳 腺癌、64%的卵巢癌、63%的直腸癌和的肝癌；CA15-3升高還可見于一些良性疾病如 肝病(42% )和良性乳腺病(16% )，但升高比例較低。由于原發(fā)性乳腺癌CA15-3升高不顯著(23% )，因而CA15-3常用于轉(zhuǎn)移的乳腺癌 患者的治療檢測和預(yù)后判斷。1997年美國FDA批準(zhǔn)Mucinl (CA153)作為II/III期乳腺癌 復(fù)發(fā)的檢測指標(biāo)。CA15-3比原來水平升高25%預(yù)示病情進(jìn)展或惡化，并與90%進(jìn)展期、78%恢復(fù)期 相關(guān)，60%病情穩(wěn)定患者的CA153水平?jīng)]有改變。由于CA15-3對轉(zhuǎn)移性乳腺癌診斷的敏感 性和特異性均優(yōu)于CEA，因而成為診斷轉(zhuǎn)移性乳腺癌的首選指標(biāo)。上世紀(jì)70年代中期Arakawe首次報道用發(fā)光信號進(jìn)行酶免疫分析，利用發(fā)光 的化學(xué)反應(yīng)分析超微量物質(zhì)，特別是用于臨床免疫分析中檢驗(yàn)超微量活性物質(zhì)。目前， 這一技術(shù)已從實(shí)驗(yàn)室的稀有技術(shù)過渡到臨床醫(yī)學(xué)的常規(guī)檢測手段。化學(xué)發(fā)光免疫分析 (Chemiluminescencelmmunoassay, CLIA)是將化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光體系與免疫反應(yīng)相結(jié) 合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標(biāo)記免疫測定技術(shù)。其檢測原理與放射免疫(RIA) 和酶免疫(EIA)相似，不同之處是以發(fā)光物質(zhì)作為底物，并藉助其自身的發(fā)光強(qiáng)度直接進(jìn) 行測定。在化學(xué)發(fā)光免疫分析中包含兩個部分，即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。免疫反 應(yīng)系統(tǒng)，其基本原理同酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)?；瘜W(xué)發(fā)光系統(tǒng)的原理在于免疫反應(yīng)中的酶作用于發(fā)光底物。發(fā)光底物在酶的作用下，底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并釋放出大量的能量，產(chǎn)生激發(fā) 態(tài)的中間體。這種激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到穩(wěn)定的基態(tài)時，可同時發(fā)射出光子。利用發(fā)光信 號測量儀器即可測量光量子產(chǎn)額，該光量子產(chǎn)額與樣品中的待測物質(zhì)的量成正比。由此可 以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中待測物質(zhì)的含量?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析既具有放射免疫的高靈敏度，又具有酶聯(lián)免疫的操作簡便、快 速的特點(diǎn)，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作。且測試中不使用有害的試劑，試劑保持期長，應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī) 學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)診斷工作，成為非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫分析技術(shù)相結(jié)合，提供了一種簡便，快速，穩(wěn)定的檢 測CA15-3的試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種糖鏈抗原15-3化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，包括反應(yīng)板，酶結(jié)合物，發(fā)光底物， 校準(zhǔn)品，質(zhì)控品，濃縮洗滌液，所述的反應(yīng)板包被有抗糖鏈抗原15-3抗體。所述的校準(zhǔn)品以糖鏈抗原15-3純品配制，濃度為0、10、20、40、80、160、M0U/ml。所述的質(zhì)控品以糖鏈抗原15-3純品配制，由質(zhì)控品I和質(zhì)控品II兩部分組成，質(zhì) 控品I的濃度為10-40U/ml，質(zhì)控品II的濃度為50_160U/ml。所述的質(zhì)控品I的濃度優(yōu)選為20. 5U/ml，質(zhì)控品II的濃度優(yōu)選為80. 6U/ml。所述的酶結(jié)合物為HRP標(biāo)記的抗糖鏈抗原15-3抗體；所述的反應(yīng)板材質(zhì)是不透明 的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的發(fā)光底物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物，所述的濃縮洗滌液 是pH7. 0-pH8. 0的中性緩沖液。本發(fā)明可以專一的定量檢測出病人血清CA15-3的含量，判斷轉(zhuǎn)移性乳腺癌預(yù)后 和對轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療檢測，同時也能診斷轉(zhuǎn)移性乳腺癌。與傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)相比，本 發(fā)明不僅保留了 ELISA技術(shù)的高度特異性，檢測結(jié)果的穩(wěn)定性、可靠性和操作的簡便性，同 時采用的化學(xué)發(fā)光法能提高檢測的靈敏度。


圖1本發(fā)明的CA15-3定量檢測試劑盒的血清檢測結(jié)果與羅氏試劑盒檢測結(jié)果的 相關(guān)性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1 :CA15_3定量檢測試劑盒的制備其步驟主要是(1)抗CA15-3的抗體包被板制備(CA15-3檢測反應(yīng)板的制備)； ⑵酶標(biāo)抗體的制備；(3)CA15-3校準(zhǔn)品的制備；(4)CA15-3質(zhì)控品的制備；(5)化學(xué)發(fā)光底 物液的制備；(6)洗滌液制備；(7)半成品及成品組成
(1)抗CA15-3的抗體包被板制備a.包被取 lmol/L Na2HPO4 77. 4ml 和 lmol/L NaH2PO4 22. 6ml 混勻，加入去離子 水定容至IOOOml即成10倍包被液，臨用前稀釋十倍，加入適量抗CA15-3單抗(購自瑞典 康乃格)混勻，然后加入到微孔板板孔中，ΙΟΟμΙ/孔，4°C 16小時；b.封閉棄去包被液，在吸水紙紙上拍干，加入含有3% BSA和0.05%防腐劑 (Procl in 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4), 200 μ 1/ 孔，37°C 2 小時；c.封袋棄去封閉液，在吸水紙上拍干，室溫下于真空干燥箱中抽5小時，立即進(jìn) 行真空封袋，檢查有無漏氣，如有重新封袋，貼上標(biāo)簽后于2-8°C保存。(2)酶標(biāo)抗體的制備抗CA15-3單抗用過碘酸鹽氧化法與辣根過氧化物酶交聯(lián)，通過方陣滴定，確定酶 標(biāo)抗體的使用濃度。(3) CA15-3校準(zhǔn)品的制備用含有3% BSA和0. 05%防腐劑(Proclin 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)稀釋 〇八15-3(購自瑞典康乃格)，分裝0、10、20、40、80、160、24(^/1111。(4) CA15-3質(zhì)控品的制備用含有3 WBSAa^海藻糖和0.05%防腐劑(Proclin 300)的磷酸鹽緩沖液 (ρΗ7· 4)稀釋CA15-3配制質(zhì)控品I、II。濃度分別為20. 5U/ml和80. 6U/ml。(5)化學(xué)發(fā)光底物液的制備購買商品化發(fā)光底物液(購自Thermo Fisher)進(jìn)行分裝。(6) 20 X濃縮洗滌液制備取NaCl 170g吐溫-20 IOml加水定容至IL即成，臨用前稀釋20倍(7)半成品及成品組成上述步驟所得產(chǎn)品分裝后即為半成品。抽檢合格后組裝成試劑盒成品，成品還需 抽檢，合格后才能出廠。綜上，本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對本發(fā)明所用的原材料進(jìn)行了 篩選實(shí)驗(yàn)和質(zhì)量鑒定，包括標(biāo)記抗體及包被抗體的活性，載體的顏色、吸附性和變異大小， 化學(xué)發(fā)光的發(fā)光強(qiáng)度、持續(xù)時間。然后對包被方法進(jìn)行了研究，用不同的包被緩沖液和保護(hù) 液進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，選出最適合的包被緩沖液和保護(hù)液，通過抗體不同包被濃度實(shí)驗(yàn)，找到最佳 的濃度條件，同時也對真空干燥的時間和溫度也進(jìn)行了研究，最后確定了干燥時間最短，穩(wěn) 定性最好的時間。對于HRP的標(biāo)記可以有不同的方法，通過反復(fù)探索和對比實(shí)驗(yàn)最終找到 簡便，產(chǎn)率高，成本低，質(zhì)量可靠的標(biāo)記方法。實(shí)施例2 :CA15-3定量檢測試劑盒的使用方法1.試劑和樣本準(zhǔn)備(1)試劑準(zhǔn)備a.將試劑盒置室溫(18l6°C )平衡20分鐘。b.從試劑盒中取出濃縮洗滌液，用新鮮的純化水1 20稀釋后加入洗板機(jī)的洗液 瓶中。(2)樣本準(zhǔn)備使用前將待測的合格血清或血漿置室溫(18l6°C )平衡20分鐘。
2.操作步驟a.取出所需的CA15-3抗體包被微孔板置于微孔架上b.加入校準(zhǔn)品廣6、質(zhì)控品I、II和待測樣本，每孔100 μ 1，充分混勻，置37°C恒溫 箱孵育60分鐘。c.手工洗滌棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔、靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干。 或者洗板機(jī)洗滌每孔350 μ 1，重復(fù)4次，洗滌后拍干。d.加入酶結(jié)合物，每孔100 μ 1，充分混勻，置37 °C恒溫箱孵育60分鐘。e.重復(fù)步驟C。f.加發(fā)光底物A、B每孔各50μ 1，充分混勻，立刻加入化學(xué)發(fā)光儀中檢測信號值。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算可以采用作圖法或計(jì)算法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算作圖法以標(biāo)準(zhǔn)品抗原含量的Ig值為橫坐標(biāo)⑴，以其對應(yīng)的信號值為縱坐標(biāo)⑴ 繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)檢測樣本測得的信號值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的抗原含量Ig 值，在計(jì)算出抗原含量。計(jì)算法以標(biāo)準(zhǔn)品抗原含量的Ig值為自變量(X)，以其對應(yīng)的信號值為因變量 (Y)，求出回歸方程，將待測標(biāo)本的信號值帶入回歸方程，求得相應(yīng)的抗原含量。實(shí)施例3 :CA15-3定量檢測試劑盒的方法學(xué)鑒定按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及鑒定規(guī)程對實(shí)施例1中制備的試劑盒進(jìn)行檢定結(jié)果 如下1.準(zhǔn)確性將已知含量樣品用本發(fā)明實(shí)施例1中制備的試劑盒進(jìn)行檢測，計(jì)算回收率(回收 率=回收量/加入量X100% )，樣本量不低于10，結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種糖鏈抗原15-3化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，包括反應(yīng)板，酶結(jié)合物，發(fā)光底物，校 準(zhǔn)品，質(zhì)控品，濃縮洗滌液，所述的反應(yīng)板包被有抗糖鏈抗原15-3的抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的校準(zhǔn)品以糖鏈抗原15-3純品配制， 濃度為 0、10、20、40、80、160、240U/ml。
3.如權(quán)利要求1所述的定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的質(zhì)控品以糖鏈抗原15-3 純品配制，由質(zhì)控品I和質(zhì)控品II兩部分組成，質(zhì)控品I的濃度為10-40U/ml，質(zhì)控品II的 濃度為 50-160U/ml。
4.如權(quán)利要求3所述的定量檢測試劑盒，其特征在于所述的質(zhì)控品I的濃度為20.5U/ ml，質(zhì)控品II的濃度為80. 6U/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的酶結(jié)合物為HRP標(biāo)記的抗 糖鏈抗原15-3的抗體；所述的反應(yīng)板材質(zhì)是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的發(fā)光底物 為魯米諾、異魯米諾或其衍生物，所述的濃縮洗滌液是PH7. 0-pH8. 0的中性緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于糖鏈抗原15-3檢測的化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒，該試劑盒包括CA15-3檢測反應(yīng)板，反應(yīng)板包括有CA15-3抗體。CA15-3化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑盒還包括酶結(jié)合物，發(fā)光底物，校準(zhǔn)品，質(zhì)控品，濃縮洗滌液。本發(fā)明可以專一地定量檢測出病人血清CA15-3的含量，判斷轉(zhuǎn)移性乳腺癌預(yù)后和對轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療檢測，同時也能診斷轉(zhuǎn)移性乳腺癌。與傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)相比，本發(fā)明不僅保留了ELISA技術(shù)的高度特異性，檢測結(jié)果的穩(wěn)定性、可靠性和操作的簡便性，同時采用的化學(xué)發(fā)光法能提高檢測的靈敏度。
文檔編號G01N21/76GK102095720SQ200910200380
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者李胡丹, 汪寧梅, 穆宇豪, 穆海東 申請人:上海裕隆生物科技有限公司